Summary
Gevestigde immunochemische methoden om peptidetransmitters in vivo te meten, vertrouwen op microdialyse of bulkvloeistoftrekking om het monster te verkrijgen voor offline analyse. Deze lijden echter aan spatiotemporale beperkingen. Het huidige protocol beschrijft de fabricage en toepassing van een capacitieve immunoprobe biosensor die de beperkingen van de bestaande technieken overwint.
Abstract
Het vermogen om biomarkers in vivo te meten die relevant zijn voor de beoordeling van ziekteprogressie is van groot belang voor de wetenschappelijke en medische gemeenschappen. De resolutie van de resultaten verkregen met de huidige methoden voor het meten van bepaalde biomarkers kan enkele dagen of weken duren om te verkrijgen, omdat ze zowel ruimtelijk als temporeel in resolutie kunnen worden beperkt (bijv. vloeistofcompartimentmicrodialyse van interstitiële vloeistof geanalyseerd door enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance vloeistofchromatografie [HPLC] of massaspectrometrie); zo wordt hun begeleiding van tijdige diagnose en behandeling verstoord. In deze studie wordt een unieke techniek voor het detecteren en meten van peptidetransmitters in vivo door het gebruik van een capacitieve immunoprobe biosensor (CI-sonde) gerapporteerd. Het fabricageprotocol en de in vitro karakterisering van deze sondes worden beschreven. Metingen van sympathische stimulatie-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo worden verstrekt. NPY-afgifte is gecorreleerd aan de sympathische afgifte van noradrenaline voor referentie. De gegevens tonen een aanpak voor de snelle en gelokaliseerde meting van neuropeptiden in vivo. Toekomstige toepassingen omvatten intraoperatieve real-time beoordeling van ziekteprogressie en minimaal invasieve kathetergebaseerde inzet van deze sondes.
Introduction
Verschillende chemische methoden voor het detecteren en kwantificeren van biomarkers worden routinematig gebruikt in zowel eiwitchemie als klinische diagnostiek, met name bij kankerdiagnoses en de beoordeling van de progressie van hart- en vaatziekten. Momenteel zijn methoden zoals high-performance vloeistofchromatografie (HPLC), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en massaspectrometrie afhankelijk van monsterverzameling uit het vasculaire compartiment 1,2,3 door bulkvloeistoftrekking of het interstitiële compartiment door microdialyse. Microdialyse maakt gebruik van een semipermeabele membraanbuis van bekende lengte die in een interessant gebied wordt geplaatst. Verzamelvloeistof wordt gedurende enkele minuten door de buis gedrenkt4 om het monster te verzamelen voor analyse5, waardoor de temporele resolutie wordt beperkt. Op deze manier bieden de verzamelde monsters slechts een gemiddelde waarde in de tijd van de lokale micro-omgeving en worden ze beperkt door de perfusiesnelheid en de verzameling van voldoende monstervolume. Bovendien vereisen deze methoden de bundeling van experimentele gegevens en signaalmiddeling; daarom kunnen ze geen rekening houden met variabiliteit tussen proefpersonen. Belangrijk is dat de tijd tussen monsterverzameling en daaropvolgende offline analyse onmiddellijke klinische interventie en therapeutica uitsluit.
In dit protocol wordt het gebruik van een capacitieve immunoprobe biosensor (CI-sonde) voor de tijd-opgeloste elektrische detectie van specifieke bioactieve peptiden beschreven. Neuropeptide Y (NPY), vrijgegeven uit post-ganglionaire sympathische neuronen die de vasculatuur, endocardium, cardiomyocyten en intracardiale ganglia innerveren, is een belangrijke neuromodulerende peptidetransmitter in het cardiovasculaire systeem 6,7,8,9. De hier gepresenteerde methode is ontworpen om NPY te meten en de experimentele haalbaarheid wordt aangetoond in een varkenshartmodel. Deze benadering is echter van toepassing op elk bioactief peptide waarvoor een selectief antilichaam beschikbaar is10. Deze methode is gebaseerd op de capacitieve overgang tussen een platinadraadsonde en de geleidende vloeistof aan de gefunctionaliseerde punt11,12. In deze toepassing werd de interactie gemedieerd door een antilichaam tegen het doelneuropeptide (NPY), dat gebonden was aan de elektrodepunt, waarbij de geleidende vloeistofomgeving werd gekoppeld. Deze functionalisatie werd bereikt door elektrodepositie van reactief polydopamine op de punt van de platinadraadsonde10,13.
