Summary
Kardiotorakiska kirurgiska modeller hos möss >7 dagar gamla kräver intubation, men detta är utmanande för preadolescent (8-14 dagar gamla) musungar och det finns lite information om bedövningsregimer för intubation. Här presenterar vi doseringsregimer av ketamin / xylazin / atropin i 10 dagar gamla C57BL / 6J musungar som tillåter endotrakeal intubation, samtidigt som djurdödligheten minimeras.
Abstract
Murina kirurgiska modeller spelar en viktig roll i preklinisk forskning. Mekanistiska insikter om myokardiell regenerering efter hjärtskada kan erhållas från kardiotorakiska kirurgimodeller hos 0-14 dagar gamla möss, vars kardiomyocyter, till skillnad från vuxnas, behåller proliferativ kapacitet. Musvalpar upp till 7 dagar gamla immobiliseras effektivt av hypotermi och kräver inte intubation för kardiotorakisk kirurgi. Preadolescent (8-14 dagar gamla) musungar kräver dock intubation, men detta är utmanande och det finns lite information om anestesi för att underlätta intubation. Här presenterar vi doseringsregimer av ketamin / xylazin / atropin i 10 dagar gamla C57BL / 6J musungar som tillåter endotrakeal intubation, samtidigt som djurdödligheten minimeras. Empirisk titrering av doseringsregimer för ketamin/xylazin/atropin till kroppsvikt indikerade att svaret på anestesi hos musungar med olika vikter var icke-linjärt, varvid doser på 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg och 50/6/0,18 mg/kg underlättade intubation av ungar som väger mellan 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) och 5,50-8,10 g (n = 20), respektive. Valpar med lägre kroppsvikt krävde fler intubationsförsök än tyngre valpar (p < 0,001). Överlevnad efter intubation korrelerade med kroppsvikt (59%, 70% och 80% för låg-, mellan- respektive högviktsgrupper, R2 = 0,995). För hjärtinfarktkirurgi efter intubation inducerades ett kirurgiskt anestesiplan med 4,5% isofluran i 100% syre och bibehölls med 2% isofluran i 100% syre. Överlevnaden efter operationen var liknande för de tre viktgrupperna med 92%, 86% och 88% (p = 0,91). Tillsammans med förbättringar i djurhanteringspraxis för intubation och kirurgi, och minimering av kannibalisering av dammen efter operationen, korrelerade den totala överlevnaden för hela proceduren (intubation plus kirurgi) med kroppsvikt (55%, 60% och 70% för låg-, mellan- och högviktsgrupper, R2 = 0,978). Med tanke på svårigheten med intubation av 10-dagars gamla valpar och den därmed sammanhängande höga dödligheten rekommenderar vi att kardiotorakisk kirurgi hos 10 dagar gamla valpar begränsas till valpar som väger minst 5,5 g.
Introduction
Murinmodeller är ovärderliga verktyg i preklinisk kardiotorakisk forskning, särskilt på grund av den lätthet med vilken genetiskt konstruerade muslinjer kan genereras, och även den lätthet med vilken mössen kan manipuleras kirurgiskt för att tillhandahålla patologiska sjukdomsmodeller för att möjliggöra till exempel studier av myokardiell regenerering efter hjärtskada1 . I detta avseende är det av intresse att, till skillnad från vuxna möss där kardiomyocyter har dragit sig tillbaka från cellcykeln, reparerar 0-2 dagar gamla neonatala mushjärtan med minimal ärrbildning efter apikal resektion eller induktion av hjärtinfarkt 2,3,4. Däremot regenererar 7-dagars gamla neonatalhjärtan ofullständigt med en högre förekomst av ärrbildning 2,3. Eftersom kardiomyocyter i toppen av vänster kammare behåller proliferativ kapacitet i upp till 2 veckor efter födseln kan mekanistiska studier av regenerering efter hjärtskada hos 0-14 dagar gamla möss vara informativa för att identifiera terapeutiska mål för regenerering av det skadade vuxna hjärtat5.
