Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

הערכה של הטיית שיפוט עכברים באמצעות משימת חפירת חוש הריח

Published: March 4, 2022 doi: 10.3791/63426
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 1
1Department of Integrative Biology, University of Guelph, 2Institute of Cell Biology and Neurosciences, National Scientific and Technical Research Council-University of Buenos Aires, 3Laboratory of Experimental Animals, Faculty of Veterinary Sciences, National University of La Plata, 4Department of Animal Biosciences, University of Guelph
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מספק תיאור מפורט של פרוטוקול הטיית שיפוט עכברים חדשני. כמו כן, מוכחות עדויות לרגישותה של משימת חפירת חוש הריח למצב רגשי, ותועלתה נדונה בתחומי מחקר מגוונים.

Abstract

הטיות שיפוט (JB) הן הבדלים באופן שבו אנשים במצבים רגשיים/רגשיים חיוביים ושליליים מפרשים מידע מעורפל. תופעה זו נצפתה זה מכבר בבני אדם, כאשר אנשים במצבים חיוביים מגיבים לעמימות 'באופן אופטימי' ואלה במצבים שליליים מראים במקום זאת 'פסימיות'. חוקרים שמטרתם להעריך השפעה על בעלי חיים ניצלו את התגובות הדיפרנציאליות הללו, ופיתחו משימות להערכת הטיית שיפוט כאינדיקטור למצב רגשי. משימות אלה הופכות פופולריות יותר ויותר במינים ובתחומי מחקר מגוונים. עם זאת, עבור עכברי מעבדה, בעלי החוליות הנפוצים ביותר במחקר ומין שהסתמך עליו במידה רבה כדי ליצור מודלים של הפרעות רגשיות, רק משימת JB אחת אומתה בהצלחה כרגישה לשינויים במצב הרגשי. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של משימת מורין JB חדשנית זו, וראיות לרגישותה להשפעה על העכבר. למרות שחידודים עדיין נחוצים, הערכה של עכבר JB פותחת את הדלת לענות הן על שאלות מעשיות הנוגעות לרווחת העכברים, והן על שאלות יסוד על ההשפעה של מצב רגשי במחקר התרגום.

Introduction

מדידת הטיית שיפוט מווסתת רגשית (להלן JB) הוכיחה את עצמה ככלי שימושי לחקר המצבים הרגשיים של בעלי חיים. גישה חדשנית זו שאולה מהפסיכולוגיה האנושית מכיוון שבני אדם חווים מצבים רגשיים חיוביים או שליליים (רגשות ומצבי רוח ארוכי טווח) מדגימים באופן אמין הבדלים באופן שבו הם מעבדים מידע 1,2,3. לדוגמה, בני אדם החווים חרדה או דיכאון עשויים לפרש הבעות פנים ניטרליות כשליליות, או משפטים ניטרליים כמאיימיםעל 4,5. סביר להניח שלהטיות אלה יש ערך אדפטיבי ולכן הן נשמרות על פני מינים 6,7. חוקרים שמטרתם להעריך השפעה על בעלי חיים ניצלו בחוכמה את התופעה הזו, תוך שהם מפעילים את האופטימיות כציפייה מוגברת לתגמול בתגובה לרמזים ניטרליים או מעורפלים, ואת הפסימיות כציפייה מוגברת להיעדר עונש או תגמול 8,9. לפיכך, בסביבה ניסיונית, תגובות אופטימיות ופסימיות לגירויים מעורפלים יכולות להתפרש כאינדיקטורים להשפעה חיובית ושלילית, בהתאמה10,11.

בהשוואה לאינדיקטורים אחרים של השפעה על בעלי חיים, למשימות JB יש פוטנציאל להיות כלים בעלי ערך רב במיוחד מכיוון שהם מסוגלים לזהות הן את הערכיות והן את העוצמה של מצבים רגשיים10,11. היכולת של משימות JB לזהות מצבים חיוביים (למשל, Rygula et al.12) שימושית במיוחד מכיוון שרוב האינדיקטורים להשפעה על בעלי חיים מוגבלים לזיהוי מצבים שליליים13. במהלך משימות JB, בעלי חיים מאומנים בדרך כלל להגיב לרמז פלה חיובי המנבא תגמול (למשל, צליל בתדר גבוה) ולרמז מפלה שלילי המנבא ענישה (למשל, צליל בתדר נמוך), לפני שהם מוצגים עם רמז מעורפל (למשל, צליל ביניים)8. אם בתגובה לרמזים מעורפלים בעל חיים מבצע 'באופן אופטימי' את התגובה המאומנת לרמז החיובי (כאילו מצפה לתגמול), הדבר מצביע על הטיית שיפוט חיובית. לחלופין, אם בעלי חיים מפגינים את התגובה המאומנת השלילית כדי להימנע מעונש, הדבר מעיד על 'פסימיות' או על הטיית שיפוט שלילית.

מאז פיתוח משימת JB המוצלחת הראשונה לבעלי חיים על ידי הרדינג ועמיתיו8, פותחו מספר משימות JB עבור מגוון רחב של מינים בתחומי מחקר מגוונים7. אבל למרות הפופולריות הגוברת שלהם, משימות JB של בעלי חיים הן לעתים קרובות עתירות עבודה. יתר על כן, אולי משום שהם שונים מבחינה מתודולוגית מהמשימות האנושיות שנתנו להם השראה, הם מניבים לעתים תוצאות ריקות או מנוגדותלאינטואיציה 14 ובדרך כלל מניבים רק גודל אפקט טיפול קטן15. כתוצאה מכך, משימות JB יכולות להיות מאתגרות לפיתוח וליישום. למעשה, עבור עכברי מעבדה, בעלי החולייתנים הנפוצים ביותר במחקר16,17 ומין שהסתמך עליו במידה רבה כדי לדגום הפרעות רגשיות18, רק משימת JB אחת אומתה בהצלחה כרגישה לשינויים במצב הרגשי19 למרות ניסיונות רבים בעשור האחרון (ראו חומר משלים של Resasco et al.19  לסיכום). מאמר זה מתאר את מטלת murine JB שאומתה לאחרונה, מפרט את התכנון הרלוונטי מבחינה ביולוגית שלה, ומדגיש את הדרכים שבהן ניתן ליישם משימה הומאנית זו כדי לבחון השערות חשובות הרלוונטיות להשפעה על העכבר. בסך הכל, ניתן ליישם את הפרוטוקול כדי לחקור את ההשפעות הרגשיות של כל משתנה עניין על JB בעכברים. זה יכלול משתני טיפול קטגוריאליים כמתואר כאן (השפעות תרופות או מחלות, תנאים סביבתיים, רקע גנטי וכו '), או קשרים עם משתנים מתמשכים (שינויים פיזיולוגיים, התנהגויות כלוב ביתיות וכו ').

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת גואלף (AUP #3700), נערכו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים, ודווחו בהתאם לדרישות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים In Vivo )20 .