Wanneer de antilichaam-gefunctionaliseerde sonde in vivo in een gebied van belang wordt geplaatst, leidt de geëvoceerde endogene NPY-afgifte tot binding aan de vangantistoffen op de sondepunt en wordt de geleidende vloeistof aan het elektrodeoppervlak verplaatst door het NPY-eiwit. Lokale verandering in de elektrische omgeving resulteert in de verplaatsing van hoog-mobiliteit, hoog-diëlektrische vloeistof met een onbeweeglijk, statisch geladen molecuul. Dit verandert de elektrode-vloeistofinterface en dus de capaciteit ervan, die wordt gemeten als een verandering in de laadstroom als reactie op een stapfunctiecommandopotentiaal. Een negatieve "reset" potentiaal wordt onmiddellijk na elke individuele meetcyclus gebruikt om gebonden NPY van het antilichaam af te weren door middel van elektrostatische interactie, waardoor de antilichaambindingsplaatsen worden vrijgemaakt voor volgende meetrondes10. Dit maakt het effectief mogelijk om NPY op een tijdsgebonden manier te meten. De unieke CI-techniek overwint de beperkingen van de hierboven beschreven op microdialyse gebaseerde immunochemische methoden om dynamische biomarkerniveaus van een enkel experiment te meten zonder gegevens te poolen of signaalmiddeling over verschillende experimenten9, waardoor gegevens in bijna realtime worden verstrekt. Bovendien biedt het vermogen om deze methode aan te passen aan elke biomarker van belang waarvoor er een geschikt antilichaam bestaat op een tijdsgeodepareerde en gelokaliseerde schaal een belangrijke technische vooruitgang in immunochemische metingen voor de evaluatie van ziekteprogressie en de begeleiding van therapeutische interventies.
De software voor data-acquisitie en -analyse is op maat geschreven in IGOR Pro (een volledig interactieve softwareomgeving). Een analoog naar digitaal converter (A/D) systeem gaf een commandospanning onder computerbesturing en verkreeg gegevens van een aangepaste versterker. De versterker bezat bepaalde unieke eigenschappen. Deze omvatten een feedbackweerstand (schakelbaar) voor elk van de vier acquisitiekanalen, waardoor 1 MOhm of 10 MOhm feedbackspanningspancircuits konden worden gekozen om de variabiliteit van de elektrode te integreren. Een podiumeenheid met een enkele kop en een wederzijds aard- / referentiecircuit voor alle vier de acquisitiekanalen werd ook gebouwd om het apparaat dicht bij de borst in een enkele fysieke module te plaatsen. Een 1 MOhm feedbackweerstandsinstelling werd gebruikt om alle gerapporteerde gegevens te verzamelen.
De filter- en versterkingsinstellingen werden getelegrafeerd van de versterker en opgenomen in het gegevensbestand. Gegevens werden gefilterd op 1 kHz via een 2-polig analoog Bessel-filter gedigitaliseerd op 10 kHz. Het verschil in potentiaal tussen de sonde en de omringende geleidende oplossing creëert een Helmholtz capacitieve laag aan de sondepunt. Ligandbinding aan het antilichaam aan de sondepunt resulteert in een veranderde lokale lading en dus een verandering in de Helmholtz-capaciteit. Deze verandering in de capacitieve component van het circuit resulteert in een verschuiving in de grootte van de geïnjecteerde lading die nodig is om de sonde naar de potentiaal in het stapfunctiespanningsprotocol te brengen. De binding van een specifiek ligand aan de gefunctionaliseerde sonde resulteert dus in een verandering in de elektrodecapaciteitsmeting als een verandering in de piek capacitieve stroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de University of California, Los Angeles Animal Research Committee en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8e editie, 2011). Volwassen mannelijke Yorkshire-varkens van ongeveer 75 kg werden gebruikt voor in vivo studies10.