Utvecklingen av musmodeller av hjärtskada innebär kirurgisk manipulation under anestesi. Detta kräver att bröstkorgen öppnas för att komma åt hjärtat, vilket i allmänhet kräver intubation och mekanisk ventilation. Musbelastning, kroppsvikt och ålder påverkar känsligheten för anestetika6. Vuxna möss kan bedövas med ett brett spektrum av medel, en vanlig behandling för intubation är ketamin / xylazin / atropin vid 100/13/0,5 mg / kg 6,7. Neonatala möss (0-7 dagar gamla) saknar en centraliserad smärtreflex och kan effektivt immobiliseras på is och utsättas för operation utan intubation 6,8,9. Preadolescent (8-14 dagar gamla) musungar kan inte bedövas med hypotermi 9,10; De kräver intubation för kardiotorakisk kirurgi. Det finns inga tidigare studier på kardiotorakisk kirurgi hos preadolescenta möss som är yngre än 14 dagar. Enligt vår erfarenhet är intubation av isofluran-bedövade preadolescenta möss under 14 dagar svårt. Den rekommenderade injicerbara bedövningsregimen som rapporterats för möss äldre än 7 dagar är 50-150 mg/kg ketamin och 5-10 mg/kg xylazin10. Preadolescenta möss utvecklas fortfarande neurologiskt och deras svar på läkemedel och läkemedelsmetabolism skiljer sig mycket från vuxna djur6. Detta medför ökad risk för vätske-, elektrolyt- och syra-basobalans, liksom hypoglykemi och hypotermi på grund av inte bara deras höga ämnesomsättning, som snabbt tömmer deras begränsade energilager, utan också på grund av deras termoregulatoriska omogenhet 6,11,12. Således finns det lite information om bedövningsregimer som både underlättar intubation och maximerar överlevnaden av preadolescenta möss.
Här titrerade vi empiriskt doseringsregimer av ketamin / xylazin / atropin hos 10 dagar gamla C57BL / 6J musungar som sträcker sig i vikt från 3-8 g för att uppnå ett anestesiplan som är tillräckligt för att möjliggöra endotrakeal intubation för efterföljande kardiotorakisk kirurgi, samtidigt som djurdödligheten minimeras. Vi förfinade också djurhanteringsmetoder för att minska dödligheten från intubation, kirurgi och postkirurgisk moderns kannibalism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna djurförsök godkändes av Garvan/St Vincent's Hospital Animal Ethics Committee i enlighet med den australiska uppförandekoden för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål och ARRIVE-riktlinjerna, och alla experiment utfördes av en erfaren smådjurskirurg (JW) med vägledning från en pediatrisk narkosläkare (JJS).
1. Beredning av instrument
- På operationsdagen sätter du upp specialutrustning för intubation av 10 dagar gamla valpar (figur 1A,B). Detta inkluderar en uppvärmningslampa, intubationsplattform, fiberoptiskt ljus, små pincett, ett laryngoskop utformat av en bit koppartråd med en diameter på 0,02 mm (60 mm i längd med trådens ände formad till en cirkel med en diameter på 3 mm i en vinkel på 175 °; Figur 1B) och en 24-gauge plast intravenös (i.v.) kanyl, som används som ett endotrakealt rör.
- Se till att kanylen består av en 19 mm lång plastslang (0,7 mm OD) fäst vid en 21 mm kvinnlig luerlåsadapter i plast (figur 1B). Styva upp kanylens slang genom att sätta in en bit koppartråd via luerlåsadaptern. Använd en kanyl med en total volym på 130 μl för en mus med en tidvattenvolym på ~8 μl/g13,14.
2. Anestesi hos 10 dagar gamla möss
- På operationsdagen, ta bort dammen från en bur med 10 dagar gamla C57BL/6J-valpar och placera buren på en värmedyna (37 °C).