1. הכנה לניסוי

  1. תכנון ניסיוני (ראו טבלה 1).
    הערה: מבחן התנהגותי זה הוא מטלת חפירה מבוססת ריח של Go/Go, שבה עכברים צריכים לחפור כדי להשיג תגמולים בעלי ערך גבוה או נמוך. הוא משתמש בזירה מלבנית (איור 1) עם שתי זרועות, שבהן זרוע אחת מתביישת ואילו השנייה אינה ניתנת לבישום. כפי שמתואר להלן, עכברים מאומנים להבחין בין רמזי ריח חיוביים ושליליים לפני שהם מוצגים עם תערובת ריחות מעורפלת.
    1. Pseudorandomly להקצות כלובים מנטה או וניל חיובי גירוי דיסקרימינטי (DS+) קבוצות כדלקמן.
      הערה: פרוטוקול זה אומת רק עבור עכברים שהוקצו לתערובת ריח וניל DS+ (ראה תוצאות מייצגות ו- Resasco et al.19 לפרטים). עם זאת, מבחני פיילוט מומלצים בחום כדי לאשר שהתערובות DS+, DS ו-DS-, ותערובות מעורפלות עומדות בדרישות להערכת JB תקפה (שלבים 4.7.3 ו-5.3). לפיכך, השיטות המתוארות כאן כוללות בדיקה הן של וניל והן של מנטה DS+, כדי לספק דוגמה לקבוצה שעונה בהצלחה על הדרישות להערכת JB (עכברי הווניל DS+ וקבוצה שאינה מצליחה לעשות זאת (עכברי מנטה DS+). בדיקות פיילוט קודמות יזהו סוג זה של בעיה מראש.
    2. עכברי מנטה DS+ : עבור עכברים אלה, במהלך הכנת הזירה לאימון (ראו שלב 1.4 להלן), מסמנים מכשירי ריח וסירים המכילים תגמול בעל ערך גבוה עם רמז ריח המנטה, ואלה שאינם מכילים תגמול עם רמז ריח הווניל.
    3. עכברי וניל DS+ : עבור עכברים אלה, במהלך הכנת הזירה לאימון (ראו שלב 1.4 להלן), מסמנים מכשירי ריח וסירים המכילים פרס בעל ערך גבוה עם רמז ריח הווניל, וכאלה שאינם מכילים תגמול עם רמז ריח המנטה.
      הערה: משימה זו מורכבת מניסויי אימון מחוזקים וניסויי מבחן לא נכפים. במהלך ניסויי בדיקה לא מאולצים, אין תגמולים נגישים לעכברים (ראו שלב 1.4.3 להלן) ורמז הריח הדו-משמעי הן עבור עכברי נענע והן עבור עכברי וניל DS+ הוא אותה תערובת נענע/וניל ביחס של 1:1.
    4. Pseudorandomly להקצות כלובים לקבוצות זרועות בניחוח שמאל או ימין (איזון נגדי בין קבוצות ריח DS+ ) כדלקמן.
    5. שמאלה: עבור עכברים אלה, במהלך הגדרת הזירה לצורך אימון ובדיקה (ראה שלב 1.4 להלן), סמן את זרוע שמאל עם רמז הריח המתאים של DS+ או DS- וודא שזרוע ימין תמיד ללא בישום (מסומנת רק במים מזוקקים).
    6. מימין: עבור עכברים אלה, במהלך הגדרת הזירה לצורך אימון ובדיקה (ראה שלב 1.4 להלן), סמנו את זרוע ימין עם רמז הריח המתאים של DS+ או DS- וודאו שזרוע שמאל תמיד ללא בישום (מסומנת רק במים מזוקקים).
    7. הקצה באופן אקראי לכל חיה "קוד עיוור" כדלקמן.
      הערה: עיוורון מאפשר לחוקר המטפל בעכברים ולניקוד התנהגותם להישאר לא מודע לתעודת הזהות או לטיפול בבעלי החיים, תוך הימנעות מהטיה סובייקטיבית בלתי רצויה. זהו צעד חובה כדי לציית להנחיות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים In Vivo ) ומסמכי ייחוס אחרים20.
    8. הוסף עמודה עבור קוד עיוור בגיליון אלקטרוני המכילה כל מזהה בעל חיים ואת הטיפול המתאים לו הוקצה.
    9. הקצה באופן אקראי לכל בעל חיים קוד ייחודי (למשל, צירוף אותיות ומספרים "A2") שאינו קשור למספר הכלוב או לטיפול בו.
      הערה: כל האקראיות צריכה להתבצע באמצעות מחולל מספרים אקראיים (לדוגמה, Random.org). במהלך שלב אקראיות זה, איזון נגדי בין טיפול, זן וכו ', במידת הצורך. האם זה נעשה על ידי עוזר מחקר שיישאר "לא מוכן" לטיפול לאורך כל הניסויים. אסור לאדם זה לאסוף נתונים במהלך הבדיקה, כדי למנוע הערכות מוטות.
    10. במהלך כל איסוף הנתונים, ספקו לחוקר ה"עיוור" שהוא חביון חי וניקוד וידאו לחפירה וחפירה של משך הזמן רק עם הקוד העיוור של החיה כדי לשמור על החוקר עיוור לטיפול.
      הערה: גיליונות אלקטרוניים המשמשים במהלך איסוף הנתונים יכללו רק את הקוד העיוור של החיה ואת ההשהיה המתאימה לחפירה וחפירה של משך כל ניסוי. בסוף הניסויים ניתן להוסיף לגיליון האלקטרוני את מזהה בעלי החיים המתאים ואת המידע הטיפולי, ובכך "לפענח" את החוקרים לניתוח נתונים.
  2. הכנת חומרים.
    1. תגמולי מזון בעלי ערך גבוה: שוברים את שבבי הבננה הממותקים המיובשים לכ-0.5 ס"מ על 0.5 ס"מ חתיכות ביד.
    2. תגמולי מזון בעלי ערך נמוך: באמצעות קרש חיתוך וסכין, חתכו את צ'או מכרסמים (מהתזונה הרגילה של בעלי החיים) לכ-0.125 ס"מ3 חתיכות.
      הערה: יש לבצע בדיקות פיילוט לזיהוי תגמולים בעלי ערך גבוה ונמוך לפני תחילת המשימה.
    3. תמציות מנטה ווניל: בעזרת מזרק 1 מ"ל או מיקרופיפט, מוסיפים תמצית מנטה ווניל לצינורות צנטריפוגה מסומנים. דילול מחלץ 1:4 עם מים מזוקקים ומערבב על ידי היפוך מספר פעמים. הכינו אותם מדי יום והפכו את ההיפוך שוב ושוב לפני השימוש כדי להבטיח שהתערובות יהיו טריות ועקביות.
    4. תערובת ריחות מעורפלת: לאחר שתמציות המנטה והווניל דוללו, הוסיפו נפחים שווים לצינור צנטריפוגה (יצירת תערובת של 1:1 של התמציות המדוללות). הכינו אותם ביום הבדיקה של תגובות לתערובת ריחות מעורפלת, והפכו שוב ושוב לפני השימוש כדי להבטיח שהתערובת טרייה ועקבית.
      הערה: בדיקות פיילוט לזיהוי דילולים מתאימים ותערובות ריח ביניים מעודדות מאוד כדי להבטיח את התועלת של בדיקות מעורפלות, שכן העוצמה עשויה להשתנות בין יצרנים, אצוות וכו '. אם מוצעים מספר רמזים מעורפלים, הקצה באופן אקראי עכברים לרמזי הבדיקה הכמעט חיוביים, נקודת האמצע, הקרובים לשליליים. ראה דיון לפרטים נוספים.
    5. רפידות כותנה: חותכים כל כרית כותנה עגולה לשש חתיכות שוות (מה שמאפשר להם להתאים לקלטות הרקמות המשמשות כמחלקי ריח).
      הערה: מספר תגמולי המזון בעלי הערך הגבוה והנמוך, רפידות הכותנה ונפחי תערובות הריחות יהיו תלויים במספר הנבדקים הנבדקים. עיין בטבלה 1 עבור מספר הניסויים לכל נושא בכל שלב ובטבלה 2 עבור החומרים הנדרשים בכל סוג ניסוי.
    6. זהה את אזור הניסוי: בצע אימונים ובדיקות על ספסל בחדר המושבה או במקום אחר. ערכו את כל הניסויים תחת אור אדום במהלך השלב החשוך כאשר העכברים פעילים.
  3. אימון מקדים (שבוע לפני הניסויים) לחפירה בכלוב הביתי.
    1. עבור כלוב שנבדק, יוצקים כמות קטנה של מצעי תירס לשני סירים חופרים (מספיק כדי לכסות את תחתית הסיר) כדי לעזור לפינוקים להישאר במרכז הסיר בעת קבורתם.
    2. בסיר אחד, הניחו חתיכות של תגמול בעל ערך גבוה על גבי שכבת קוביית התירס, כך שכל עכבר בכלוב יכול להכיל חתיכה אחת (למשל, שלוש חתיכות של שבבי בננה לכלוב של שלושה עכברים). בסיר השני, הניחו חתיכות של תגמול בעל ערך נמוך על גבי שכבת קוביית התירס, כך שלכל עכבר בכלוב תהיה חתיכה אחת (למשל, שלוש חתיכות צ'או לכלוב של שלושה עכברים).
    3. יוצקים באיטיות מצעי קוביות תירס על הפינוקים בכל סיר, מכסים אותם וממלאים את הסירים לגובה של 3 ס"מ.
    4. יש להניח בו-זמנית סיר אחד בעל ערך גבוה וסיר אחד בעל ערך נמוך בכל כלוב למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, מוציאים את הסירים מכל הכלובים.
    5. השליכו את כל קוביית התירס והפינוקים שנותרו בסיר. נגבו את כל הסירים ביסודיות עם 70% אתנול כדי למנוע מריחות של בעלי חיים וכלובים להשפיע על ניסויים עתידיים.
    6. חזור על שלבים 1.3.1-1.3.5 פעם ביום במשך 5 ימים רצופים.
      הערה: המטרה של שלב זה היא לאפשר לכל חברי הכלוב את ההזדמנות לחפור ולאכול חטיף לפני תחילת האימון הפורמלי. זה גם מקל על ההרגלה לתגמולי מזון.
  4. ארנה שהוקמה לאימונים ובדיקות.
    1. הניחו את הזירה על שולחן עבודה תחת אור אדום. נגבו היטב את כל מרכיבי הזירה, את סירי החפירה ואת מכשירי הריח עם 70% אתנול כדי להסיר אבק וריחות כלשהם מניסויים קודמים.
    2. מכינים את הסירים החופרים כדלקמן.
    3. הכניסו את תגמולי המזון המתאימים ל"תא הבלתי נגיש" (ראו איור 1).
      הערה: התגמולים הכלולים בתא זה תלויים בשאלה אילו פינוקים (אם בכלל) קבורים בניסוי נתון (ראו טבלה 2). לכן, כל סיר יכיל תמיד חתיכה אחת של צ'יפס בננה וחתיכת צ'או אחת על פני שני התאים.
      1. סירי ריח DS+: במהלך ניסויים מחוזקים, מניחים חתיכת צ'או אחת בתא הלא נגיש וקוברים חתיכה אחת של שבב בננה באזור הנגיש של הסיר.
      2. סירי ריח DS: במהלך ניסויים מחוזקים, הניחו חתיכת צ'או אחת וחתיכה אחת של צ'יפס בננה בתא הבלתי נגיש. לא יהיו תגמולי מזון זמינים באזור הנגיש של הסיר.
      3. סירים ללא בישום: במהלך ניסויים מחוזקים, מניחים חתיכה אחת של צ'יפס בננה בתא הלא נגיש וקוברים חתיכת צ'או אחת באזור הנגיש של הסיר.
      4. במהלך כל ניסויי הבדיקה הלא מאולצים (חיוביים, שליליים ומעורפלים), הניחו חתיכה אחת של צ'או וחתיכה אחת של שבב בננה בתא הבלתי נגיש. לא יהיו תגמולי מזון זמינים באזור הנגיש של הסיר.
        הערה: צעד זה נועד למנוע מריח הפינוקים הקבורים לחשוף איזה סיר מתוגמל. ככזה, המחסום בין שני התאים מחורר כדי להקל על העברת ריחות.
    4. יוצקים כמות קטנה של מצעי קוביית תירס לכל סיר כדי לשמור על תגמולי מזון מרוכזים בעת קבורתם. מניחים חתיכה אחת מתגמול המזון המתאים (ראו טבלה 2) על גבי שכבת קוביית התירס ושופכים באיטיות מצעי קוביות תירס על הפינוקים, מכסים אותם וממלאים את הסירים עד לגובה של 3 ס"מ.
    5. באמצעות מזרק 1 מ"ל או מיקרופיפט, יש לשאוב 0.1 מ"ל מתערובת הריחות המתאימה (כלומר, תערובות מנטה, וניל או תערובות מעורפלות) או מים מזוקקים (ראו טבלה 2) ולהזריק אותם ישירות על גבי קוביית התירס בתנועה מעגלית.
    6. מכינים מכשירי ריח.
      1. מניחים חתיכת כרית כותנה אחת בבסיס קלטת הרקמות. באמצעות מזרק 1 מ"ל או מיקרופיפט, יש להכין 0.1 מ"ל מתערובת הריחות המתאימה (כלומר, מנטה, וניל או תערובות מעורפלות) או מים מזוקקים (ראו טבלה 2) ולהזריק אותם על פיסת הכותנה. מכסים את קלטת הרקמות במכסה שלה כדי להקיף את הכותנה הריחנית ויוצרים מתקן ריחות.
    7. מניחים את סירי החפירה בקצות הזרועות ומפעילי הריח בתחילת כל זרוע. הכנס את ה"דלת" הנשלפת מיד לפני חריצי הקלטת כדי לחסום את הכניסה לזרועות הזירה וליצור את תא הזינוק (ראו איור 1).
      הערה: סירי חפירה, מתקני ריח ומזרקים חייבים להיות מסומנים בבירור ולהשתמש בהם רק לריח אחד במהלך הניסויים כדי למנוע ערבוב לא מכוון של רמזי ריח (כלומר, להשתמש במערך שונה של חומרים עבור תערובות נענע, וניל, ללא בישום ומעורפל לאורך כל הדרך).

