Summary
Herz-Thorax-Operationsmodelle bei Mäusen im Alter von >7 Tagen erfordern eine Intubation, aber dies ist eine Herausforderung für vorpubertäre (8-14 Tage alte) Mauswelpen und es gibt wenig Informationen über Anästhesieschemata für die Intubation. Hier präsentieren wir Dosierungsschemata von Ketamin / Xylazin / Atropin bei 10 Tage alten C57BL / 6J-Mauswelpen, die eine endotracheale Intubation ermöglichen und gleichzeitig die Tiersterblichkeit minimieren.
Abstract
Murine chirurgische Modelle spielen eine wichtige Rolle in der präklinischen Forschung. Mechanistische Einblicke in die myokardiale Regeneration nach Herzverletzungen können aus kardiothorakalen Operationsmodellen bei 0-14 Tage alten Mäusen gewonnen werden, deren Kardiomyozyten im Gegensatz zu denen von Erwachsenen proliferative Kapazität behalten. Mauswelpen bis zu einem Alter von 7 Tagen werden durch Unterkühlung effektiv immobilisiert und benötigen keine Intubation für die Herz-Thorax-Chirurgie. Präadoleszente (8-14 Tage alte) Mauswelpen benötigen jedoch eine Intubation, aber dies ist eine Herausforderung und es gibt wenig Informationen über die Anästhesie, um die Intubation zu erleichtern. Hier präsentieren wir Dosierungsschemata von Ketamin / Xylazin / Atropin bei 10 Tage alten C57BL / 6J-Mauswelpen, die eine endotracheale Intubation ermöglichen und gleichzeitig die Tiersterblichkeit minimieren. Die empirische Titration von Ketamin/Xylazin/Atropin-Dosierungsschemata auf das Körpergewicht zeigte, dass die Reaktion auf die Anästhesie von Mauswelpen unterschiedlichen Gewichts nichtlinear war, wobei Dosen von 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg und 50/6/0,18 mg/kg die Intubation von Jungtieren mit einem Körpergewicht zwischen 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) und 5,50-8,10 g (n = 20) erleichterten. beziehungsweise. Welpen mit niedrigerem Körpergewicht erforderten mehr Intubationsversuche als schwerere Welpen (p < 0,001). Das Überleben nach der Intubation korrelierte mit dem Körpergewicht (59%, 70% und 80% für Gruppen mit niedrigem, mittlerem und hohem Gewicht, R2 = 0,995). Für die Myokardinfarktchirurgie nach Intubation wurde eine chirurgische Anästhesieebene mit 4,5% Isofluran in 100% Sauerstoff induziert und mit 2% Isofluran in 100% Sauerstoff aufrechterhalten. Das Überleben nach der Operation war für die drei Gewichtsgruppen mit 92%, 86% und 88% ähnlich (p = 0,91). Zusammen mit Verfeinerungen der Tierbehandlungspraktiken für Intubation und Operation und der Minimierung der Kannibalisierung durch das Muttertier nach der Operation korrelierte das Gesamtüberleben für den gesamten Eingriff (Intubation plus Operation) mit dem Körpergewicht (55%, 60% und 70% für Gruppen mit niedrigem, mittlerem und hohem Gewicht, R2 = 0,978). Angesichts der Schwierigkeit bei der Intubation von 10 Tage alten Welpen und der damit verbundenen hohen Mortalität empfehlen wir, die Herz-Thorax-Chirurgie bei 10 Tage alten Welpen auf Welpen mit einem Gewicht von mindestens 5,5 g zu beschränken.
Introduction
Murine-Modelle sind von unschätzbarem Wert in der präklinischen Herz-Thorax-Forschung, insbesondere wegen der Leichtigkeit, mit der gentechnisch veränderte Mauslinien erzeugt werden können, und auch wegen der Leichtigkeit, mit der die Mäuse chirurgisch manipuliert werden können, um pathologische Krankheitsmodelle bereitzustellen, die beispielsweise die Untersuchung der Myokardregeneration nach Herzverletzungen ermöglichen1 . In diesem Zusammenhang ist es von Interesse, dass im Gegensatz zu erwachsenen Mäusen, bei denen sich Kardiomyozyten aus dem Zellzyklus zurückgezogen haben, 0-2 Tage alte neonatale Mausherzen nach apikaler Resektion oder Induktion eines Myokardinfarkts mit minimaler Narbenbildung reparieren 2,3,4. Im Gegensatz dazu regenerieren sich 7 Tage alte neonatale Herzen unvollständig mit einer höheren Inzidenz von Narbenbildung 2,3. Da Kardiomyozyten in der Spitze des linken Ventrikels bis zu 2 Wochen nach der Geburt proliferative Kapazität behalten, können mechanistische Studien zur Regeneration nach Herzverletzungen bei 0-14 Tage alten Mäusen informativ sein, um therapeutische Ziele für die Regeneration des verletzten erwachsenen Herzens zu identifizieren5.