- Bedöva ungarna med 10 μL per g intraperitoneal injektion med en 0,5 ml insulinspruta och 29 G nål med ketamin/xylazin/atropin i de förhållanden som beskrivs i tabell 1 för olika viktgrupper.
- Omedelbart efter injektionen, placera valpen i en uppvärmd (37 ° C) plexiglaskammare som har syresatts med 100% syre.
3. Intubation av 10 dagar gamla möss
- Efter 3-4 minuters syresättning, överför valpen till en plattform för intubation i huvudsak som för vuxna möss. Utför detta med valpen i ryggläge (figur 1C) eller upphängd i 45° vinkel15. Håll temperaturen med en uppvärmningslampa.
- Före intubation, bedöma anestesidjupet av tassklämreflexen. För optimal intubation måste tassklämreflexen fortfarande vara närvarande men markant reducerad från ett medvetet djur.
- Efter att ha säkrat den bedövade valpen liggande på en intubationsplattform (figur 1C), håll tungan med små pincett och använd ett laryngoskop utformat av en bit koppartråd (figur 1B) för att exponera glottis och stämband. Hjälp visualisering av stämbanden genom transbelysning med ett flexibelt fiberoptiskt ljus (figur 1D).
- Använd en förstyvad kanyl och luta kanylen så att luerlåsänden är något lägre (~ 10 °) än spetsen, och så snart stämbanden separeras, sätt in kanylen och för den framåt tills luerlåsadaptern är precis utanför munnen. Ta bort tråden omedelbart efter intubation.
OBS: Inget motstånd vid intubation förväntas hos möss i denna ålder om inte kanylen avancerar för långt och motstånd känns från carina.- Bedöm djupet av anestesi efter intubation av djurets förmåga att andas spontant. Bekräfta framgångsrik trakeal intubation av spontant andande valpar genom att kort blockera intubationskatetern för att kontrollera att detta förhindrar bröströrelse.
- Överför omedelbart den intuberade valpen till en värmedyna (37 °C) och anslut den endotrakeala kanylen till en ventilator som levererar 100% syre med en flödeshastighet på 1 L/min med 30 μL/slag, 40 μL/slag eller 50 μL/slag för 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g eller 5,50-8,10 g valpar respektive 150 slag/min.
- Utför dessa procedurer snabbt, inom <15 s för att minimera återandning.
4. Hjärtinfarktkirurgi hos 10 dagar gamla möss
- För att inducera ett kirurgiskt anestesiplan för kirurgi, byt gasen som strömmar in i ventilatorn från 100% syre till 4,5% isofluran i syre (isoflurankoncentrationen bestäms av en förångare) i 4-5min.
- Efter att ha bytt till isofluran, bekräfta trakeal intubation igen genom att kontrollera att frekvensen av bröstväggsrörelse är lika med ventilatorns. Förlust av spontan andning följt av frånvaro av en svans- eller tassnypreflex indikerar att ett kirurgiskt anestesiplan har uppnåtts (efter 4-5 min).
- Behåll anestesi med 2% isofluran i syre.
- Utför hjärtinfarktkirurgi under ett kirurgiskt mikroskop (10x och 16x mål) som beskrivs i16.
- Desinficera huden i en cirkulär rörelse flera gånger med alternerande rundor av en jodbaserad eller klorhexidinbaserad skrubba och 70% alkohol. Använd en fin sax och gör ett horisontellt hudsnitt mellan det tredje och fjärde revbenet (fjärde interkostala utrymmet) i bröstets vänstra sidovägg. Öppna bröstkorgen med fina tångar genom trubbig dissektion av det interkostala utrymmet och använd en retraktor för att hålla utrymmet öppet.
- Inducera ett hjärtinfarkt genom ligering av vänster kranskärl bara distalt till vänster förmaksbihang med 9-0 polypropenmonofilamentsutur. Efter ~10 min infarktoperation, stäng huden med 7-0 prolene och desinficera snittet med betadin. Rengör valpen av blod med 70% etanol eller saltlösning.