2. אימון חפירה: 5 ימים, שני ניסויים חיוביים ביום (טבלה 2)

  1. עכברים מהירים במשך שעה אחת לפני האימון בכלוב הביתי שלהם על ידי הוצאת מזון מההופר.
  2. הגדר את הזירה לניסוי חיובי מחוזק על ידי ביצוע הוראות הגדרת הזירה לעיל (שלב 1.4).
  3. ביום הראשון של אימוני החפירה, הניחו את תגמולי המזון על גבי מצעי התירס בקוטר 3 ס"מ במקום לקבור אותם.
  4. קבורים בהדרגה את התגמולים עמוק יותר מתחת לקורת התירס במשך 4 הימים הבאים, עד שהם ממוקמים בתחתית מצעי 3 ס"מ עד יום 5 (כלומר, יום 1: על גבי קלח תירס, יום 2: קבורים על ידי שכבה דקה מאוד של קלח תירס, יום 3: קבורים באמצע הדרך לתחתית הסיר, יום 4: נקברו שלושה רבעים מהדרך לתחתית הסיר, ויום 5: קבור בתחתית הסיר).
  5. העבירו עכברים מהכלוב הביתי שלהם לכלוב תחבורה ריק. הניחו כרטיס רמז עם הקוד העיוור של החיה על גבי כלוב ההובלה, כך שהחוקר שערך את הניסויים יישאר עיוור לתעודת הזהות והטיפול בבעלי החיים. נשאו עכברים לאזור הניסוי.
    הערה: שלבים 2.1 ו-2.5 צריכים להסתיים על ידי עוזר מחקר המכיר את העכברים. הצעדים הבאים במהלך הניסויים ייערכו על ידי חוקר עיוור לתעודת זהות של בעלי חיים (וטיפול, אם רלוונטי). טפלו תמיד בעכברים באמצעות טיפול בכוסות (יד פתוחה) או טיפול במנהרה (עם נייר או מנהרת פלסטיק) כדי למנוע את ההשפעות ההרתעות של טיפול מסורתי בזנב21.
  6. העבירו עכברים מכלוב ההובלה לתא הזינוק של הזירה. הסר את "דלת" ההתחלה, הנמיך מיד את מכסה הפרספקס מעל הזירה, והתחל את טיימר הניסיון בן 5 הדקות.
    הערה: אם נבדקים מספר עכברים מאותו כלוב, יש לעשות זאת בו-זמנית. עם זאת, מספר בעלי החיים הנבדקים בו זמנית יהיה תלוי במספר המשקיפים העיוורים הזמינים; באופן אידיאלי, חוקר יתבונן ויטפל בבעל חיים אחד בכל פעם, אך אדם אחד יכול לצפות ולטפל בשתי חיות בו זמנית, במידת הצורך.
  7. חביון ניקוד חי לחפירה והשהיה כדי לאכול את הפרס בשתי הידיים.
    1. רישום השהיה לחפירה כזמן שבו נצפתה ההתרחשות הראשונה של חפירה. חפירה מתוארת כעכבר שדוחף או מתמרן באופן פעיל מצעי קורן עם הפנסים הקדמיים ו/או הלוע.
    2. רשמו חביון אכילה כזמן שבו נצפתה ההתרחשות הראשונה של אכילה. אכילה מתוארת כעכבר הצורך פרס תוך שהוא אוחז בו במחיצת ויושב על חרטום.
  8. כאשר המשפט מסתיים, הרימו את מכסה הפרספקס והזיזו את העכבר בחזרה לכלוב ההובלה שלו.
  9. השליכו את כל מצעי קוביות התירס והפינוקים שנותרו בסירים. פתח קלטות רקמות והשלך חתיכות כותנה. נגבו את כל מרכיבי הזירה וסירי החפירה והריחו את הדיספנסרים ביסודיות עם 70% אתנול.
  10. הגדירו את הזירה לניסוי חיובי שני (שלב 1.4). חזור על שלבים 2.6-2.9 לניסוי חיובי מחוזק.
  11. החזירו את כלוב ההובלה לעוזרת המחקר כדי שניתן יהיה להחזיר את העכברים לכלוב הביתי שלהם.
  12. חזור על שלבים 2.1-2.11 במשך 5 ימים רצופים.

3. אימוני אפליה : 10 ימים, ארבעה ניסויים ביום

  1. הגדרת הזירה לניסוי חיובי או שלילי (ראה טבלה 2) בהתאם להוראות בשלב 1.4.
  2. ערכו שני ניסויים חיוביים ושני ניסויים שליליים ביום לאחר הסדר המתואר בטבלה 2 (כלומר, ניסויים חיוביים ושליליים לסירוגין בימים 1-5 וסדר פסאודו-דוראנדום בימים 6-10).
  3. בצע את ההוראות בשלב 2.1 בתחילת כל יום אימון, ולאחר מכן בצע את השלבים 2.5-2.10. חזרו על הפעולה עד שהעכברים עברו ארבעה ניסויים בסך הכל.
  4. החזירו את כלוב ההובלה לעוזרת המחקר כדי שניתן יהיה להחזיר את העכברים לכלוב הביתי שלהם.
  5. חזור על שלבים 3.1-3.4 פעם ביום במשך 10 ימים בסך הכל (כלומר, שני שבועות עבודה רצופים של 5 ימים, המופרדים על ידי סוף שבוע של יומיים).