Die Entwicklung von Mausmodellen für Herzverletzungen beinhaltet chirurgische Manipulationen unter Narkose. Dies erfordert, dass der Thorax geöffnet wird, um Zugang zum Herzen zu erhalten, was im Allgemeinen Intubation und mechanische Beatmung erfordert. Mausbelastung, Körpergewicht und Alter beeinflussen die Empfindlichkeit gegenüber Anästhetika6. Erwachsene Mäuse können mit einer Vielzahl von Wirkstoffen betäubt werden, wobei ein übliches Intubationsschema Ketamin / Xylazin / Atropin bei 100/13/0,5 mg / kg 6,7 ist. Neugeborenen Mäusen (0-7 Tage alt) fehlt ein zentralisierter Schmerzreflex und sie können effektiv auf Eis immobilisiert und ohne Intubation operiert werden 6,8,9. Vorpubertäre (8-14 Tage alte) Mauswelpen können nicht mit Hypothermiebetäubt werden 9,10; Sie erfordern eine Intubation für die Herz-Thorax-Chirurgie. Es gibt keine früheren Studien zur Herz-Thorax-Chirurgie bei vorpubertären Mäusen, die weniger als 14 Tage alt sind. Nach unserer Erfahrung ist die Intubation von Isofluran-anästhesierten präadoleszenten Mäusen unter 14 Tagen schwierig. Das empfohlene injizierbare Anästhesieschema für Mäuse, die älter als 7 Tage sind, beträgt 50-150 mg / kg Ketamin und 5-10 mg / kg Xylazin10. Präadoleszente Mäuse entwickeln sich immer noch neurologisch und ihre Reaktionen auf Medikamente und Medikamentenstoffwechsel unterscheiden sich stark von erwachsenen Tieren6. Dies stellt ein erhöhtes Risiko für Flüssigkeits-, Elektrolyt- und Säure-Basen-Ungleichgewicht sowie Hypoglykämie und Hypothermie dar, nicht nur aufgrund ihrer hohen Stoffwechselrate, die ihre begrenzten Energiespeicher schnell erschöpft, sondern auch aufgrund ihrer thermoregulatorischen Unreife 6,11,12. Daher gibt es nur wenige Informationen über Anästhetika, die sowohl die Intubation erleichtern als auch das Überleben von vorpubertären Mäusen maximieren.
Hier titrierten wir empirisch Dosierungsschemata von Ketamin / Xylazin / Atropin bei 10 Tage alten C57BL / 6J-Mauswelpen mit einem Gewicht von 3-8 g, um eine Anästhesieebene zu erreichen, die ausreicht, um eine endotracheale Intubation für nachfolgende Herz-Thorax-Operationen zu ermöglichen und gleichzeitig die Tiersterblichkeit zu minimieren. Wir haben auch den Umgang mit Tieren verfeinert, um die Sterblichkeit durch Intubation, Operation und postoperativen mütterlichen Kannibalismus zu reduzieren.
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Protocol
Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Garvan/St. Vincent's Hospital Animal Ethics Committee in Übereinstimmung mit dem Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes und den ARRIVE-Richtlinien genehmigt, und alle Experimente wurden von einem erfahrenen Kleintierchirurgen (JW) unter Anleitung eines Kinderanästhesisten (JJS) durchgeführt.