OBS: Ligering av vänster kranskärl hos preadolescenta valpar är i huvudsak blodlös, som det är med vuxna ligationer. - Administrera den ena efter den andra med en 0,5 ml insulinspruta och 29 G nål: atipamezol (1-5 mg/kg, 10 μl, intraperitoneal) för snabb återhämtning från sedering, analgesi (buprenorfin, 0,075 mg/kg, 10 μl, subkutant) och saltlösning (50 μl, intraperitoneal).
- Låt djuren återhämta sig genom att avbryta isofluranen. Se till att spontanandningen återupptas inom några minuter därefter.
- Sätt tillbaka valpen till den uppvärmda försyresatta kammaren och övervaka kontinuerligt under återhämtningen tills den rätande reflexen återfås, vid vilken tidpunkt extubera valpen.
- Gnid försiktigt valpen med sängkläder i hemmet, håll valpen varm, kontrollera att andningen är regelbunden och att valpen kan spontan rörelse. Detta kommer att minska kannibalism efter operationen vid dammen.
- Sätt tillbaka dammen i buren när alla valpar har återhämtat sig helt från anestesi.
OBS: Den totala tiden det tar för förberedelse, anestesi, intubation, kirurgi och återhämtning av en valp kan variera från 40-60 min. - Husdamm och valpar över natten i en bur placerad halvt på/hälften av en 37 °C värmedyna.
5. Bedömning av infarktstorlek efter operationen
- På den 3:e dagen efter operationen, bedöva valpar genom att placera dem i en plexiglaskammare som är förbalanserad med 4,5% isofluran i syre vid 1 ml / min flödeshastighet.
- När ett kirurgiskt anestesiplan har uppnåtts (efter 4-5 min), bedömt av tassklämreflexen, ta bort valpen från kammaren och säkra i liggande läge på en uppvärmningsplatta genom att tejpa svansen.
- Placera en tråd över framtänderna och tejpen på plats för att hålla huvudet utsträckt och placera huvudet i en näskotte ansluten till en ventilator som levererar 4,5% isofluran i syre vid 200 μl / slag, 150 slag / min. Behåll ett kirurgiskt anestesiplan med 2% isofluran i syre.
- Desinficera huden med 70% etanol. Använd en fin sax, gör ett snitt på 1 cm i huden över den högra vanliga halspulsådern längs luftstrupen och kannulera det exponerade kärlet med ett enda lumenpolyetenrör (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) för att administrera 0,2 ml hepariniserad saltlösning (200 U) i 1 min för att förhindra blodkoagulering.
- Öka isofluran till 4,5% i syre i 1 min innan du snabbt administrerar 0,2 ml 3,3 M KCl inom 2 s för att stoppa hjärtat i diastol.
- Dissekera den högra halsvenen via samma snitt och transektera den. Genomsmutsa hjärtat med 0,2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och perfusa sedan med 0,1 ml 0,2% Alcian Blue för att fläcka det icke-infarkterade avlägsna myokardiet. Kontrollera framgångsrik perfusion, vilket framgår av tvättning av blod, PBS och sedan Alcian Blue via halsvenen.