1. Capacitieve immunoprobe fabricage en functionalisatie
- Snijd een 25 cm lengte van perfluoroalkoxy (PFA) -gecoate platinadraad (zie Tabel van materialen) en strip ongeveer 5 mm PFA-coating van het ene uiteinde met behulp van een scalpel, waarbij u voorzichtig bent om niet in de platinadraad te snijden.
- Steek het gestripte uiteinde van de platinadraad in een vergulde 1 mm mannelijke connectorpen en krimp de connectorpentanden rond het gestripte uiteinde van de platinadraad met behulp van een naald-neustang (zie Materiaaltabel).
- Soldeer de platinadraad aan de vergulde connectorpen. Zorg ervoor dat u geen overmatige hoeveelheid soldeer gebruikt.
- Bereid dopamine-oplossing door 50 mg dopamine HCl op te lossen in 50 ml 10 mM fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 6,0) door te roeren.
- Zodra de dopamine volledig is opgelost, plaatst u de punt van de platinadraad in het vat met de vers gemaakte dopamine-aangevulde PBS. Steek een gouden connectorpen in een kanaal van het hoofdpodium (zie Materiaaltabel).
- Sluit de AgCl-schijfelektrode (massa-elektrode, zie Materiaaltabel) aan op het grondkanaal in het hoofdbeeld. Plaats de AgCl-schijf in het vat met dopamine-aangevulde PBS en platinadraad; pas alleen op dat u de schijfelektrode onderdompelt en niet de lengte van de draad of het soldeer. Sluit een draadshunt aan op de referentiekanalen van het hoofdpodium voordat u verder gaat.
- Open de interactieve software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel). Bereid een zaagtand elektrodepositie commando potentiaal protocol voor met de volgende parameters: startpotentiaal = −0,6 V; eindpotentiaal = +0,65 V; scansnelheid = 0,04 V∙s-1; duur van de depositie = 420 s. Begin met het polydopamine-depositieprotocol en zorg ervoor dat alle draden correct zijn aangesloten.
- Verwijder na het voltooien van de polydopamineafzetting de AgCl-gemalen pellet en de punt van de platinadraad uit het vat en zorg ervoor dat u de punt van de platinadraadelektrode niet verstoort. Plaats de punt van de draad in een microbuis met PBS (pH 7,4) gedurende 2-5 minuten terwijl de antilichaamoplossing wordt bereid; zorg ervoor dat de draadpunt geen contact maakt met de zijkanten of onderkant van de microbuis.
OPMERKING: Antilichaamoplossing kan worden gemaakt tijdens polydopamineafzetting; de overdracht van de platinadraad van het dopaminebevattende vat naar de microbuis van PBS na polydopamineafzetting mag echter niet worden overgeslagen. - Bereid de antilichaamoplossing voor. Combineer het antilichaam van belang met PBS (pH 7,4) in een verhouding van 1:20 in een vat van de juiste grootte (bijvoorbeeld een microbuisje).
OPMERKING: Het anti-NPY monoklonale antilichaam (zie tabel met materialen) dat hier werd gebruikt, werd aliquoteerd met 1 mg / ml; een voorbeeld van een antilichaampreparaat hier zou 4 μL antilichaam tegen 76 μL PBS zijn. - Week de polydopamine-gedeponeerde punt van de platina-elektrode minimaal 2 uur in antilichaamoplossing bij kamertemperatuur, zorg er opnieuw voor dat de platinadraadpunt in oplossing wordt gesuspendeerd en niet op het binnenoppervlak van de microbuis rust.
OPMERKING: Recente implementatie van deze techniek heeft de voorkeur gegeven aan het gebruik van de platinadraadelektrode onmiddellijk na deze stap in plaats van natte of droge opslag voor later gebruik. - Spoel na het weken in de antilichaamoplossing de nieuw gefunctionaliseerde capacitieve immunoprobe (CI probe) tip kort in PBS (pH 7,4). De sonde is nu klaar voor gebruik.
2. Experimentele opzet voor in vitro detectie en meting van peptide
- Plaats de functionele punt van de CI-sonde in de stroomkamer en zorg ervoor dat de punt van de elektrode op geen enkele manier wordt verstoord, omdat dit de sensorische punt van de sonde kan beschadigen.