1. Vorbereitung der Instrumente
- Stellen Sie am Tag der Operation spezielle Geräte für die Intubation von 10 Tage alten Welpen auf (Abbildung 1A, B). Dazu gehören eine Wärmelampe, eine Intubationsplattform, ein faseroptisches Licht, eine kleine Pinzette, ein Laryngoskop aus einem Stück Kupferdraht mit einem Durchmesser von 0,02 mm (60 mm lang, wobei das Ende des Drahtes zu einem Kreis von 3 mm Durchmesser in einem Winkel von 175° geformt ist; Abbildung 1B) und eine 24-Gauge-Kunststoffkanüle (i.v.), die als Endotrachealtubus verwendet wird.
- Stellen Sie sicher, dass die Kanüle aus einem 19 mm langen Kunststoffschlauch (0,7 mm Außendurchmesser) besteht, der an einem 21-mm-Kunststoff-Luer-Lock-Adapter befestigt ist (Abbildung 1B). Versteifen Sie den Schlauch der Kanüle, indem Sie ein Stück Kupferdraht über den Luer-Lock-Adapter einführen. Verwenden Sie eine Kanüle mit einem Gesamtvolumen von 130 μL für eine Maus mit einem Tidalvolumen von ~8 μL/g13,14.
2. Anästhesie von 10 Tage alten Mäusen
- Am Tag der Operation entfernen Sie den Muttertier aus einem Käfig mit 10 Tage alten C57BL / 6J-Welpen und stellen Sie den Käfig auf ein Wärmekissen (37 ° C).
- Betäuben Sie die Welpen mit 10 μl pro g Körpergewicht intraperitoneale Injektion mit einer 0,5 ml Insulinspritze und 29 g Nadel mit Ketamin / Xylazin / Atropin in den in Tabelle 1 für verschiedene Gewichtsgruppen angegebenen Verhältnissen.
- Unmittelbar nach der Injektion legen Sie den Welpen in eine erwärmte (37 °C) Plexiglaskammer, die mit 100% Sauerstoff voroxygeniert wurde.
3. Intubation von 10 Tage alten Mäusen
- Nach 3-4 Minuten Sauerstoffversorgung wird der Welpe zur Intubation auf eine Plattform gebracht, im Wesentlichen wie bei erwachsenen Mäusen. Führen Sie dies mit dem Welpen in Rückenlage (Abbildung 1C) oder aufgehängt in einem 45°-Winkel15 durch. Halten Sie die Temperatur mit einer Wärmelampe aufrecht.
- Beurteilen Sie vor der Intubation die Tiefe der Anästhesie durch den Pfotenklemmreflex. Für eine optimale Intubation muss der Pfotenklemmreflex noch vorhanden sein, aber deutlich reduziert von dem eines bewussten Tieres.
- Nachdem Sie die betäubte Rückenlage des Welpen an einer Intubationsplattform gesichert haben (Abbildung 1C), halten Sie die Zunge mit einer kleinen Pinzette und verwenden Sie ein Laryngoskop aus einem Stück Kupferdraht (Abbildung 1B), um die Stimmritze und die Stimmbänder freizulegen. Unterstützen Sie die Visualisierung der Stimmbänder durch Transbeleuchtung mit einem flexiblen faseroptischen Licht (Abbildung 1D).
- Neigen Sie die Kanüle mit einer versteiften Kanüle so, dass das Luer-Lock-Ende etwas niedriger (~ 10 °) als die Spitze ist, und sobald sich die Stimmbänder trennen, führen Sie die Kanüle ein und schieben Sie sie vor, bis sich der Luer-Lock-Adapter direkt außerhalb des Mundes befindet. Entfernen Sie den Draht sofort nach der Intubation.
HINWEIS: Bei Mäusen dieses Alters ist kein Widerstand während der Intubation zu erwarten, es sei denn, die Kanüle ist zu weit fortgeschritten und die Carina spürt einen Widerstand.- Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie nach der Intubation anhand der Fähigkeit des Tieres, spontan zu atmen. Bestätigen Sie die erfolgreiche Trachealintubation von spontan atmenden Welpen, indem Sie den Intubationskatheter kurz blockieren, um zu überprüfen, ob dies die Brustbewegung verhindert.
- Den intubierten Welpen sofort in ein Wärmekissen (37 °C) überführen und die Endotrachealkanüle an ein Beatmungsgerät anschließen, das 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 L/min mit 30 μL/Schlag, 40 μL/Hub oder 50 μL/Schlag für 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g bzw. 5,50-8,10 g Welpen bzw. 150 Hübe/min liefert.