4. בדיקה

הערה: משך הבדיקה הוא 3-5 ימים (בהתאם לזמן שלוקח לכל עכבר לעמוד בקריטריוני הלמידה), חמישה ניסויים ביום עבור המפגשים שבהם נערכים ניסויי בדיקה חיוביים ושליליים, ושלושה ניסויים ביום כאשר נערכת הבדיקה הדו-משמעית.

  1. עכברים מהירים במשך שעה אחת לפני אימון /בדיקה בכלוב הביתי שלהם על ידי הוצאת מזון מההופר.
  2. בצע ניסוי חיובי אחד וניסוי שלילי אחד בסדר אקראי (ראה טבלה 1) על ידי ביצוע הוראות הגדרת זירה בשלב 1.4 וחיזוק הוראות הניסוי בשלבים 2.5-2.10.
  3. בצע ניסוי בדיקה אחד שהוקלט בווידאו ללא אכיפה.
    הערה: הניסויים שלא נאכפו זהים לניסויים מחוזקים, למעט המיקום שבו ממוקמים התגמולים. לכן, בניסוי הלא מאולץ, חתיכה אחת מכל תגמול בעל ערך גבוה ונמוך מונחת בתא הבלתי נגיש הן עבור הסירים הריחניים והן עבור הסירים הלא מתביישים.
    1. ערוך ניסוי בדיקה חיובי או שלילי אחד עבור כל עכבר מדי יום עד לעמידה בקריטריוני הלמידה (מקסימום 4 ימים; קריטריוני הלמידה מתוארים בשלב 4.7.3). ודא שניסויי בדיקה חיוביים ושליליים נערכים בסדר משתנה על פני ימים (למשל, יום 1: בדיקה חיובית, יום 2: בדיקה שלילית, יום 3: בדיקה חיובית וכו ').
    2. עקוב אחר הוראות הגדרת הזירה בשלב 1.4.
    3. העבירו עכברים מכלוב ההובלה לתא הזינוק של הזירה. הגדר מצלמת וידאו על חצובה כך ששני הסירים בקצות הזרועות יהיו גלויים, והתחל להקליט. ודא שכרטיס הרמז עם הקוד העיוור של החיה וסוג הניסוי (בדיקה חיובית או בדיקה שלילית) מוקלט בסרטון (לעיון במהלך ניקוד הווידאו).
    4. הסר את "דלת" ההתחלה, הורד מיד את מכסה הפרספקס מעל הזירה, והתחל את טיימר הניסיון בן 2 הדקות.
    5. כאשר המשפט מסתיים, הפסק את ההקלטה, הזז את המצלמה הצידה, הרם את מכסה הפרספקס, הזיז את העכבר בחזרה לכלוב ההובלה שלו.
    6. השליכו את כל מצעי קוביות התירס והפינוקים שנותרו בסירים. פתח קלטות רקמות והשלך חתיכות כותנה. נגבו היטב את כל מרכיבי הזירה, את סירי החפירה ואת מכשירי הריח עם 70% אתנול.
  4. בצע ניסוי חיובי אחד וניסוי שלילי אחד בסדר אקראי (ראה טבלה 1) על ידי ביצוע הוראות הגדרת זירה בשלב 1.4 וחיזוק הוראות הניסוי בשלבים 2.5-2.10.
  5. החזירו את כלוב ההובלה לעוזרת המחקר כדי שניתן יהיה להחזיר את העכברים לכלוב הביתי שלהם.
  6. לאחר שכל העכברים סיימו את חמשת הניסויים היומיים שלהם, העבירו סרטונים מכרטיס זיכרון מצלמה למחשב לניקוד וידאו.
  7. ציון סרטוני ניסוי חיוביים ושליליים ביום הבדיקה כדי להעריך אם עכברים עמדו בקריטריונים ללמידה. הקפידו על ניקוד וידאו באותו יום מכיוון שבעלי חיים שעומדים בקריטריונים ללמידה יעברו בדיקות מעורפלות למחרת.
    1. באמצעות תוכנת הקלטת אירועים או שעון עצר, בקשו מהחוקר העיוור לטיפול לתעד את ההשהיה של כל עכבר כדי לחפור ולחפור את משך הזמן בכל סיר במהלך הדקה הראשונה של ניסויי הבדיקה החיובית והשלילית.
    2. רישום השהיה לחפירה כזמן שבו נצפתה ההתרחשות הראשונה של חפירה. חפירה מתוארת כעכבר שדוחף או מתמרן באופן פעיל מצעי קורן עם הפנסים הקדמיים ו/או הלוע. רשום את משך החפירה כזמן הכולל שעכבר מבלה בחפירה.
    3. השווה את משך החפירה בזרוע הריחנית בין ניסויים חיוביים (DS+) ושליליים (DS-) עבור כל עכבר כדי לקבוע אם בעלי חיים יכולים להבחין במשימה. קחו בחשבון את קריטריון הלמידה שיש לעמוד בו אם משך החפירה בזרוע המבושמת DS+ הוא לפחות כפול מזה של הזרוע בניחוח DS במהלך הדקה הראשונה של הבדיקה (עם משך חפירה מינימלי של DS+ של 3 שניות).
  8. חזור על שלבים 4.1-4.7 מדי יום עד שהעכברים עמדו בקריטריון הלמידה.
    1. להוציא אנשים שלא עמדו בקריטריון עד יום 4 ממשפטים מעורפלים (ולכן, הערכת הטיית שיפוט).
  9. עבור עכברים שעמדו בקריטריונים של למידה, בדקו את התגובות לתערובת הריחות הדו-משמעית.
    1. עכברים מהירים במשך שעה אחת לפני אימון /בדיקה בכלוב הביתי שלהם על ידי הוצאת מזון מההופר.
    2. בצע ניסוי אחד חיובי ואחד שלילי מחוזק בסדר אקראי על ידי ביצוע הוראות הגדרת זירה בשלבים 1.4 והוראות ניסוי מחוזקות בשלבים 2.5-2.10.
    3. בצע ניסוי בדיקה אחד לא מאולץ שהוקלט בווידאו כמתואר בשלב 4.3 באמצעות תערובת הריחות הדו-משמעית (ראה טבלה 2).
  10. ציון סרטוני משפט מעורפלים להערכת הטיית שיפוט.
    1. באמצעות תוכנת הקלטת אירועים או שעון עצר, בקשו מחוקר העיוור לזהות בעלי חיים ולתעד את ההשהיה של כל עכבר לחפור (ראו שלב 4.7.2) בכל סיר במהלך הדקה והשנייה הראשונה של ניסויי הבדיקה.

5. ניתוח נתונים

הערה: הניתוחים המדויקים הנדרשים יהיו תלויים בפרטי התכנון הניסיוני. סקירה כללית מתוארת כאן, אך מומלץ מאוד לחוקרים להתייחס ל- Gygax22 בעת תכנון ניתוחים עבור ניסויי JB בבעלי חיים, ולגאסקיל וגארנר23 בעת בחירת גודל המדגם (מכיוון שהניתוחים הנדרשים הם לעתים קרובות מורכבים מדי עבור ניתוחי כוח א-פריוריים ).