OPMERKING: De stroomkamer is gemaakt door siliconenelastomeer (zie tabel met materialen) in een 35 mm kweekschaal te gieten met een langwerpige eivormige ruimtevuller in het midden van de schaal. Na het uitharden wordt de eivormige vorm uit het elastomeer verwijderd. De kamer wordt vervolgens overgoten met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en heeft een stroomsnelheid van 3 ml / min. Zorg ervoor dat de in- en uitstroom het vloeistofniveau in de kamer zodanig handhaaft dat er geen getijdenwerking van het superfusaat wordt waargenomen. De stroom moet op zijn plaats blijven zolang de CI-sonde in gebruik is. - Voer voorafgaand aan de eerste experimentele test een TBS-standaardrun uit om de CI-sonde te conditioneren. Stel het volgende commandospanningsprotocol in: positieve stappotentiaal = +100 mV; negatieve stappotentiaal = −5 mV; stapduur = 20 ms; duur van de verwerving = 600 s.
OPMERKING: Het is belangrijk om rekening te houden met de evenwichtswerking van de sonde tijdens de eerste fase van het fietscommandopotentieel voorafgaand aan gegevensverzameling. - Maak een oplossing van het peptide van belang met behulp van dezelfde TBS om de samenstelling van het superfusaat te behouden. Stel een spruitstuksysteem in waarbij het superfusaat kan worden geschakeld tussen TBS en peptide-aangevulde TBS zonder bellen in het slangsysteem of de stroomkamer te introduceren.
OPMERKING: Synthetisch varkens NPY-peptide (zie Tabel van materialen) werd gebruikt in deze studie. - Stel het peptide-sensing data acquisition protocol in met behulp van TBS-standaardparameters (zie stap 2.2.).
OPMERKING: In deze implementatie was de duur van elke experimentele test 360 s (120 s TBS, 120 s peptide-aangevulde TBS, 120 s TBS).
3. Aanpassing van de CI-sonde voor in vivo gebruik
- Voorafgaand aan polydopamineafzetting (stap 1.7.), rijg de blootgestelde punt van de platinadraadelektrode door een hypodermische naald van 22 G, waardoor ongeveer 2 mm voorbij de punt van de naald overblijft. Buig met behulp van een tang voorzichtig de punt van de platinadraadelektrode terug, waardoor een "weerhaak" ontstaat die aan het uiteinde van de hypodermische naald hangt.
- Trek de naald voorzichtig uit de prikkeldraadpunt en laat voldoende draad over om in het vat te plaatsen zonder dat de naald in contact komt met de vloeistof. Ga verder met stappen 1.4.-1.11.
OPMERKING: Afhankelijk van de in vivo opstelling kan het nodig zijn om een lengte platinadraad langer dan 25 cm door te snijden.
- Trek de naald voorzichtig uit de prikkeldraadpunt en laat voldoende draad over om in het vat te plaatsen zonder dat de naald in contact komt met de vloeistof. Ga verder met stappen 1.4.-1.11.
- Voordat u de CI-sonde op het hoofdpodium aansluit, moet u ervoor zorgen dat de volledige elektrische opstelling goed is geaard. Als u dit niet doet, kan dit ongewenste elektrische interferentie veroorzaken tijdens de experimentele opnames.
- Verdoof de dieren na een eerder gepubliceerd rapport10.
- Voer een operatie uit om de regio van belang bloot te leggen.
OPMERKING: In deze studie werd een mediane sternotomie uitgevoerd om het hart bloot te leggen. Zie Kluge et al.10 voor meer informatie over dierchirurgie. - Verwijder voorzichtig de gefunctionaliseerde punt uit de PBS-spoeling (stap 1.11.), stuur de hydodermische naald naar de prikkeldraad C.I.-sonde en implanteer deze voorzichtig in het interessante gebied voordat u de gouden connectorpen in het hoofdpodium steekt. Eenmaal geïmplanteerd, trekt u de hypodermische naald terug en laat u de elektrode op zijn plaats.
OPMERKING: Voor dit onderzoek werd de sonde in de middelste zijwand van het linkerventrikelmyocardium10 geplaatst. - Nadat u de juiste elektrische installatie hebt gegarandeerd, gaat u verder met standaard- en experimentele testprotocollen (stap 2.2. en stap 2.4.).