- Führen Sie diese Verfahren schnell innerhalb von <15 s durch, um das erneute Atmen zu minimieren.
4. Myokardinfarktchirurgie von 10 Tage alten Mäusen
- Um eine chirurgische Anästhesieebene für die Operation zu induzieren, schalten Sie das Gas, das in das Beatmungsgerät fließt, für 4-5min von 100% Sauerstoff auf 4,5% Isofluran in Sauerstoff (die Isoflurankonzentration wird von einem Vaporizer bestimmt).
- Bestätigen Sie nach dem Wechsel zu Isofluran erneut die Trachealintubation, indem Sie überprüfen, ob die Häufigkeit der Brustwandbewegung der des Beatmungsgeräts entspricht. Verlust der spontanen Atmung, gefolgt von Abwesenheit eines Schwanz- oder Pfotenklemmreflexes, zeigt an, dass eine chirurgische Anästhesieebene erreicht wurde (nach 4-5 min).
- Halten Sie die Anästhesie mit 2% Isofluran in Sauerstoff aufrecht.
- Führen Sie eine Myokardinfarktoperation unter einem Operationsmikroskop (10x und 16x Objektiv) durch, wie in16 beschrieben.
- Desinfizieren Sie die Haut mehrmals in kreisenden Bewegungen mit abwechselnden Runden eines jod- oder chlorhexidinbasierten Peelings und 70% Alkohol. Machen Sie mit einer feinen Schere einen horizontalen Hautschnitt zwischen der dritten und vierten Rippe (vierter Interkostalraum) in der linken Seitenwand der Brust. Öffnen Sie den Thorax mit einer feinen Pinzette durch stumpfe Dissektion des Interkostalraums und verwenden Sie einen Retraktor, um den Raum offen zu halten.
- Induzieren Sie einen Myokardinfarkt durch Ligatur der linken Koronararterie nur distal zum linken Vorhofanhang mit 9-0 Polypropylen-Monofilament-Naht. Nach der ~10 min Infarktoperation die Haut mit 7-0 Prolen schließen und den Schnitt mit Betadin desinfizieren. Reinigen Sie den Welpen von Blut mit 70% Ethanol oder Kochsalzlösung.
HINWEIS: Die Ligatur der linken Koronararterie bei vorpubertären Welpen ist im Wesentlichen unblutig, wie es bei erwachsenen Ligaturen der Fall ist. - Verabreichen Sie nacheinander mit einer 0,5-ml-Insulinspritze und einer 29-G-Nadel: Atipamezol (1-5 mg/kg, 10 μL, intraperitoneal) zur schnellen Erholung von Sedierung, Analgesie (Buprenorphin, 0,075 mg/kg, 10 μL, subkutan) und Kochsalzlösung (50 μL, intraperitoneal).
- Lassen Sie die Tiere genesen, indem Sie das Isofluran absetzen. Stellen Sie sicher, dass die spontane Atmung innerhalb weniger Minuten wieder aufgenommen wird.
- Bringen Sie den Welpen in die erwärmte, mit Sauerstoff angereicherte Kammer zurück und überwachen Sie ihn während der Genesung kontinuierlich, bis der Aufrichtreflex wiedererlangt ist, woraufhin der Welpe extubiert wird.
- Reiben Sie den Welpen vorsichtig mit Hauskäfigbettwäsche, halten Sie den Welpen warm, überprüfen Sie, ob die Atmung regelmäßig ist und ob der Welpe zu spontanen Bewegungen fähig ist. Dies wird den postoperativen Kannibalismus durch den Damm reduzieren.
- Bringen Sie den Damm in den Käfig zurück, wenn sich alle Welpen vollständig von der Narkose erholt haben.
HINWEIS: Die Gesamtzeit für die Vorbereitung, Anästhesie, Intubation, Operation und Genesung eines Welpen kann zwischen 40 und 60 Minuten liegen. - Hausmutter und Jungtiere über Nacht in einem Käfig, der halb auf/halb von einem 37 °C warmen Pad platziert wird.
5. Postoperative Beurteilung der Infarktgröße
- Am 3. Tag nach der Operation betäuben Sie die Welpen, indem Sie sie in eine Plexiglaskammer legen, die mit 4,5% Isofluran in Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 ml / min voräquilibriert ist.