  1. "שחרר" את החוקר על ידי הוספת תעודת הזהות והטיפול המתאימים של בעלי החיים ומידע הטיפול (למשל, דיור מועשר או קונבנציונלי; תרופה או פלצבו וכו ') עבור כל קוד עיוור לגיליון האלקטרוני. ודא שהגיליון האלקטרוני שנוצר כולל שלוש שורות עבור כל בעל חיים שעמד בקריטריוני הלמידה (כלומר, עבור ניסויי הבדיקה החיוביים, השליליים והמעורפלים) המצביעים על עיכובים לחפור בזרוע הריחנית.
  2. הפעל מודל מעורב ליניארי כללי של מדידות חוזרות ונשנות, תוך שימוש בתוכנה סטטיסטית מועדפת. כאן, משתנה התוצאה יהיה השהיה לחפירה. ודא שהמודל כולל טיפול (או משתנה מתמשך של עניין), סוג ניסוי ואינטראקציה מסוג ניסוי של טיפול x כהשפעות קבועות. כלול את מזהה העכבר (מקונן בתוך הטיפול) כאפקט אקראי. תנאים נוספים הכלולים במודל יהיו תלויים בתכנון הניסויי המיושם.
    הערה: אם עכברים שוכנים בקבוצות (כפי שמתאים למין חברתי זה24) ובני זוג בכלוב נבדקים, אזי כלוב המקונן במסגרת הטיפול (אם קיים) חייב להיכלל במודל כאפקט אקראי (וזיהוי העכבר חייב להיות מקונן לאחר מכן בתוך הכלוב).
  3. שרטט את אמצעי ההשהיה הפחות מרובעים בכל סוג ניסוי כדי לאשר שהרמז הדו-משמעי שהוצג התפרש כבינוני (כלומר, אומדן ההשהיה הפחות-ריבועי פירושו שהאומדן עבור הניסוי הדו-משמעי צריך ליפול בנקודת אמצע בין ההשהיה החיובית לשלילית). הערך את העכבר JB רק אם דרישה זו מתקיימת.
  4. הערך את ההשפעה הפשוטה של הטיפול (או המשתנה הרציף של העניין) על ההשהיה כדי לחפור בניסוי הדו-משמעי על-ידי חקירת האינטראקציה מסוג ניסוי של Treatment x כדי לקבוע אם עכברים מציגים JB בעל אפנון השפעה.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה של מנגנון ניסויי. מנגנון JB כולל זירה מלבנית עם שתי זרועות. כל זרוע מכילה מתקן ריח הממוקם בהתחלה וסיר חפירה המוצב בקצה. נדפס מחדש מתוך Resasco et al.19 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שלב: תכנון ניסיוני
כל תגמול בעל ערך גבוה צ'יפס בננה
תגמול בעל ערך נמוך מכרסם צ'או
DS+ מנטה או וניל (איזון נגדי)
DS- מנטה או וניל (איזון נגדי)
אימוני חפירה חפירת לוח זמנים לאימונים 5 ימים: 2 ניסיונות קופה ליום
חפירת משך המשפט 5 דק'
הכשרה בנושא אפליה לוח זמנים להכשרה בנושא אפליה 10 ימים: 4 ניסויים ליום
צו משפט חפירה ימים 1-5: 4 ניסיונות ליום
משפט 1: פוזה
משפט 2: נג
משפט 3: פוזה
משפט 4: נג
ימים 6-10: 4 ניסיונות ליום*
משך משפט האפליה 5 דק'
בדיקות לוח זמנים לבדיקות 3-5 ימים (תלוי בזמן כדי לעמוד בקריטריונים ללמידה)
5 ניסויים ליום
סדר שלב הבדיקה משפטים 1 ו-2: פוזה או נג**
ניסוי 3: ניסוי מבחן
משפטים 4 ו-5: פוזה או נג**
משך הבדיקה 2 דק'
* הניסויים היו פסאודו-רנדומיים כך שלעכברים תמיד היו שני ניסויי פוזה ושני ניסויי נג ביום
** הניסויים היו פסאודו-רנדומיים, כך שלעכברים תמיד היה ניסוי פוזה אחד ונג אחד לפני ואחרי ניסוי הבדיקה

טבלה 1: סיכום תכנון הניסויים ולוח הזמנים לאימונים ולבדיקות. מספר וסדר הניסויים ביום לשלבי אימוני חפירה, הדרכת אפליה ובדיקות בנוסף לפרטי תכנון הניסויים. נדפס מחדש מתוך Resasco et al.19 באישור Elsevier.

פרטי המשפט
שלב סוג ניסיון זרוע ריחנית זרוע ללא בישום
רמז לריח פרס קבור תגמול לא נגיש רמז לריח פרס קבור תגמול לא נגיש
הכשרה לחפירה ואפליה אימון קופה DS+ בננה צ'או מים צ'או בננה
אימוני נג DS- אין פרס בננה + צ'או מים צ'או בננה
בדיקות מבחן קופה DS+ אין פרס בננה + צ'או מים אין פרס בננה + צ'או
מבחן נג DS- אין פרס בננה + צ'או מים אין פרס בננה + צ'או
מבחן מעורפל מנטה/
תערובת וניל		 אין פרס בננה + צ'או מים אין פרס בננה + צ'או
קריטריון הלמידה עכברים חייבים לחפור פי שניים יותר זמן בסיר DS+ (מבחן Pos) מאשר בסיר DS - pot (מבחן Neg), ולחפור במשך 3 שניות לפחות

טבלה 2. סיכום פרטי המשפט. רמזי ריח ותגמולים המוצגים בכל סוג ניסוי במהלך אימוני חפירה, אימון אפליה ובדיקות שלבים. DS(+): גירוי מפלה חיובי, DS(-): גירוי מפלה שלילי, Pos: חיובי, Neg: שלילי. נדפס מחדש מתוך Resasco et al.19 באישור Elsevier. ראה טבלה משלימה S2 במאמר המקורי עבור הטבלה המורחבת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות שהוצגו כאן משקפות ממצאים רלוונטיים מניסוי 1 של Resasco et al.19. הנבדקים בניסוי זה היו 18 נקבות C57BL/6NCrl ('C57') ו-18 עכברי Balb/cAnNCrl ('Balb') ('Balb').. בעלי חיים הגיעו למתקן בגיל 3-4 שבועות והוקצו באופן אקראי לטיפולי דיור מועשרים לסביבה או קונבנציונליים (EH או CH, בהתאמה) ברביעיות זן מעורב25. כל כלוב הכיל C57 אחד ו-Balb אחד, בנוסף לשני עכברי DBA/2NCrl ששימשו בניסוי אחר. כאן, השימוש בעכברים נקבות איפשר דיור קבוצתי של מין חברתי זה עם העשרה סביבתית, תוך הימנעות מתוקפנות מוגברת ושמירה על משאבים שיכולים להתרחש בעכברים זכרים26 (אם כי שימו לב שהמשימה יושמה גם בעכברים עירומים זכרים לא מועשרים19). עכברי CH הוחזקו בכלובי פוליאתילן פתוחים ושקופים (27 ליטר x 16 ואט x 12H ס"מ; n = 9) עם מצעי קלח תירס, שני סוגים של חומר קינון (רצועות נייר מצומקות ושקעי כותנה; איור 2A), ו'מחסה' של נייר. כלובי EH היו מפלסטיק אטום, בגודל 60 ליטר x 60 ואט x 30H ס"מ3 עם חלון פרספקס אדום אחד לתצפיות (n = 9; איור 2B,C). תנאים אלה ידועים כמשפרים את הרווחה: מכילים העשרות מגוונות (כפי שתוארו קודם לכן על ידי Nip et al.27) שלעכברים יש מוטיבציה לגשתל-28, ואשר מפחיתות התנהגויות המעידות על רווחה לקויה (למשל, התנהגות סטריאוטיפית, תוקפנות וחוסר פעילות דמוית דיכאון 27,28,29 ). כל כלוב EH כלל גם כלוב 'נספח' מחובר (זהה לכלובי CH אך מכיל רק מצעים), שעכברים יכלו לגשת אליו באופן חופשי דרך מנהרה (איור 2C). כלובי נספחים אפשרו קלות של לכידה וטיפול בעכברי EH שאומנו להיכנס לחיבור זה לתגמולי מזון כאשר מלאה בדגני שיבולת שועל מתוקים רעדה. ברגע שעכבר נכנס לכלוב האגף, ניתן היה לחסום את מנהרת הגישה ולהסיר בקלות עכברים מכלובים באמצעות טיפול בכוס או במנהרה21. גישה זו נמנעה אפוא מ"מרדף" מלחיץ דרך סביבות מועשרות מורכבות30. מזון ומים היו זמינים ad libitum וחדר המושבה נשמר בשעה 21 ± 1 מעלות צלזיוס ו-35%-55% לחות יחסית, במחזור אור הפוך של 12:12 שעות (אורות כבויים בשעה 06:00 ודולקים בשעה 18:00). עכברים שוכנו באופן דיפרנציאלי במשך 5 שבועות לפני תחילת אימוני החפירה במנגנון (ראו ציר זמן באיור 2D).