- Na voltooiing van de experimenten, euthanaseer het dier volgens institutioneel goedgekeurde technieken.
OPMERKING: In deze studie worden de dieren geëuthanaseerd onder diepe anesthesie via inductie van ventriculaire fibrillatie10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektrodefabricage en karakterisering
Een flexibele capacitieve immunoprobe (CI-sondes) werd gefabriceerd en een representatief beeld is afgebeeld in figuur 1A. De elektrodepotentiaal werd ingesteld door een computergestuurd spanningsklemcircuit (figuur 1B) en de elektrode werd ondergedompeld in een polydopamine-oplossing gemaakt in PBS. Polydopamine werd elektrodeposited op de geleidende elektrode tip13 voor functionalisatie. De commandopotentiaal dreef de sondespanning aan en de klemstroominjectie werd gemeten. De gemeten klemstroom tijdens een enkele cyclus van polydopamineafzetting is weergegeven in figuur 1C. Onmiddellijk na polydopamineafzetting werd de gecoate elektrodepunt gedrenkt in een antilichaamoplossing van belang (figuur 2A). Alle elektroden werden onmiddellijk na deze stappen gebruikt.
In vitro meting van NPY
De antilichaam-gefunctionaliseerde sonde werd in een stroomkamer geplaatst en aangedreven door het spanningsklemcircuit met een voorbeeldopdrachtpotentiaal, en de opgenomen stroom wordt weergegeven (figuur 2B, C). In vitro opnames werden uitgevoerd in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,4). De stapfunctiegolfvorm bestaat uit een positieve stappotentiaal (bovenste blauwe deel, figuur 2B) en een negatieve "reset"-potentiaal (onderste rode deel, figuur 2B). Het bereik van dit commandopotentiaal meet effectief de binding en roept daaropvolgende afstoting van peptiden op zonder de gevoeligheid van de sonde te verminderen10. Na fabricage werd elke sonde getest op initiële conditionering onder het commandopotentiaalprotocol. Opgemerkt moet worden dat de sondes die het meest stabiele en reproduceerbare initiële conditioneringsprofiel retourneerden, gedefinieerd als een kleiner initieel verval gevolgd door een stabiele basislijn (figuur 2D), de meest reproduceerbare metingen in vitro en in vivo gaven. Het meten van de initiële stabilisatie van de CI-sondes is dus een belangrijk kwaliteitscontrolepunt om de geschiktheid van de sonde te bepalen.
Beoordeling van de gevoeligheid en stabiliteit van de elektrode in vitro
Capacitieve immunoprobes werden in een stroomkamer geplaatst en overfuseerd met TBS aangevuld met bekende concentraties neuropeptide Y (NPY, 5-150 pM). Capacitieve stromen, gemeten als de piekamplitude van de +100 mV depolarisatie, werden tegen de tijd uitgezet. De stroom van NPY in de stroomkamer verhoogde de capacitieve stromen ten opzichte van de uitgangswaarde (60 pM NPY, figuur 2E). Een demonstratie van de dosisafhankelijke stroomrespons voor 5 pM en 75 pM NPY is weergegeven in figuur 3A, en een standaardcurve gemeten onder alle geteste concentraties is weergegeven in figuur 3B. De gegevenspunten in figuur 3B waren geschikt voor een enkele exponentiële fit voor kalibratiedoeleinden.