- Öppna bröstkorgen och skär ut hjärtat genom att dissekera den omgivande bindväven och kärlen för att frigöra hjärtat. Skölj hjärtat i PBS, ta bort förmaken om så önskas och fotografera hjärtat med en kamera monterad på ett kirurgiskt mikroskop med ett 10x mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anestesi av 10 dagar gamla möss. De10 dagar gamla valparna kan bedövas med 4,5% isofluran på 4-5 minuter; emellertid återhämtar de sig från anestesi i förberedelseprocessen för intubation. På grund av sin lilla storlek är intubation under isoflurananestesi som levereras av en vanlig näskotte inte möjlig. Vi har tidigare använt en ketamin/xylazin/atropinbedövningsregim på 100/13/0,5 mg/kg för kardiotorakisk kirurgi hos 15- och 21-dagarsvalpar respektivevuxna 4,7. I preliminära experiment, som inkluderade syretillskott, fann man att den rekommenderade injicerbara regimen på 50-150 mg / kg ketamin och 5-10 mg / kg xylazin 10 resulterade i en oacceptabel dödlighet hos10 dagar gamla valpar. Med tanke på den omvända korrelationen mellan kroppsvikt och kullstorlek hos 10 dagar gamla valpar (R2 = 0,250, p < 0,0001; Figur 2) titrerade vi bedövningsregimen enligt kroppsviktgrupperingar. Att minska ketamin/xylazin/atropindosen till 50/6/0,18 mg/kg resulterade i ett tillräckligt anestesidjup för att möjliggöra endotrakeal intubation av spontant andande ungar som väger 5,5-8,10 g (tabell 1), men denna dos tolererades inte av lättare ungar. Genom att minska ketamin/xylazin/atropindosen till 30/4/0,12 mg/kg möjliggjordes intubation av ungar som väger 4,50-5,49 g, medan ytterligare reduktion av ketamindosen till 20 mg/kg möjliggjorde intubation av ungar som väger 3,15-4,49 g (tabell 1). Tabell 1 visar antalet och andelen intuberade valpar som fortsatte till operation; Det är dock svårt att extrahera från dessa data anestesirelaterad dödlighet från dödlighet i samband med för många intubationsförsök. För att minska svinnet från djur kvantifierade vi inte specifikt anestesirelaterad dödlighet.
Intubation av 10 dagar gamla möss. Resultaten var bäst när intubation uppnåddes efter bara ett eller två försök. Valpar med lägre kroppsvikt var svårare att intubera än tyngre valpar och krävde fler försök (p < 0,001; Tabell 1). Överlevnad efter intubation korrelerad med kroppsvikt med 59%, 70% och 80% överlevnad för låg-, mellan- och högviktsgrupper respektive (R2 = 0,995, p = 0,04; Tabell 1).
Hjärtinfarktkirurgi hos 10 dagar gamla möss. Valparna övervakades i 2 dagar efter operationen. Det fanns inga tecken på smärta efter operationen. Av de valpar som inte överlevde för uppföljning vid 48 h (tabell 1) dog en från lågviktsgruppen 6 h efter operationen, en valp från var och en av mellan- och högviktsgrupperna dog innan de placerades tillbaka med dammen och en valp från var och en av mellan- och högviktsgrupperna kannibaliserades av dammen inom 16 timmar efter operationen, med små kroppsdelar eller inget kvar nästa morgon. Överlevnad 2 dagar efter hjärtinfarktoperation var konsekvent mellan de olika viktgrupperna vid 86%-92% (p = 0,91; Tabell 1). Infarkterat myokardium, som bedömdes 2 dagar efter operationen av alcian-blå perfusion av hjärtat, var uppenbart genom tydlig avgränsning av färgad, icke-infarkterad (blå) från ischemisk (ofärgad) vävnad, distal till ligeringen (Figur 1E).
Total överlevnad för hela proceduren (intubation plus kirurgi) korrelerade med valpens kroppsvikt vid 55%, 60% respektive 70% för låg-, mellan- och högviktsgrupper (R2 = 0,978, tabell 1), även om denna korrelation inte uppnådde statistisk signifikans (p = 0,09).