- Sobald eine chirurgische Anästhesieebene erreicht wurde (nach 4-5 Minuten), beurteilt durch den Pfotenklemmreflex, nehmen Sie den Welpen aus der Kammer und sichern Sie ihn in Rückenlage auf einem Wärmekissen, indem Sie den Schwanz ankleben.
- Legen Sie einen Faden über die Schneidezähne und das Klebeband in Position, um den Kopf gestreckt zu halten, und legen Sie den Kopf in einen Nasenkegel, der mit einem Beatmungsgerät verbunden ist, das 4,5% Isofluran in Sauerstoff bei 200 μL / Hub, 150 Hübe / min liefert. Halten Sie eine chirurgische Anästhesieebene mit 2% Isofluran in Sauerstoff aufrecht.
- Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer feinen Schere einen 1 cm langen Schnitt in der Haut über der rechten Halsschlagader entlang der Luftröhre und kanülieren Sie das freiliegende Gefäß mit einem einzelnen Lumen-Polyethylenrohr (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm), um 0,2 ml heparinisierte Kochsalzlösung (200 E) für 1 Minute zu verabreichen, um Blutgerinnung zu verhindern.
- Erhöhen Sie Isofluran für 1 Minute auf 4,5% Sauerstoff, bevor Sie innerhalb von 2 s schnell 0,2 ml 3,3 M KCl verabreichen, um das Herz in der Diastole zu stoppen.
- Sezieren Sie die rechte Halsvene über den gleichen Schnitt und transektieren Sie sie. Durchbluten Sie das Herz mit 0,2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und perfusionieren Sie dann mit 0,1 ml 0,2% Alcian Blue, um das nicht infarktartige Fernmyokard zu färben. Überprüfen Sie die erfolgreiche Perfusion, nachgewiesen durch das Auswaschen von Blut, PBS und dann Alcian Blue über die Halsvene.
- Öffnen Sie den Thorax und schneiden Sie das Herz heraus, indem Sie das umgebende Bindegewebe und die Gefäße sezieren, um das Herz freizugeben. Spülen Sie das Herz in PBS, entfernen Sie die Vorhöfe, falls gewünscht, und fotografieren Sie das Herz mit einer Kamera, die auf einem Operationsmikroskop mit einem 10x-Objektiv montiert ist.
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Representative Results
Anästhesie von 10 Tage alten Mäusen. Die 10 Tage alten Welpen können in 4-5 min mit 4,5% Isofluran betäubt werden; Sie erholen sich jedoch von der Anästhesie während der Vorbereitung auf die Intubation. Aufgrund ihrer geringen Größe ist eine Intubation unter Isofluran-Anästhesie durch einen Standard-Nasenkegel nicht durchführbar. Wir haben zuvor ein Ketamin/Xylazin/Atropin-Anästhesieschema von 100/13/0,5 mg/kg für Herz-Thorax-Operationen bei 15- und 21-tägigen Welpen und Erwachsenen 4,7 verwendet. In vorläufigen Experimenten, die eine Sauerstoffsupplementierung beinhalteten, wurde festgestellt, dass das empfohlene injizierbare Regime von 50-150 mg / kg Ketamin und 5-10 mg / kg Xylazin 10 zu einer inakzeptablen Mortalität bei10 Tage alten Welpen führte. Angesichts der inversen Korrelation zwischen Körpergewicht und Wurfgröße von 10 Tage alten Welpen (R2 = 0,250, p < 0,0001; Abbildung 2) titrierten wir das Anästhesieschema nach Körpergewichtsgruppierungen. Die Reduzierung der Ketamin/Xylazin/Atropin-Dosierung auf 50/6/0,18 mg/kg führte zu einer ausreichenden Anästhesietiefe, um eine endotracheale Intubation von spontan atmenden Welpen mit einem Gewicht von 5,5-8,10 g zu ermöglichen (Tabelle 1), aber diese Dosis wurde von leichteren Welpen nicht vertragen. Die Reduzierung der Ketamin/Xylazin/Atropin-Dosierung auf 30/4/0,12 mg/kg ermöglichte die Intubation von Welpen mit einem Gewicht von 4,50-5,49 g, während eine weitere Reduzierung der Ketamindosis auf 20 mg/kg die Intubation von Welpen mit einem Gewicht von 3,15-4,49 g ermöglichte (Tabelle 1). Tabelle 1 zeigt die Anzahl und den Prozentsatz der intubierten Welpen, die operiert wurden; Es ist jedoch schwierig, aus diesen Daten die anästhesiebedingte Mortalität aus der Mortalität zu extrahieren, die mit zu vielen Intubationsversuchen verbunden ist. Um die Verschwendung von Tieren zu reduzieren, haben wir die anästhesiebedingte Mortalität nicht spezifisch quantifiziert.