עכברים עברו הכשרה ובדיקה במשימת JB כפי שתואר בפרוטוקול לעיל. ההשהיה לחפירה בזרוע הריחנית במהלך 2 הדקות הראשונות והמלאות של ניסויי בדיקה חיוביים, שליליים ומעורפלים שימשה לבדיקת השפעות דיור על JB. כאן, הנתונים נותחו באמצעות מודלים מעורבים ליניאריים כלליים, תוך יישום טרנספורמציות במידת הצורך כדי לעמוד בהנחות של נורמליות והומוגניות. ראה Resasco et al.19 לתיאור מפורט של ניתוחים (למשל, בחירת מודלים). בקצרה, מודלי המדידות החוזרים ונשנים כללו תמיד את סוג הניסוי, דיור, זן, סוג ניסוי x דיור, ריח DS+, זן מסוג ניסוי x, סוג ניסוי x DS+ ריח, סוג ניסוי x דיור x DS+ ריח, כלוב (אפקט אקראי המקונן בדיור וריח DS+), ומזהה עכבר (אפקט אקראי המקונן בכלוב, דיור, DS+ ריח וזן). ההשפעות הפשוטות של דיור על השהיה נקבעו מתוך סוג הניסוי x דיור בעת חישוב הריבועים הפחותים פירושו31. שים לב, ערכי p דו-זנב מדווחים לאורך כל הדרך כדי להדגים חקירה של השפעות הטיפול, אך עבודת האימות המקורית של Resasco et al.19 השתמשה בערכי p חד-זנב כאשר הדבר מתאים32 מכיוון שנדרשה תגובה ספציפית אחת כדי לאמת את המשימה (ראה Resasco et al.19 לדיון באימות).

לפני שניתן להעריך הטיית שיפוט בכל משימה של בעלי חיים, חיוני לעמוד בשני קריטריונים טכניים: ראשית, בעלי חיים חייבים להבחין בהצלחה בין רמזים חיוביים ושליליים (כלומר, לעמוד בקריטריונים של למידה). עבור בעלי חיים העומדים בקריטריון זה, יש להוכיח כי הרמז הדו-משמעי מתפרש כבינוני. אם אחד מאלה אינו מתקיים, אז לא ניתן להסיק מסקנות לגבי הטיית שיפוט ומצבים רגשיים תואמים. בניסוי זה, כל העכברים מלבד ארבעה עכברי C57 עמדו בקריטריונים של למידה, ו-C57 אחד הוסר לפני הבדיקה לאיתור תקיעת כלוב (n = 31). גם ב-2 הדקות הראשונות וגם ב-2 הדקות המלאות של הבדיקה, סוג הניסוי x DS+ Odor היה משמעותי (דקה אחת: F2,62 = 5.67, p = 0.006; 2 דקות: F2,62 = 5.74, p = 0.005), וחשף כי עכברי Mint DS+ פירשו באופן בלתי צפוי את תערובות הריחות הדו-משמעיות כחיוביות (כאילו 100% מנטה), בעוד שעכברי וניל DS+ טיפלו באותן תערובות ריח מעורפלות כבינוניות (איור 3A, B). ממצא זה הצביע על כך שרק עכברי וניל DS+ עמדו בדרישה הטכנית של טיפול בתערובת הריח כמתווך בין DS+ ל-DS-, ולכן עכברי מנטה DS+ לא נכללו בניתוחי JB הבאים.

עבור עכברי וניל DS+, ההשפעות הפשוטות של דיור חושבו מתוך מונח דיור מסוג X של ניסוי31. בתוך קבוצה זו, דיור השפיע על חפירת חריגות כאשר בעלי חיים CH היו איטיים יותר מ- EH כדי לחפור בניסויים מעורפלים, אך לא בניסויים חיוביים או שליליים. זה היה נכון לאחר דקה אחת (דו-משמעית: t = 2.27, d.f. = 92.94, p = 0.014, d של כהן = 1.148; חיובי: t = 0.22, d.f. = 92.94, p = 0.414, d של כהן = 0.110; שלילי: t = 0.80, d.f. = 92.94, p = 0.214, d.214, d של כהן = 0.404; ראה איור 4A) ואחרי 2 דקות מלאות (דו-משמעיות: t = 2.14, d.f. = 91.89, p = 0.018, d של כהן = 1.083; חיובי: t = 0.39, d.f. = 91.89, p = 0.348, d של כהן = 0.198; שלילי: t = 0.61, d.f. = 91.89, p = 0.273, d של כהן = 0.308; ראה איור 4B), אף על פי שסוג הניסוי x דיור x ריח DS+ (דקה אחת: F3,65.37 = 0.36, p = 0.7835; 2 דקות: F3,65.37 = 0.49, p = 0.688) וסוג ניסיון x דיור (1 דקות: F2,62 = 1.66, p = 0.198; 2 דקות: F2,62 = 1.41, p = 0.252) לא היווה דין וחשבון על שונות משמעותית. פרשנויות פסימיות אלה של רמזים מעורפלים על ידי עכברי CH משקפות הטיות שיפוט שליליות המעידות על השפעה שלילית.

Figure 2
איור 2: טיפולי דיור וציר זמן של ניסויים. (ב) מבט תקורה על EH. (C) מבט קדמי על EH עם כלוב 'נספח' מחובר כדי להקל על לכידת/טיפול בעכבר. (ד) ציר זמן ניסיוני וסיכום של ניסויי אימון ובדיקה חיוביים, שליליים ומעורפלים. DS(+): גירוי מפלה חיובי, DS(-): גירוי מפלה שלילי, AMB: תערובת מעורפלת (50% וניל-50% נענע), B: צ'יפס בננה, C: דיאטת מכרסמים ('chow'), X: ללא תגמולי מזון. נדפס מחדש מתוך Resasco et al.19 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: קביעה אם עכברים עומדים בדרישות להערכת JB. חפירת חביון לפחות ריבועית פירושה (±שגיאה סטנדרטית) במהלך ניסויי בדיקה חיוביים, שליליים ומעורפלים. (A) חביון חפירה של דקה אחת בעכברים המקבלים מנטה (M, n = 15) או וניל (V, n = 16) כגירוי ההבחנה החיובי (DS+) (נתונים שתיבת קוקס השתנתה). (B) חביון חפירה של 2 דקות באותם נושאים (נתונים שעברו טרנספורמציה לוגריתמית). במהלך שתי תקופות הזמן, עכברי וניל DS+ עמדו בדרישה הטכנית של פירוש רמזים מעורפלים כבינוניים. עכברי מנטה DS+ לא הצליחו לעשות זאת (במקום זאת פירשו את הרמז הדו-משמעי כחיובי) וכתוצאה מכך בוטלו מניתוחי JB הבאים. נדפס מחדש מתוך Resasco et al.19 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ההשפעה של טיפול בדיור על JB מווסת השפעה. חפירת השהיה לפחות מרובעת פירושה (±שגיאה סטנדרטית) במהלך ניסויי בדיקה חיוביים, שליליים ומעורפלים. (A) חביון חפירה של דקה אחת בעכברי וניל DS+ מבית קונבנציונלי (CH, n = 7) או מועשר (EH, n = 9) (נתונים Box Cox טרנספורמציה). (B) חביון חפירה של 2 דקות באותם נושאים (נתונים שעברו טרנספורמציה לוגריתמית). במהלך שתי תקופות הזמן, בעלי חיים של CH הדגימו חריגות ארוכות יותר באופן משמעותי לחפירה במהלך ניסויים מעורפלים מאשר EH conspecifics, מה שמעיד על JB שלילי. נדפס מחדש מתוך Resasco et al.19 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול החפירה מבוסס הריח והתוצאות המתוארות כאן מדגימים את יכולתה של משימת JB חדשנית זו לזהות שינויים במצב הרגשי של העכבר. לפיכך, המשימה מהווה כלי רב ערך לתחומי מחקר מגוונים. בדומה לכל משימת JB, כדי להעריך את ההשפעה על בעלי חיים חשוב שבעלי חיים ילמדו תחילה להבחין בין רמזים (שלב 4.7.3) ושהגירוי הדו-משמעי יתפרש כבינוני (שלב 5.3). למרות שהם פשוטים, עמידה בדרישות אלה יכולה להיות מאתגרת, במיוחד בעכברי מעבדה שעבורם יותר מ-15 ניסיונות קודמים לפתח וליישם משימת JB של עכבר נכשלו19. כאן, רכיבים מרובים מילאו תפקיד חיוני בעמידה בקריטריונים טכניים אלה ותרמו להצלחת המשימה ולתועלתה.

ראשית, התכנון האתולוגי של המשימה קידם למידת אפליה מוצלחת, שכן הן הרמזים המפלים והן התגובות הנדרשות היו רלוונטיים מבחינה ביולוגית: לעכברים יש יכולות חוש הריח המרשימות, מה שהופך אותם לבעלי יכולת ללמידה מהירה ולטווחי זיכרון ניכרים כאשר הם מוצגים עם גירויי ריח33, והם מונעים באופן טבעי לבצע חפירה לצורך חקירה כללית, הזדקנות ובניית מחילות24, 34. יתר על כן, איזון נגדי של ריחות DS+ חשף הבדלים בדרכים שבהן עכברי וניל DS+ ומנטה DS+ פירשו את התערובת הדו-משמעית, ואישרו כי הרמז הדו-משמעי התפרש כבינוני עבור עכברי וניל DS+, אך לא עבור עכברי מנטה DS+. לכן מומלץ להשתמש רק בווניל כ-DS+ לכל עבודה עתידית תוך שימוש במותגי התמציות ובזני העכברים המשמשים כאן. חשוב לציין שלמרות שאיזון נגדי הניב תוצאות מוצלחות בניסוי הנוכחי, אנו קוראים לחוקרים לערוך בדיקות פיילוט כדי לזהות תערובות מעורפלות מתאימות אם מיישמים שינויים, שכן איזון נגדי יכול לפעמים להוסיף רעש ניכר לנתונים, ולהגדיל את הסיכון למיסוך השפעות טיפול35.