Figur 1: Endotrakeal intubation av en 10 dagar gammal C57BL/6J musvalp . (A) Intubationsuppsättning som visar stor uppvärmningslampa (WL), intubationsplattform (IP) och flexibel fiberoptisk belysning (FL) som används för att underlätta visualisering av stämbanden vid intubationstillfället. (B) Tång, laryngoskop, 24-gauge kanyl som används som endotrakealt rör och en bit koppartråd som sätts in i endotrakealröret via luerlåsadaptern för att styva kanylen under intubation (skalstång = 1 cm). (C) Den bedövade valpen säkras liggande genom att tejpa svansen och frambenen på intubationsplattformen (12 cm (L) x 8,5 cm (B) x 7,5 cm (H)). En tråd placerad över snittarna används för att förlänga huvudet och tejpas på plats. (D) Det fiberoptiska ljuset placeras över halsen för att transbelysa luftstrupen strax under stämbanden. Tungan hålls med små pincett, och sedan visualiseras vokalbandens rörelse genom att exponera glottis med laryngoskopet. Endotrakealröret sätts in i luftstrupen medan stämbanden är öppna. (E) Fotografi av ett representativt musvalphjärta perfuserat med Alcian blue (frontal vy med hjärtats bas högst upp och toppen längst ner och förmaken borttagen) 48 h efter ligering (svart sutur, svart pil) av vänster kranskärl taget under ett kirurgiskt mikroskop (10x mål) monterat med en kamera. Icke-infarkt myokardium är färgat blått, infarkt myokardium vid toppen är ostoppat och blekt; skalstreck = 100 μm. Denna siffra har modifierats från17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kroppsvikt hos 10 dagar gamla C57BL/6-valpar är omvänt korrelerad med kullstorlek. Valparna var från kullar som varierade i storlek från 4-10. Den genomsnittliga kullstorleken C57BL/6 är sju18. Data analyserades genom enkel linjär regression, där p < 0,05 ansågs signifikant. Denna siffra har modifierats från17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Anestesiregim: ketamin / xylazin / atropin (mg / kg); ges i 10 ml/g kroppsvikt, ip | Kroppsvikt, g | Antal undersökta ungar | Intubationsförsök (A, 1-2; B, 3-4 eller C, >4) och antal intuberade ungar, n (%) | Intuberade ungar på väg till operation, n (%) | Överlevnad två dagar efter operationen, n (%) | Total överlevnad efter intubation plus kirurgi, n (%) | ||
| A | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (Chi-kvadrattest) | s<0.001 | p=0,91 | ||||||
| R2 (Korrelationskoefficient, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| p-värde) | p=0,04 | p=0,09 | ||||||
Tabell 1: Anestesiregim, antal intubationsförsök och överlevnad efter proceduren för 10 dagar gamla musungar. Data analyserades med Chi-kvadrattest, där p < 0,05 ansågs signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För närvarande finns det inga väldokumenterade metoder för anestesi och intubation av 10 dagar gamla möss för kardiotorakisk kirurgi. För detta ändamål har vi titrerat ketamin / xylazin / atropin doseringsregimer till kroppsvikt, varigenom doser på 20/4/0,12 mg / kg, 30/4/0,12 mg / kg och 50/6 / 0,18 mg / kg underlättade intubation av valpar med låg (3,15-4,49 g), mitten (4,50-5,49 g) respektive hög (5,50-8,10 g) kroppsvikt. Överlevnad efter intubation korrelerade med kroppsvikt (59%, 70% och 80% för låg-, mellan- respektive högviktsgrupper. Med tanke på svårigheten med intubation av 10 dagar gamla valpar och den därmed sammanhängande höga dödligheten rekommenderar vi att kardiotorakisk kirurgi hos 10 dagar gamla valpar begränsas till djur som väger minst 5,50 g. En begränsning med denna intubationsteknik är att den är beroende av operatörens skicklighet och erfarenhet och hur snabbt de kan lära sig. Det förväntas dock att en operatör som har erfarenhet av vuxna intubationer kan uppnå färdigheter i preadolescent intubation efter att ha övat på 10 kullar med sju till åtta valpar. En annan begränsning är att den totala valpöverlevnaden efter intubation och hjärtinfarktkirurgi varierade från 55% (lägsta kroppsviktgrupp) till 70% (högsta kroppsviktgrupp). Ändå liknar detta den 60%-70% överlevnad som rapporterats för 1 dag gamla valpar, som inte kräver någon intubation när de utsätts för hjärtinfarkt efter immobilisering på is8.