Intubation von 10 Tage alten Mäusen. Die Ergebnisse waren am besten, wenn die Intubation nach nur ein oder zwei Versuchen erreicht wurde. Welpen mit einem geringeren Körpergewicht waren schwieriger zu intubieren als schwerere Welpen und erforderten mehr Versuche (p < 0,001; Tabelle 1). Das Überleben nach der Intubation korrelierte mit dem Körpergewicht mit 59%, 70% bzw. 80% Überleben für niedrige, mittlere und hochgewichtige Gruppen (R2 = 0,995, p = 0,04; Tabelle 1).
Myokardinfarktchirurgie von 10 Tage alten Mäusen. Welpen wurden 2 Tage nach der Operation überwacht. Es gab keine Anzeichen von Schmerzen nach der Operation. Von den Welpen, die die Nachsorge nach 48 Stunden nicht überlebten (Tabelle 1), starb einer aus der Gruppe mit niedrigem Gewicht 6 Stunden nach der Operation, ein Welpe aus jeder der mittel- und hochgewichtigen Gruppen starb, bevor er wieder mit dem Muttertier eingesetzt wurde, und ein Welpe aus jeder der mittel- und hochgewichtigen Gruppen wurde innerhalb von 16 Stunden nach der Operation vom Muttertier kannibalisiert. mit kleinen Körperteilen oder nichts übrig am nächsten Morgen. Das Überleben 2 Tage nach einer Myokardinfarktoperation war zwischen den verschiedenen Gewichtsgruppen konsistent bei 86%-92% (p = 0,91; Tabelle 1). Das infarktierte Myokard, wie es 2 Tage nach der Operation durch Alcian-blaue Perfusion des Herzens beurteilt wurde, zeigte sich in einer klaren Abgrenzung von gefärbtem, nicht infarktiertem (blau) und ischämischem (ungefärbtem) Gewebe, distal zur Ligatur (Abbildung 1E).
Das Gesamtüberleben für den gesamten Eingriff (Intubation plus Operation) korrelierte mit dem Körpergewicht der Welpen bei 55%, 60% bzw. 70% für niedrige, mittlere und hochgewichtige Gruppen (R2 = 0,978, Tabelle 1), obwohl diese Korrelation keine statistische Signifikanz erreichte (p = 0,09).
Abbildung 1: Endotracheale Intubation eines 10 Tage alten C57BL/6J-Mauswelpen . (A) Intubationsaufbau mit großer Wärmelampe (WL), Intubationsplattform (IP) und flexibler faseroptischer Beleuchtung (FL) zur Visualisierung der Stimmbänder zum Zeitpunkt der Intubation. (B) Pinzette, Laryngoskop, 24-Gauge-Kanüle, die als Endotrachealtubus verwendet wird, und ein Stück Kupferdraht, das über den Luer-Lock-Adapter in den Endotrachealtubus eingeführt wird, um die Kanüle während der Intubation zu versteifen (Maßstabsbalken = 1 cm). (C) Der betäubte Welpe wird in Rückenlage gesichert, indem der Schwanz und die vorderen Gliedmaßen auf die Intubationsplattform geklebt werden (12 cm (L) x 8,5 cm (B) x 7,5 cm (H)). Ein Faden, der über die Schneidezähne gelegt wird, wird verwendet, um den Kopf zu verlängern und in Position zu kleben. (D) Das faseroptische Licht wird über den Hals gelegt, um die Luftröhre direkt unter den Stimmbändern zu transbeleuchten. Die Zunge wird mit einer kleinen Pinzette gehalten, und dann wird die Bewegung der Stimmbänder visualisiert, indem die Stimmritze mit dem Laryngoskop freigelegt wird. Der Endotrachealtubus wird in die Luftröhre eingeführt, während die Stimmbänder offen sind. (E) Foto eines repräsentativen Mäusewelpenherzs, das mit Alcianblau durchblutet ist (Frontalansicht mit der Basis des Herzens oben und der Spitze unten, und Vorhöfe entfernt) 48 h nach der Ligatur (schwarze Naht, schwarzer