In vivo beoordeling van neuropeptide release profielen met CI probe
Deze methodologie werd toegepast op een varkenshartpreparaat om de geschiktheid ervan voor biologische toepassing te beoordelen, zoals beschreven in de vorige publicaties10. In het kort werd een CI-elektrode door een hypodermische naald van 22 G geregen en iets naar achteren gebogen om een weerhaak te creëren (figuur 4A). De naald en prikkeldraadelektrode werden ingebracht in het linkerventrikelmyocardium van een kloppend varkenshart. De hypodermische geleidingsnaald werd vervolgens uit de elektrode gehaald en op zijn plaats in het myocard achtergelaten. Interstitiële NPY werd gemeten vóór en in reactie op 60 s bilaterale stellaat ganglionstimulatie (zie Kluge et al.10 voor een volledige beschrijving van de simulatiestappen). Een tweede negatieve controle-elektrode zonder antilichaamfunctionalisatie werd naast de NPY-sonde geplaatst. De verkregen capacitieve immunoprobeklemstromen werden tegen de in vitro kalibratiecurve gemonteerd om tijdelijk opgeloste, opgeroepen veranderingen in npy-concentraties in de cardiale micro-omgeving te bieden. Verhoogde NPY werd waargenomen tijdens stimulatie van het bilaterale stellaire ganglion en werd samen met de negatieve controle C.I-stromen (figuur 4B, bovenste plot). Tegelijkertijd werden interstitiële noradrenalineniveaus (NE) ook gemeten door snelle scanning cyclische voltammetrie (FSCV), een techniek die eerder werd gebruikt om de afgifte van catecholamine uit geïsoleerde cellen14,15, geïsoleerde weefsels16,17,18 en in het varkenshartpreparaat19 te beoordelen. Noradrenaline is een sympathische neurotransmitter die mede wordt vrijgegeven onder stellaatstimulatie (figuur 4B, lagere plot) en vertoont een synchrone afgifte met NPY, consistent met een opgeroepen sympathische respons. Deze gegevens tonen aan dat de CI-benadering gelijktijdig met andere biomarkerdetectiemethoden kan worden gebruikt om interstitiële micro-omgevingen met een hoge temporele betrouwbaarheid te beoordelen. In het kort wordt een sensorelektrode geïmplanteerd in het myocardium naast de CI-sonde. De elektrodepotentiaal wordt aangedreven door de oxidatie-/reductiepotentialen van de zender door een spanningsklemcircuit. Daarom, als de elektrodepotentiaal positief wordt voor de oxidatiepotentiaal voor NE, wordt de NE vervolgens geoxideerd tot een chinonderivaat. Elektronen worden gegenereerd door de oxidatiereactie, gemeten als een compenserende stroom in de spanningsgeklemde elektrode, waardoor een index van lokale NE-afgifte wordt verkregen. Het terugschakelen van de elektrodepotentiaal naar een negatieve polarisatie vermindert het chinonproduct om de catecholamine20 te regenereren.
Figuur 1: Fabricage van de platinadraad CI-sonde. (A) Een PFA-gecoate platinadraad (25 cm lang en 127 μm in diameter) werd gebruikt om elke CI-sonde te maken. Ongeveer 5 mm PFA-coating werd van het ene uiteinde van de draad gestript, dat vervolgens werd gesoldeerd aan een mannelijke vergulde connectorpen (schaalbalk = 3 cm). (B) Een afbeelding van het spanningsklemcircuit dat wordt gebruikt om de commandopotentiaal toe te passen, wordt getoond. (C, links) De sensorische punt van de elektrode werd ondergedompeld in een buis met PBS aangevuld met 5 mM dopamine. (C, rechts) Polydopamine werd geëlektrodeposteerd op de sensorische punt. Elektrodepositie werd uitgevoerd met behulp van een zaagtandgolfvorm met de volgende parameters: −0,6 V tot +0,65 V bij een scansnelheid van 0,04 V∙s-1. De opdrachtpotentiaal (boven) en de resulterende stroom (onder) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: In vitro meting van NPY met de CI-sonde. (A) Een polydopamine-gefunctionaliseerde draad werd ondergedompeld in PBS aangevuld met een anti-NPY-antilichaam gedurende 2 uur. Hierdoor kon het antilichaam covalent binden aan het polydopamineoppervlak aan de punt van de sonde. (B) De spanningsaandeelpotentiaal wordt weergegeven. Een positieve stap in de commandopotentiaal dient om de injectiestroom te meten die nodig is om de sondespanning (blauw) te klemmen en maakt het mogelijk om de capacitieve stroom te meten. De stap negatieve commandopotentiaal (resetpotentiaal) verwijdert het gebonden peptide uit het antilichaam via elektrostatische afstoting (rood). (C) De golfvorm van het stapfunctiecommando (toptracering; +100 