גם כאשר מתקיימים קריטריונים חיוניים אלה, לא תמיד קל לזהות את JB, אולי בשל גדלי אפקט הטיפול הקטנים שניסויים אלה מניבים בדרך כלל15. לפיכך, כדי להבטיח רגישות למשימה, נעשה שימוש בעיצוב Go/Go ייחודי מכיוון שגישה זו הוכחה כרגישה יותר לשינויים בהשפעה על בעלי חיים מאשר עיצובי Go/No-Go במינים אחרים15. עם זאת, השימוש בזרוע ללא בישום המכילה תגמול בעל ערך נמוך בכל הניסויים מבדיל משימה זו מניסיונות כושלים קודמים לאמת משימת Go/Go JB עבור עכברים 36,37,38. כאן, במהלך ניסויים חיוביים עכברים בוחרים בין תגמול בעל ערך גבוה בזרוע DS+ לבין תגמול בעל ערך נמוך בזרוע ללא בישום; ובניסויים שליליים, הם בוחרים בין היעדר תגמול בזרוע ה-DS לבין תגמול בעל ערך נמוך בזרוע ללא בישום. למרות שזה דורש מעכברים ללמוד משימה מורכבת יותר (כלומר, הבחנה בין רמזים המנבאים ערכים שונים של תגמול, ולא רק נוכחות תגמול או היעדרות), נראה כי אפשרות עקבית, שבה תמיד היה קיים תגמול בעל ערך נמוך, עשויה להפוך את האימון והבדיקות לפחות מלחיצים עבור עכברים ואת הלמידה המשופרת (כאשר 86% מהעכברים עומדים בקריטריונים ללמידה). בעוד שלעתים קרובות מניחים שעכברים מאתגרים להתאמן או שאינם מסוגלים ללמוד משימות קשות18, התוצאות כאן מצביעות על כך שאין לזלזל ביכולות שלהם, וכי תכנון מטלות אתולוגיות בלחץ נמוך עשויות להיות גישה יעילה יותר לזיהוי שינויים בהשפעה מאשר משימות פשוטות יותר או כאלה עם השלכות קשות יותר (למשל, כרוכות בענישה כמו פחזניות אוויר או אור לבן במקום פשוט לתגמלהיעדרות 39, 40,41).

לבסוף, כדי להפחית עוד יותר את גורמי הלחץ שעלולים להפריע להשפעות הטיפול ולהציג שונות לא רצויה, יושמו שיטות טיפול הומאניות21. כאן, עכברים טופלו רק באמצעות שיטות או מנהרה לאורך כל חייהם (כולל אל כלובי הובלה וממנה וממנגנון JB) כדי למנוע את ההשפעות המרתיעות של טיפול בזנב מסורתי21. בנוסף לכך, בעלי חיים של EH אומנו להיכנס מרצונם לכלוב נספחים לטיפול, ובכך להימנע מ'מרדף' מלחיץ דרך סביבות מורכבות. יחד, גישה זו הובילה לזיהוי הטיות שיפוט פסימיות בעכברי CH באמצעות עיכובים ארוכים יותר בתגובה לרמזים מעורפלים. חוקרים עתידיים צריכים לשקול באופן דומה אם להיבטים בטיפולים שלהם בעניין, בדיור או בפרקטיקות של גידול יש פוטנציאל להסוות את השפעות הטיפול או לגרום להשפעות רצפה (כלומר, כאשר כל בעלי החיים מראים פסימיות ניכרת, תוך שלילת היכולת של המשימה לזהות הבדלי טיפול עדינים יותר) כך שניתן יהיה למנוע או למתן אותם.

שכפול נוסף ועידון של משימה מבטיחה זו נדרשים כעת. עד כה, משימת JB זו יושמה רק על בעלי חיים החווים השפעה שלילית ארוכת טווח, בעלת עוררות נמוכה (כתוצאה מדיור מגביל או ממחלה כרונית19). לכן חשוב שעבודה עתידית תנסה לבחון את הרגישות של משימה זו לגורמי לחץ חריפים ולמצבים רגשיים שליליים מעוררים גבוהים. יתר על כן, מקסום הערך של משימה זו יכלול גם שכפול מחקרים החוקרים מהימנות של בדיקות חוזרות של אנשים לאותם אנשים, או מספר בדיקות מעורפלות. בדיקה חוזרת עם אותן בדיקות תאפשר לחוקרים לבחון השערות לגבי שינויים בהשפעה לאורך זמן, בעוד שחשיפת הנבדקים לספקטרום של רמזים מעורפלים (כלומר, כמעט חיוביים, בינוניים וכמעט שליליים) עשויה לאפשר זיהוי של סוגים שונים של מצבים שליליים (במיוחד דיכאון לעומת מצבים דמויי חרדה)11,42 . ניסויי אימות נוספים צריכים גם לחקור את הערך של פרוטוקולים קצרים יותר, כמו גם הבדלים פוטנציאליים בין זנים ומינים (אם כי הפרסום המקורי אכן מתייחס לסוגיות אלה, ומשתמש בהצלחה בפרוטוקול קצר יותר כדי להעריך את ההשפעה בעכברים זכרים19). ואכן, משימה זו עשויה להיות מורחבת לכל מכרסמים בעלי מוטיבציה פנימית לבצע מחילות43,44 בתנאי שיבוצעו שינויי גודל מתאימים, והאימות יאושר. שכפולים ועידונים כאלה חשובים מכיוון שעד כה לא פותחו משימות JB תקפות אחרות עבור עכברים ומכיוון שמשימות JB רגישות הן להערכיות והן לעוצמה של מצבים רגשיים (כפי שמתואר במבוא), דבר שרוב האינדיקטורים להשפעה על בעלי חיים אינם מצליחים לעשות (למשל, ניתן לשנות פעילות היפותלמית-יותרת המוח-יותרת הכליה בתגובה לחוויות חיוביות ושליליות כאחד7, 45).