Pfeil) der linken Koronararterie, aufgenommen unter einem chirurgischen Mikroskop (10x Objektiv), montiert mit einer Kamera. Nicht-infarktes Myokard ist blau gefärbt, infarktiertes Myokard an der Spitze ist ungefärbt und blass; Maßstabsbalken = 100 μm. Diese Zahl wurde von17 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Das Körpergewicht von 10 Tage alten C57BL/6-Welpen korreliert umgekehrt mit der Wurfgröße. Welpen stammten aus Würfen mit einer Größe von 4-10. Die durchschnittliche C57BL/6-Wurfgröße beträgt sieben18. Die Daten wurden durch einfache lineare Regression analysiert, wobei p < 0,05 als signifikant angesehen wurde. Diese Zahl wurde von17 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Anästhesieschema: Ketamin / Xylazin / Atropin (mg / kg); angegeben in 10 ml/g Körpergewicht, ip | Körpergewicht, g | Anzahl der untersuchten Welpen | Intubationsversuche (A, 1-2; B, 3-4 oder C, >4) und Anzahl der intubierten Jungtiere, n (%) | Intubierte Jungtiere, die operiert werden, n (%) | Überleben zwei Tage nach der Operation, n (%) | Gesamtüberleben nach Intubation plus Operation, n (%) | ||
| Ein | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (Chi-Quadrat-Test) | S<0,001 | p=0,91 | ||||||
| R2 (Korrelationskoeffizient, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| p-Wert) | p=0,04 | p=0,09 | ||||||
Tabelle 1: Anästhesieschema, Anzahl der Intubationsversuche und Überleben von 10 Tage alten Mauswelpen nach dem Eingriff. Die Daten wurden mittels Chi-Quadrat-Test analysiert, wobei p < 0,05 als signifikant angesehen wurde.
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Discussion
Derzeit gibt es keine gut dokumentierten Methoden zur Anästhesie und Intubation von 10 Tage alten Mäusen für die Herz-Thorax-Chirurgie. Zu diesem Zweck haben wir Ketamin/Xylazin/Atropin-Dosierungsschemata auf das Körpergewicht titriert, wobei Dosen von 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg und 50/6/0,18 mg/kg die Intubation von Welpen mit niedrigem (3,15-4,49 g), mittlerem (4,50-5,49 g) bzw. hohem (5,50-8,10 g) Körpergewicht erleichterten. Das Überleben nach der Intubation korrelierte mit dem Körpergewicht (59%, 70% bzw. 80% für Gruppen mit niedrigem, mittlerem und hohem Gewicht). Angesichts der Schwierigkeit bei der Intubation von 10 Tage alten Welpen und der damit verbundenen hohen Mortalität empfehlen wir, die Herz-Thorax-Chirurgie bei 10 Tage alten Welpen auf Tiere mit einem Gewicht von mindestens 5,50 g zu beschränken. Eine Einschränkung dieser Intubationstechnik besteht darin, dass sie von den Fähigkeiten und Erfahrungen des Bedieners abhängt und davon, wie schnell er lernen kann. Es wird jedoch erwartet, dass ein in Erwachsenenintubationen erfahrener Operateur nach dem Üben an 10 Würfen mit sieben bis acht Welpen Kenntnisse in der präadoleszenten Intubation erreichen kann. Eine weitere Einschränkung ist, dass das Gesamtüberleben der Welpen nach Intubation und Myokardinfarktchirurgie zwischen 55% (niedrigste Körpergewichtsgruppe) und 70% (höchste Körpergewichtsgruppe) lag. Dies ähnelt jedoch dem 60%-70% Überleben, das für 1 Tag alte Welpen berichtet wurde, die keine Intubation erfordern, wenn sie nach einer Immobilisierung auf Eis einem Myokardinfarkt ausgesetzt sind8.
Wir fanden heraus, dass 10 Tage alte Mauswelpen unterschiedlichen Gewichts eine nichtlineare Reaktion auf das Ketamin / Xylazin / Atropin-Anästhetikum hatten. Dies mag die Entwicklungsunterschiede in einer Reihe wichtiger Bereiche widerspiegeln. Der Grundumsatz skaliert allometrisch zur Dreiviertelpotenz der Masse, von einzelnen Zellen bis zu Säugetieren19. Dies würde die Medikamentendisposition bei den Tieren in der Studie beeinflussen, deren Gewicht um das Zweieinhalbfache variierte. Die Reife des Arzneimittelstoffwechsels oder Entgiftungsmechanismen ist ein weiterer Faktor, der sich in der unmittelbaren postnatalen Phase schnell ändert, ebenso wie Mechanismen, die die Verfügbarkeit freier Medikamente beeinflussen, wie z.B. die Proteinbindung20. Pharmakokinetische Unterschiede sind möglicherweise nicht die einzige Erklärung für nichtlineare Arzneimittelwirkungsbeziehungen, da auch Unterschiede in den pharmakodynamischen Reaktionen auf Beruhigungsmittel möglich sind6. Die Verwendung von Oxygenierung nach intraperitonealer Injektion von Anästhetika und vor der Intubation verbesserte wahrscheinlich die Sicherheit des Verfahrens, wie kürzlich für Erwachsene21 festgestellt wurde. Weitere Anpassungen der Dosis, insbesondere für die niedrigste Körpergewichtsgruppe, können das Überleben verbessern.
Die Tiefe der Anästhesie war entscheidend für eine erfolgreiche Intubation. Die Intubation war schwierig, wenn die Ebene der Anästhesie zu leicht war, und wenn zu tief, hörten die Welpen spontan auf zu atmen, entweder während der Intubation oder nach der Intubation, während sie mit Sauerstoff beatmet wurden. Der Umgang mit Welpen verursachte manchmal auch Atemanhalten, besonders während der Intubation. Wenn die Atmung während der Intubation aufhörte, war die Stimulation des Fußes oder Schwanzes oder die Rückkehr der Welpen in die erwärmte, mit Sauerstoff gefüllte Kammer entscheidend, um die regelmäßige Atmung wiederherzustellen. Die Intubation wurde erneut versucht, als der Welpe wieder normal atmete. Wenn die Atmung nach der Intubation aufhörte, wurden die Tiere bis zu 10 min mit Sauerstoff beatmet. Wenn die spontane Atmung während dieser Zeit wieder aufgenommen wurde, gingen die Tiere zur Operation. Wir fanden jedoch heraus, dass, wenn die spontane Atmung nicht innerhalb dieser Zeit wiederhergestellt wurde, sich die Welpen nicht von der Anästhesie erholten oder, wenn sie einer Operation unterzogen wurden, während der Erholungsphase starben.
Angesichts der hohen Stoffwechselrate von 10 Tage alten Welpen ist es am besten, die Erschöpfung der Energiespeicher zu begrenzen, indem die Mutter so kurz wie möglich von ihren Welpen getrennt wird und somit die Anzahl der chirurgischen Eingriffe auf vier oder fünf Welpen pro Wurf und Tag über einen Zeitraum von maximal 5-6 h begrenzt wird. Um den mütterlichen Kannibalismus von Welpen zu reduzieren, die operiert worden waren, wurden alle Wurfgeschwister, die nicht operiert wurden, zu Pflegemüttern entfernt oder vor der Rückkehr des Muttertiers in den Käfig gekeult. Unsere Handhabungspraktiken zur Senkung der Mortalität durch postoperativen mütterlichen Kannibalismus ähnelten denen, die für Neugeborene berichtet wurden9.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Machbarkeitsstudie darauf hindeutet, dass ein injizierbares Ketamin / Xylazin / Atropin-Anästhetikum, das erheblich niedriger ist als das für ältere Mäuse, erforderlich ist, um die Mortalität durch Intubation von 10 Tage alten Mauswelpen für nachfolgende Herz-Thorax-Operationen zu minimieren, ebenso wie spezifische Handhabungspraktiken zur Verringerung der Mortalität durch Intubation, Operation und postoperativen mütterlichen Kannibalismus.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den NHMRC Program Grant [ID 1074386], ein Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research Grant [RMG] und einen Zuschuss des RT Hall Trust [RMG & SEI] unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
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