mV meetfase tot -5 mV resetfase, elk van 20 ms duur) biedt tijd-opgeloste, iteratieve detectie en kwantificering van het peptide. De commandopotentiaal en de resulterende stroomopname onder superfusie van de sonde met TBS wordt getoond (onderste spoor). (D) De equilibratie van een CI-sonde over een periode van 6 minuten wordt getoond (zie stap 2.2.). (E) De piek capacitieve stroom gemeten door de NPY-gefunctionaliseerde C.I. sonde wordt getoond. De CI-sonde werd eerst overgoten met Tris-gebufferde zoutoplossing, vervolgens Tris-gebufferde zoutoplossing aangevuld met 60 pM NPY en vervolgens gevolgd door een NPY-vrije Tris-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In vitro kalibratie van de CI-sonde. (A) Capacitieve immunoprobestromen werden gemeten met een NPY-antilichaam-gefunctionaliseerde sonde overgoten met Tris-gebufferde zoutoplossing. Het superfusaat werd overgeschakeld om 5 pM (rood) en 75 pM (zwart) NPY te bevatten. Deze opnames vertegenwoordigen een concentratieafhankelijk signaal dat gevoelig is voor een laag picomol NPY. (B) Capacitieve immunoprobes gefunctionaliseerd met het NPY-antilichaam werden getest op dosis-responsgevoeligheid. Opnames werden uitgevoerd onder superfusie met TBS; vervolgens TBS aangevuld met NPY (in pM): 1, 5, 15, 25, 60, 75 en 150, en vervolgens in een NPY-vrije TBS-wassing. Piek capacitieve stroomwaarden (C.I. Current) werden gemeten bij een steady state in elke NPY-concentratie en uitgezet tegen NPY-concentratie. De dosis-responsgegevens werden aangebracht om een standaardcurve te bieden voor kalibratie van de experimentele gegevens (aangepast van Kluge et al.10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Differentiële afgifte van NPY en NE opgeroepen door bilaterale stellaatstimulatie. (A) Een CI-sonde met een prikkeldraadeind voor in vivo gebruik wordt getoond (schaalbalk = 3 mm). De sonde wordt door een hypodermische naald van 22 G geregen en bereid zoals vermeld in stap 1. en stap 2. Voordat de sensor wordt ingebracht, wordt de sondepunt gebogen om een weerhaak te creëren en wordt de naald teruggetrokken bij het inbrengen in het myocardium, waardoor een prikkeldraadsonde verankerd blijft in de myocardiale wand van de linker ventrikel. (B) Een sonde gefunctionaliseerd met een anti-NPY-antilichaam werd ingebracht in het linkerventrikelmyocardium. Een identieke sonde zonder antilichaamfunctionalisatie (ø mAb) werd direct ernaast ingebracht en diende als een negatieve controle. CI-stromen werden bepaald als reactie op bilaterale stellaatstimulatie bij 10 Hz (BSG, 4 ms pulsbreedte, 2x drempel). De resulterende stromen werden gekalibreerd tegen de standaardcurve (figuur 3B) en uitgezet (bovenste plot). Noradrenaline afgifte op dezelfde interstitiële locatie werd gemeten met behulp van snel scannende cyclische voltammetrie (lagere plot). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft de productie en het testen van een capacitieve immunoprobe (CI-sonde) die in staat is om biomarkers van belang te detecteren en te meten in zowel in vitro als in vivo omgevingen. Detectie wordt bereikt door de biomarker op de elektrodepunt te vangen. De vanggebeurtenis verandert de capacitieve overgang tussen een capacitieve immunoprobe van platinadraad en de omringende geleidende vloeistofomgeving, gemeten als een verandering in de laadstroom als reactie op een potentiële verschuiving in de sonde. Er werd ook een uniek elektrisch acquisitieprotocol gepresenteerd dat het mogelijk maakt om de immunoprobe tussen detectiecycli te "resetten" door de gevangen biomarker elektrostatisch af te stoten van de sondepunt. Deze biomarkerklaring maakt volgende meetcycli mogelijk, waardoor een tijdsresolutiemaat10 ontstaat. In deze implementatie omvatte de sondeproductie elektrodepositie van een polydopamine-reactieve laag op de punt van een dunne platinadraadelektrode waaraan een antilichaam, verhoogd tegen een biomarker van belang, covalent gebonden is. Dopamine en polydopamine verschillen doordat polydopamine een chinon functionele groep bevat. De chinonen fungeren als een doelwit voor nucleofiele aanval door primaire amines om een covalente binding te vormen21. De meest cruciale stap in dit protocol is het zorgvuldig omgaan met de fysieke draad, omdat elke slijtage van de gefunctionaliseerde tip de CI-sonde onbruikbaar kan maken.
Bovendien is het essentieel om de stabiliteit van de CI-sonde voorafgaand aan de meting te waarborgen. Het kan nodig zijn om verschillende controlestandaarden uit te voeren in Tris-gebufferde zoutoplossing voorafgaand aan experimentele tests; daarbij zoekt de experimentator naar een stabiele transiënte curve in de resulterende stroom (bijvoorbeeld figuur 2D). Consistente fabricagepraktijken kunnen dit voorbijgaande signaal minimaliseren, maar niet elimineren.
Het gebruik van geschikte antilichamen bij het onderzoeken van biomarkers van belang is een andere belangrijke factor bij het gebruik van deze techniek. In deze implementatie zijn antilichamen die worden gekarakteriseerd als toepasbaar in technieken die niet-gedenatureerde eiwitten detecteren het meest geschikt (bijv. IHC, ELISA, in situ hybridisatie) in plaats van die voor gedenatureerde eiwittoepassingen (western blot).
Het gebruik van immunochemische methoden bij de klinische diagnose en beoordeling van de progressie van hartaandoeningen, hoewel goed ingeburgerd1, is voornamelijk gebaseerd op monsters die zijn afgeleid van een weefselbiopsie of bemonstering van het vasculaire compartiment en, secundair, op microdialyse gebaseerde interstitiële vloeistofverzameling. Monsters kunnen speciale voorbereiding, behandeling en technologie vereisen om nauwkeurige resultaten te leveren, die in het beste geval een maat bieden voor de biomarker van belang bij temporele resolutie 4,5 op minuutniveau. De beschreven capacitieve immunoprobemethodologie biedt verschillende voordelen ten opzichte van dergelijke benaderingen: 1) de beschreven sondeproductie en -toepassing kunnen worden aangepast om veel unieke biomarkers van betekenis te detecteren; 2) de flexibele platinadraadelektroden zijn inzetbaar in de vasculatuur, in organen of in andere vloeistofcompartimenten; 3) het afgeleide signaal biedt tijd-opgeloste dynamische afgifteprofielen van biomarkers van belang bij afzonderlijke proefpersonen; 4) de CI-sonde behoudt de stabiliteit in de loop van de tijd; 5) een stabiele opnameconditie kan worden gehandhaafd, zelfs in regio's met een hoge mate van mechanische spanning of beweging vanwege de flexibiliteit van de sensor zelf; en 6) de mobiliteit van het systeem maakt dynamische uitlezingen van interessante biomarkers met een ongekende resolutie in vitro, in vivo, op de bank en uiteindelijk aan het bed mogelijk.
De hierboven beschreven techniek overwint de spatiotemporale beperkingen die inherent zijn aan traditionele op microdialyse gebaseerde biomarkerdetectie en -meting. Deze methodologie kan dynamische afgifteprofielen op een bijna onmiddellijke basis beoordelen bij afzonderlijke proefpersonen zonder de noodzaak van gepoolde gegevens of signaalgemiddelden over verschillende experimenten. Het gebruik van deze aanpak dient als een belangrijke technologische vooruitgang in het detecteren en meten van relevante biomarkers voor het begeleiden van klinische besluitvorming en therapeutische interventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) voor deskundige ondersteuning voor de in vivo experimenten. Dit werk werd ondersteund door NIH U01 EB025138 (JLA, CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
References
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S.
- Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction. European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).
- Farrell, D. M., et al. Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).
- Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation. JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).
- Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone. Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y. JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).
- Rigel, D. F. Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT. American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).
- Kluge, N., et al. Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G.
- Prodromidis, M. I.
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318 (5849), 426-430 (2007).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells. Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).
- Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells. Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).
- Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices. The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).
- Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).
- Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C). The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).
- Chan, S. A., et al. Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).
- Chow, R. H., von Rüden, L. Single-Channel Recording, Second Edition. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 245-275 (1995).
- Ren, Y., et al. Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating. BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).