Vi fann att 10 dagar gamla musungar med olika vikter hade ett icke-linjärt svar på ketamin / xylazin / atropinbedövningsregimen. Detta kan återspegla utvecklingsskillnaderna inom ett antal viktiga områden. Basal metabolisk hastighet skalas allometriskt till massans trekvartseffekt, från enskilda celler till däggdjur19. Detta skulle påverka läkemedelsdispositionen hos djuren i studien, som varierade i vikt med två och en halv gånger. Mognaden för läkemedelsmetabolism eller avgiftningsmekanismer är en annan faktor som förändras snabbt under den omedelbara postnatala perioden, liksom mekanismer som påverkar tillgången på fria läkemedel, såsom proteinbindning20. Farmakokinetiska skillnader kanske inte är den enda förklaringen till icke-linjära läkemedelseffektsamband, eftersom skillnader i farmakodynamiska svar på lugnande medel också är möjliga6. Användningen av syresättning efter intraperitoneal injektion av anestetika och före intubation förbättrade sannolikt procedurens säkerhet, vilket nyligen har noterats för vuxna21. Ytterligare justeringar i dosering, särskilt för den lägsta kroppsviktgruppen, kan förbättra överlevnaden.
Anestesidjupet var avgörande för framgångsrik intubation. Intubation var svårt om anestesiplanet var för lätt, och om det var för djupt slutade valparna andas spontant, antingen under intubation eller efter intubation medan de ventilerades med syre. Hantering av valpar orsakade också ibland andningshållning, särskilt under intubation. Om andningen slutade under intubation var stimulering av foten eller svansen eller återföring av valpar till den uppvärmda syrefyllda kammaren avgörande för att återställa regelbunden andning. Intubation gjordes om när valpen återupptog regelbunden andning. Om andningen slutade efter intubation ventilerades djuren i upp till 10 minuter med syre. Om spontan andning återupptogs under denna tid fortsatte djuren till operation. Vi fann dock att om spontan andning inte återställdes inom denna tid, återhämtade sig valparna inte från anestesi eller, om de utsattes för operation, dog under återhämtningsperioden.
Med tanke på den höga ämnesomsättningen hos 10 dagar gamla valpar är det bäst att begränsa utarmningen av energilagren genom att separera dammen från sina valpar under så kort tid som möjligt och därmed begränsa antalet kirurgiska operationer till fyra eller fem valpar per kull och dag under en maximal period på 5-6 timmar. För att minska moderns kannibalism hos valpar som hade genomgått operation, togs alla kullkamrater som inte genomgick operation bort till fostermödrar eller avlivades innan dammen återvände till buret. Våra hanteringsmetoder för att minska dödligheten i postkirurgisk moderns kannibalism liknade de som har rapporterats för nyfödda9.
Sammanfattningsvis tyder vår genomförbarhetsstudie på att en injicerbar ketamin / xylazin / atropin bedövningsregim betydligt lägre än den som används för äldre möss krävs för att minimera dödligheten från intubation av 10 dagar gamla musungar för efterföljande kardiotorakisk kirurgi, liksom specifika hanteringsmetoder för att minska dödligheten från intubation, kirurgi och postkirurgisk moderns kannibalism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NHMRC Program Grant [ID 1074386], ett Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research-bidrag [RMG] och ett bidrag från RT Hall Trust [RMG & SEI].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , Elsevier Inc. (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Boston University Institutional Animal Care and Use Committee. Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats. , Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019).
- University of Texas at Austin Animal Resources Center. Mouse-Specific Anesthesia Guidance. , Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019).
- Paddleford, R. Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , Masson. (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 1 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