בסך הכל, פיתוח משימת JB של עכבר מייצג כלי חדש ומבטיח ופותח את הדלת להתקדמות רבה בהערכת השפעת העכבר. עכברים הם בעלי החוליות הנפוצים ביותר הן במחקר בסיסי והן במחקר תרגומי17, ומשימה זו מספקת אמצעי לענות על שאלות חיוניות על רווחתם של עשרות מיליוני בעלי חיים אלה המשמשים ברחבי העולם, כמו גם על הקשרים בין השפעה לבין המחלות או התנאים שהם משמשים למודל. אף על פי שהשימוש במשימה זו אינו מומלץ להערכת הרווחה היומיומית, חקירה ניסיונית של פרקטיקות דיור וגידול עשויה לסייע בזיהוי חידודים המקדמים את רווחת העכברים ולסייע בזיהוי סימנים עדינים יותר של סבלם של בעלי חיים שניתן להבחין בהם לצד הכלוב. בהתחשב באופי ההומני והעשיר הפוטנציאלי של משימה זו, והעלות הכלכלית הנמוכה של יישום הפרוטוקול, למשימת JB חדשנית זו יש תועלת רבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים למיגל איילה, לינדזי קיצ'נהאם, ד"ר מישל אדוארדס, סילביה לאם וסטפני דג'ארדין על תרומתם לעבודת האימות Reseasco et al.19 שעליה מבוסס פרוטוקול זה. אנו רוצים להודות גם לעכברים ולטכנאי הטיפול הנפלאים שלנו בבעלי חיים, מיכאלה רנדל ומישל צ'יפלאק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Commercial alcohol P016EAAN Dilute to 70% with distilled water, for cleaning
Centrifuge tubes Fischer 55395 15 mL tubes used to dilute essences here. However, size may be selected based on total volume required for sample size
Cheerios (original) Cheerios N/A Commercially available. Used as reward to train animals to enter annex cage for handling
Corncob bedding Envigo 7092 Teklad 1/8 corncob bedding used in digging pots and animal cages
Cotton pads Equate N/A Commercially available. Modified in lab to fit within tissue cassettes for scent dispensing
Digging pots Rubbermaid N/A Commercially available. Containers were modified to fit the apparatus in the lab
Dried, sweetened banana chips Stock and Barrel N/A Commercially available. High value reward in JB task
JB apparatus N/A The apparatus was made in the lab
JWatcher event recording software Animal Behavior Laboratory, Macquarie University Version 1.0 Freely available for download online. Used to score digging behavior during JB task
Mint extract Fleibor N/A Commercially "Menta (Solución)". Discriminative stimulus odor
Rodent Diet Envigo 2914 Teklad global 14% protein rodent maintenance diets. Low value reward in JB task and regular diet in home cage
SAS statistical software SAS Version 9.4 Other comparable software programs (e.g. R) are also appropriate
Vanilla extract Fleibor Commercially available "Vainilla (Solución)". Discriminative stimulus odor
Video camera Sony DCR-SX22 Sony handycam.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathews, A., MacLeod, C. Cognitive vulnerability to emotional disorders. Annual Review of Clinical Psychology. 1, 167-195 (2005).
  2. Mathews, A., MacLeod, C. Cognitive approaches to emotions. Anual Review of Psychology. 45 (1), 25-50 (1994).
  3. Blanchette, I., Richards, A. The influence of affect on higher level cognition: A review of research on interpretation, judgement, decision making and reasoning. Cognition and Emotion. 24 (4), 561-595 (2010).
  4. MacLeod, C., Cohen, I. L. Anxiety and the interpretation of ambiguity: A text comprehension study. Journal of Abnormal Psychology. 102 (2), 238-247 (1993).
  5. Everaert, J., Podina, I. R., Koster, E. H. W. A comprehensive meta-analysis of interpretation biases in depression. Clinical Psychology Review. 58, 33-48 (2017).
  6. Haselton, M. G., Nettle, D. The paranoid optimist: An integrative evolutionary model of cognitive biases. Personality and Social Psychology Review. 10 (1), 47-66 (2006).
  7. Mendl, M., Paul, E. Getting to the heart of animal welfare. The study of animal emotion. Stichting Animales. , Netherlands. (2017).
  8. Harding, E. J., Paul, E. S., Mendl, M. Cognitive bias and affective state. Nature. 427 (6972), 312 (2004).
  9. Douglas, C., Bateson, M., Walsh, C., Bédué, A., Edwards, S. A. Environmental enrichment induces optimistic cognitive biases in pigs. Applied Animal Behaviour Science. 139 (1-2), 65-73 (2012).
  10. Paul, E. S., Harding, E. J., Mendl, M. Measuring emotional processes in animals: The utility of a cognitive approach. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (3), 469-491 (2005).
  11. Mendl, M., Burman, O. H. P., Parker, R. M. A., Paul, E. S. Cognitive bias as an indicator of animal emotion and welfare: Emerging evidence and underlying mechanisms. Applied Animal Behaviour Science. 118 (3-4), 161-181 (2009).
  12. Rygula, R., Pluta, H., Popik, P. Laughing rats are optimistic. PLoS ONE. 7 (12), 51959 (2012).
  13. Boissy, A., et al. Assessment of positive emotions in animals to improve their welfare. Physiology and Behavior. 92 (3), 375-397 (2007).
  14. Ross, M., Garland, A., Harlander-Matauschek, A., Kitchenham, L., Mason, G. Welfare-improving enrichments greatly reduce hens' startle responses, despite little change in judgment bias. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
  15. Lagisz, M., et al. Optimism, pessimism and judgement bias in animals: A systematic review and meta-analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 118, 3-17 (2020).
  16. Canadian Council on Animal Care CCAC Animal Data Report 2019. , Available from: https://ccac.ca/Documents/AUD/2019-Animal-Data-Report.pdf (2019).
  17. Report From the Commission to the European Parlaiment and the Council. European Commission. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/HTML/?uri=CELEX:52020DC0016&from=EN (2020).
  18. Cryan, J. F., Holmes, A. Model organisms: The ascent of mouse: Advances in modelling human depression and anxiety. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (9), 775-790 (2005).
  19. Resasco, A., et al. Cancer blues? A promising judgment bias task indicates pessimism in nude mice with tumors. Physiology and Behavior. 238, 113465 (2021).
  20. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (9), 1769-1777 (2020).
  21. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: The major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  22. Gygax, L. The A to Z of statistics for testing cognitive judgement bias. Animal Behaviour. 95, 59-69 (2014).
  23. Gaskill, B. N., Garner, J. P. Power to the people: Power, negative results and sample size. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 59 (1), 9-16 (2020).
  24. MacLellan, A., Adcock, A., Mason, G. Behavioral biology of mice. Behavioral Biology of Lab Animals. , 89-111 (2021).
  25. Walker, M., et al. Mixed-strain housing for female C57BL/6, DBA/2, and BALB/c mice: Validating a split-plot design that promotes refinement and reduction. BMC Medical Research Methodology. 16 (11), (2016).
  26. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: Why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  27. Nip, E., et al. Why are enriched mice nice Investigating how environmental enrichment reduces agonism in female C57BL / 6, DBA / 2, and BALB / c mice. Applied Animal Behaviour Science. 217, 73-82 (2019).
  28. Tilly, S. C., Dallaire, J., Mason, G. J. Middle-aged mice with enrichment-resistant stereotypic behaviour show reduced motivation for enrichment. Animal Behaviour. 80 (3), 363-373 (2010).
  29. Fureix, C., et al. Stereotypic behaviour in standard non-enriched cages is an alternative to depression-like responses in C57BL/6 mice. Behavioural Brain Research. 305, 186-190 (2016).
  30. Nip, E. The long-term effects of environmental enrichment on agonism in female C57BL/6, BALB/c, and DBA/2 mice. Thesis Dissertation. , University of Guelph. (2018).
  31. Wei, J., Carroll, R. J., Harden, K. K., Wu, G. Comparisons of treatment means when factors do not interact in two-factorial studies. Amino Acids. 42 (5), 2031-2035 (2012).
  32. Ruxton, G. D., Neuhäuser, M. When should we use one-tailed hypothesis testing. Methods in Ecology and Evolution. 1 (2), 114-117 (2010).
  33. Young, J. W., et al. The odour span task: A novel paradigm for assessing working memory in mice. Neuropharmacology. 52 (2), 634-645 (2007).
  34. Latham, N., Mason, G. From house mouse to mouse house: The behavioural biology of free-living Mus musculus and its implications in the laboratory. Applied Animal Behaviour Science. 86 (3-4), 261-289 (2004).
  35. Jones, S., et al. Assessing animal affect: an automated and self-initiated judgement bias task based on natural investigative behaviour. Scientific Reports. 8 (1), 12400 (2018).
  36. Novak, J., et al. Effects of stereotypic behaviour and chronic mild stress on judgement bias in laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 174, 162-172 (2016).
  37. Krakenberg, V., von Kortzfleisch, V. T., Kaiser, S., Sachser, N., Richter, S. H. Differential effects of serotonin transporter genotype on anxiety-like behavior and cognitive judgment bias in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 263 (2019).
  38. Krakenberg, V., et al. Technology or ecology? New tools to assess cognitive judgement bias in mice. Behavioural Brain Research. 362, 279-287 (2019).
  39. Krakenberg, V., et al. Effects of different social experiences on emotional state in mice. Scientific Reports. 10, 15255 (2020).
  40. Bračić, M., Bohn, L., Krakenberg, V., Schielzeth, H., Kaiser, S. Once an optimist, always an optimist? Studying cognitive judgment bias in mice. EcoEvoRxiv. , (2021).
  41. Jones, S., Paul, E. S., Dayan, P., Robinson, E. S. J., Mendl, M. Pavlovian influences on learning differ between rats and mice in a counter-balanced Go/NoGo judgement bias task. Behavioural Brain Research. 331, 214-224 (2017).
  42. Roelofs, S., Boleij, H., Nordquist, R. E., vander Staay, F. J. Making decisions under ambiguity: Judgment bias tasks for assessing emotional state in animals. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 10 (119), 1-16 (2016).
  43. Sherwin, C. M., Haug, E., Terkelsen, N., Vadgama, M. Studies on the motivation for burrowing by laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 88 (3-4), 343-358 (2004).
  44. Deacon, R. M. J. Burrowing: A sensitive behavioural assay, tested in five species of laboratory rodents. Behavioural Brain Research. 200 (1), 128-133 (2009).
  45. MacDougall-Shackleton, S. A., Bonier, F., Romero, L. M., Moore, I. T. Glucocorticoids and "stress" are not synonymous. Integrative Organismal Biology. 1 (1), 1-8 (2019).

Tags

התנהגות גיליון 181
הערכה של הטיית שיפוט עכברים באמצעות משימת חפירת חוש הריח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

MacLellan, A., Resasco, A., Young,… More

MacLellan, A., Resasco, A., Young, L., Mason, G. Assessment of Mouse Judgment Bias through an Olfactory Digging Task. J. Vis. Exp. (181), e63426, doi:10.3791/63426 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter