Summary
>7 günlük farelerde kardiyotorasik cerrahi modeller entübasyon gerektirir, ancak bu preadolesan (8-14 günlük) fare yavruları için zordur ve entübasyon için anestezik rejimler hakkında çok az bilgi vardır. Burada, 10 günlük C57BL/6J fare yavrularında endotrakeal entübasyona izin verirken hayvan ölümlerini en aza indiren ketamin/ksilazin/atropin dozaj rejimleri sunulmuştur.
Abstract
Murin cerrahi modelleri preklinik araştırmalarda önemli bir rol oynamaktadır. Kardiyak yaralanma sonrası miyokard rejenerasyonuna ilişkin mekanik anlayışlar, kardiyomiyositleri yetişkinlerinkinden farklı olarak proliferatif kapasiteyi koruyan 0-14 günlük farelerde kardiyotorasik cerrahi modellerinden elde edilebilir. 7 güne kadar olan fare yavruları hipotermi ile etkili bir şekilde hareketsiz hale getirilir ve kardiyotorasik cerrahi için entübasyon gerektirmez. Bununla birlikte, ergenlik öncesi (8-14 günlük) fare yavruları entübasyon gerektirir, ancak bu zordur ve entübasyonu kolaylaştırmak için anestezi ile ilgili çok az bilgi vardır. Burada, 10 günlük C57BL/6J fare yavrularında endotrakeal entübasyona izin verirken hayvan ölümlerini en aza indiren ketamin/ksilazin/atropin dozaj rejimleri sunulmuştur. Ketamin / ksilazin / atropin dozaj rejimlerinin vücut ağırlığına ampirik titrasyonunun farklı ağırlıklardaki fare yavrularının anestezisine verilen yanıtın doğrusal olmadığını, bu nedenle 20/4/0.12 mg / kg, 30/4/0.12 mg / kg ve 50/6/0.18 mg / kg'lık dozların, 3.15-4.49 g (n = 22), 4.50-5.49 g (n = 20) ve 5.50-8.10 g (n = 20) arasındaki yavruların entübasyonunu kolaylaştırdığını göstermiştir. sırasıyla. Düşük vücut ağırlığındaki yavrular, daha ağır yavrulardan daha fazla entübasyon girişimi gerektiriyordu (p < 0.001). Entübasyon sonrası sağkalım vücut ağırlığı ile korelasyon gösterdi (düşük, orta ve yüksek ağırlıklı gruplar için sırasıyla% 59,% 70 ve% 80, R2 = 0.995). Entübasyon sonrası miyokard enfarktüsü cerrahisinde %100 oksijende %4.5 izofluran ile cerrahi anestezi düzlemi indüklendi ve %100 oksijende %2 izofluran ile korundu. Ameliyat sonrası sağkalım üç ağırlık grubu için %92, %86 ve %88 olarak benzerdi (p = 0.91). Entübasyon ve cerrahi için hayvan taşıma uygulamalarındaki iyileştirmeler ve ameliyat sonrası baraj tarafından yamyamlaşmanın en aza indirilmesi ile birlikte, tüm prosedür için genel sağkalım (entübasyon artı cerrahi) vücut ağırlığı ile korelasyon gösterdi (düşük, orta ve yüksek ağırlıklı gruplar için sırasıyla% 55,% 60 ve% 70, R2 = 0.978). 10 günlük yavruların entübasyonunda karşılaşılan zorluk ve buna bağlı yüksek mortalite göz önüne alındığında, 10 günlük yavrularda kardiyotorasik cerrahinin en az 5.5 g ağırlığındaki yavrularla sınırlandırılmasını öneriyoruz.
Introduction
Murin modelleri, özellikle genetik olarak tasarlanmış fare çizgilerinin oluşturulabilmesinin kolaylığı ve ayrıca farelerin, örneğin kalp hasarından sonra miyokard rejenerasyonunun incelenmesine izin vermek için patolojik hastalık modelleri sağlamak için cerrahi olarak manipüle edilebilme kolaylığı nedeniyle, klinik öncesi kardiyotorasik araştırmalarda paha biçilmez araçlardır1 . Bu bağlamda, kardiyomiyositlerin hücre döngüsünden çekildiği yetişkin farelerin aksine, 0-2 günlük yenidoğan fare kalplerinin, apikal rezeksiyon veya miyokard enfarktüsü indüksiyonu 2,3,4 sonrası minimum skarlaşma ile onarılması ilgi çekicidir. Buna karşılık, 7 günlük yenidoğan kalpleri eksik rejenere olur ve 2,3 skar insidansı daha yüksektir. Sol ventrikülün tepesindeki kardiyomiyositler doğumdan sonraki 2 haftaya kadar proliferatif kapasiteyi koruduğundan, 0-14 günlük farelerde kalp hasarı sonrası rejenerasyonun mekanik çalışmaları, yaralı yetişkin kalbin rejenerasyonu için terapötik hedeflerin belirlenmesinde bilgilendirici olabilir5.
Kardiyak hasarın fare modellerinin geliştirilmesi, anestezi altında cerrahi manipülasyonu içerir. Bu, toraksın kalbe erişmek için açılmasını gerektirir, bu da genellikle entübasyon ve mekanik ventilasyonu zorunlu kılar. Fare gerginliği, vücut ağırlığı ve yaş, anesteziklere duyarlılığı etkiler6. Yetişkin fareler çok çeşitli ajanlarla uyuşturulabilir, entübasyon için yaygın bir rejim 100/13/0.5 mg / kg 6,7'de ketamin / ksilazin / atropindir. Yenidoğan fareleri (0-7 günlük) merkezi bir ağrı refleksinden yoksundur ve buz üzerinde etkili bir şekilde hareketsiz hale getirilebilir ve entübasyon olmadan ameliyata tabi tutulabilir 6,8,9. Preadolesan (8-14 günlük) fare yavruları hipotermi ile uyuşturulamaz 9,10; kardiyotorasik cerrahi için entübasyon gerektirirler. 14 günden küçük preadolesan farelerde kardiyotorasik cerrahi ile ilgili daha önce yapılmış bir çalışma yoktur. Deneyimlerimize göre, 14 günlük yaşın altındaki izofluran-anestezi uygulanmış preadolesan farelerin entübasyonu zordur. 7 günden büyük fareler için bildirilen önerilen enjekte edilebilir anestezik rejim 50-150 mg / kg ketamin ve 5-10 mg / kg ksilazin10'dur. Preadolesan fareler hala nörolojik olarak gelişmektedir ve ilaçlara ve ilaç metabolizmasına verdikleri yanıtlar yetişkin hayvanlardan çok farklıdır6. Bu, sıvı, elektrolit ve asit-baz dengesizliğinin yanı sıra, yalnızca sınırlı enerji depolarını hızla tüketen yüksek metabolik hızları nedeniyle değil, aynı zamanda termoregülasyon olgunlaşmamışlıkları nedeniyle hipoglisemi ve hipotermi riskini de artırır 6,11,12. Bu nedenle, hem entübasyonu kolaylaştıran hem de ergenlik öncesi farelerin sağkalımını en üst düzeye çıkaran anestezik rejimler hakkında çok az bilgi vardır.
Burada, 10 günlük C57BL/6J fare yavrularında ağırlığı 3-8 g arasında değişen ketamin/ksilazin/atropin dozaj rejimlerini ampirik olarak titre ederek, hayvan ölümlerini en aza indirirken sonraki kardiyotorasik cerrahi için endotrakeal entübasyona izin verecek kadar anestezi düzlemi elde ettik. Ayrıca entübasyon, cerrahi ve ameliyat sonrası maternal yamyamlıktan kaynaklanan mortaliteyi azaltmak için hayvan taşıma uygulamalarını da geliştirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Garvan / St Vincent's Hastanesi Hayvan Etiği Komitesi tarafından, Avustralya Bilimsel Amaçlar İçin Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Uygulama Kuralları ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak onaylanmıştır ve tüm deneyler, bir pediatrik anestezistin (JJS) rehberliğinde deneyimli bir küçük hayvan cerrahı (JW) tarafından gerçekleştirilmiştir.
1. Aletlerin hazırlanması
- Ameliyat gününde, 10 günlük yavruların entübasyonu için özel ekipman kurun (Şekil 1A, B). Buna bir ısıtma lambası, entübasyon platformu, fiber optik ışık, küçük forsepsler, 0.02 mm çapında bakır tel parçasından yapılmış bir laringoskop (telin ucu 175 ° 'lik bir açıyla 3 mm çapında bir daireye biçimlendirilmiş 60 mm uzunluğunda; Şekil 1B) ve endotrakeal tüp olarak kullanılan 24 gauge plastik intravenöz (i.v.) kanül.
- Kanülün, 21 mm plastik dişi luer kilit adaptörüne bağlı 19 mm uzunluğunda bir plastik borudan (0,7 mm OD) oluştuğundan emin olun (Şekil 1B). Luer kilit adaptörü aracılığıyla bir parça bakır tel yerleştirerek kanülün borusunu sertleştirin. Gelgit hacmi ~8 μL/g 13,14 olan bir fare için toplam hacmi130 μL olan bir kanül kullanın.
2. 10 günlük farelerin anestezisi
- Ameliyat gününde, barajı 10 günlük C57BL / 6J yavrularının kafesinden çıkarın ve kafesi bir ısıtma yastığına (37 ° C) yerleştirin.
- Farklı ağırlık gruplamaları için Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanan oranlarda 0.5 mL insülin şırıngası ve ketamin / ksilazin / atropin içeren 29 G iğne kullanarak yavruları g vücut ağırlığı başına 10 μL intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi yapın.
- Enjeksiyondan hemen sonra, yavruyu% 100 oksijen ile önceden oksijenlendirilmiş ısıtılmış (37 ° C) bir pleksiglas odaya yerleştirin.
3. 10 günlük farelerin entübasyonu
- 3-4 dakikalık oksijenasyondan sonra, yavruyu esas olarak yetişkin farelerde olduğu gibi entübasyon için bir platforma aktarın. Bunu, yavru ile sırtüstü pozisyonda (Şekil 1C) veya 45° açı15'te asılı olarak gerçekleştirin. Bir ısıtma lambası ile sıcaklığı koruyun.
- Entübasyondan önce, pençe sıkışma refleksi ile anestezi derinliğini değerlendirin. Optimal entübasyon için, pençe sıkışma refleksi hala mevcut olmalı, ancak bilinçli bir hayvanınkinden belirgin şekilde azaltılmalıdır.
- Anestezi uygulanan yavru köpeği bir entübasyon platformuna sabitledikten sonra (Şekil 1C), dili küçük forsepslerle tutun ve glottis ve ses tellerini açığa çıkarmak için bir bakır tel parçasından (Şekil 1B) yapılmış bir laringoskop kullanın. Ses tellerinin esnek bir fiber optik ışıkla trans-aydınlatma ile görselleştirilmesine yardımcı olur (Şekil 1D).
- Sertleştirilmiş bir kanül kullanarak, kanülü luer kilit ucu uçtan biraz daha düşük (~ 10 °) olacak şekilde eğin ve ses telleri ayrılır ayrılmaz, kanülü takın ve luer kilit adaptörü ağzın hemen dışına çıkana kadar ilerletin. Entübasyondan hemen sonra teli çıkarın.
NOT: Kanül çok ileri gitmedikçe ve karinadan direnç hissedilmedikçe, bu yaştaki farelerde entübasyon sırasında direnç beklenmez.- Entübasyondan sonra anestezi derinliğini, hayvanın kendiliğinden nefes alma kabiliyeti ile değerlendirin. Göğüs hareketini önleyip önlemediğini kontrol etmek için entübasyon kateterini kısaca bloke ederek kendiliğinden nefes alan yavruların başarılı trakeal entübasyonunu onaylayın.
- Entübe edilmiş yavruyu derhal bir ısıtma pedine (37 ° C) aktarın ve endotrakeal kanülü, sırasıyla 30 μL / inme, 40 μL / inme veya 3.15-4.59 g, 4.50-5.49 g veya 5.50-8.10 g yavrular ve 150 vuruş / dak için 50 μL / strok ile 1 L / dak akış hızında% 100 oksijen sağlayan bir ventilatöre bağlayın.
- Yeniden nefes almayı en aza indirmek için bu prosedürleri <15 sn içinde hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
4. 10 günlük farelerin miyokard enfarktüsü cerrahisi
- Ameliyat için cerrahi bir anestezi düzlemini indüklemek için, ventilatöre akan gazı% 100 oksijenden% 4.5 izoflurana (izofluran konsantrasyonu bir buharlaştırıcı tarafından belirlenir) 4-5 dakika boyunca değiştirin.
- İzoflurana geçtikten sonra, göğüs duvarı hareketinin sıklığının ventilatörünkine eşit olduğunu kontrol ederek trakea entübasyonunu tekrar onaylayın. Spontan solunum kaybı ve ardından kuyruk veya pençe sıkışma refleksinin olmaması, cerrahi anestezi düzlemine ulaşıldığını gösterir (4-5 dakika sonra).
- Anesteziyi oksijende% 2 izofluran ile koruyun.
- Miyokard enfarktüsü ameliyatını16'da tarif edildiği gibi cerrahi mikroskop altında (10x ve 16x objektif) gerçekleştirin.
- Cildi dairesel bir hareketle, iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovma ve% 70 alkolün alternatif turlarıyla birkaç kez dezenfekte edin. İnce makas kullanarak, göğsün sol lateral duvarındaki üçüncü ve dördüncü kaburga (dördüncü interkostal boşluk) arasında yatay bir cilt kesisi yapın. İnce forseps kullanarak, interkostal boşluğun künt diseksiyonu ile toraksı açın ve alanı açık tutmak için bir retraktör kullanın.
- Sol koroner arterin sol atriyal apendikte sadece distal olarak 9-0 polipropilen monofilament sütür ile bağlanması ile miyokard enfarktüsü indüklenir. ~ 10 dakikalık enfarktüs ameliyatından sonra, cildi 7-0 prolen ile kapatın ve insizyonu betadin ile dezenfekte edin. Kan yavrusunu% 70 etanol veya salin ile temizleyin.
NOT: Preadolesan yavrularda sol koroner arterin bağlanması, yetişkin ligasyonlarında olduğu gibi esasen kansızdır. - 0.5 mL insülin şırıngası ve 29 G iğne ile birbiri ardına uygulayın: sedasyon, analjezi (buprenorfin, 0.075 mg / kg, 10 μL, subkutanöz) ve salin (50 μL, intraperitoneal) hızlı iyileşme için atipamezol (1-5 mg / kg, 10 μL, intraperitoneal).
- İzofluranı keserek hayvanların iyileşmesine izin verin. Bundan sonra birkaç dakika içinde spontan solunumun devam ettiğinden emin olun.
- Yavruyu ısıtılmış ön oksijenli odaya geri döndürün ve sağ refleks yeniden kazanılana kadar iyileşme sırasında sürekli izleyin, bu noktada yavru ekstübasyon yapın.
- Yavruyu ev kafesi yataklarıyla hafifçe ovalayın, yavruyu sıcak tutun, solunumun düzenli olduğunu ve yavrunun kendiliğinden hareket edebildiğini kontrol edin. Bu, baraj tarafından ameliyat sonrası yamyamlığı azaltacaktır.
- Tüm yavrular anesteziden tamamen kurtulduğunda barajı kafese geri koyun.
NOT: Bir yavrunun hazırlanması, anestezisi, entübasyonu, ameliyatı ve iyileşmesi için geçen toplam süre 40-60 dakika arasında değişebilir. - Ev barajı ve yavrular gece boyunca bir kafeste 37 ° C'lik bir ısıtma yastığının yarısına / yarısına yerleştirilir.
5. Enfarktüs boyutunun ameliyat sonrası değerlendirilmesi
- Ameliyat sonrası 3. günde, yavruları 1 mL / dak akış hızında oksijende% 4.5 izofluran ile önceden dengelenmiş bir pleksiglas odaya yerleştirerek anestezi yapın.
- Cerrahi bir anestezi düzlemine ulaşıldıktan sonra (4-5 dakika sonra), pençe sıkışma refleksi ile değerlendirildiğinde, yavruyu odadan çıkarın ve kuyruğu bantlayarak bir ısıtma pedi üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
- Kesici dişlerin üzerine bir iplik yerleştirin ve kafayı uzatılmış tutmak için bandı yerine yerleştirin ve kafayı, 200 μL / strok, 150 vuruş / dak'da oksijende% 4.5 izofluran sağlayan bir vantilatöre bağlı bir burun konisine yerleştirin. Oksijende% 2 izofluran ile cerrahi bir anestezi düzlemi koruyun.
- Cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin. İnce makas kullanarak, trakea boyunca sağ ortak karotis arter üzerinde deride 1 cm'lik bir kesi yapın ve kanın pıhtılaşmasını önlemek için 1 dakika boyunca 0.2 mL heparinize salin (200 U) uygulamak için tek bir lümen polietilen tüp (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) kullanarak maruz kalan damarı kanüle edin.
- Diyastolde kalbi tutuklamak için 2 s içinde 0.2 mL'lik 3.3 M KCl'yi hızla uygulamadan önce izofluranı 1 dakika boyunca oksijende% 4.5'e yükseltin.
- Sağ juguler veni aynı kesiden diseke edin ve transekte edin. Kalbi 0.2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüze edin ve daha sonra enfarktüssüz uzak miyokardı boyamak için 0.1mL% 0.2 Alcian Blue ile perfüze edin. Kanın, PBS'nin ve daha sonra juguler ven yoluyla Alcian Blue'nun yıkanmasıyla kanıtlanan başarılı perfüzyonu kontrol edin.
- Toraksı açın ve kalbi serbest bırakmak için çevredeki bağ dokusunu ve damarları diseke ederek kalbi eksize edin. Kalbi PBS'de durulayın, istenirse atriyumu çıkarın ve 10x objektif kullanarak cerrahi mikroskop üzerine monte edilmiş bir kamera ile kalbi fotoğraflayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 günlük farelerin anestezisi. 10 günlük yavrular 4-5 dakika içinde% 4.5 izofluran ile uyuşturulabilir; Bununla birlikte, entübasyona hazırlık sürecinde anesteziden kurtulurlar. Küçük boyutları nedeniyle, standart bir burun konisi tarafından verilen izofluran anestezisi altında entübasyon mümkün değildir. Daha önce 15 ve 21 günlük yavrularda ve 4,7 günlük yetişkinlerde kardiyotorasik cerrahi için sırasıyla 100/13/0.5 mg/kg'lık bir ketamin/ksilazin/atropin anestezik rejimi kullanmıştık. Oksijen takviyesini içeren ön deneylerde, önerilen 50-150 mg / kg ketamin ve 5-10 mg / kg ksilazin 10 enjekte edilebilir rejiminin10 günlük yavrularda kabul edilemez bir mortalite ile sonuçlandığı bulunmuştur. 10 günlük yavruların vücut ağırlığı ile çöp büyüklüğü arasındaki ters korelasyon göz önüne alındığında (R2 = 0.250, p < 0.0001; Şekil 2), anestezik rejimi vücut ağırlığı gruplamalarına göre titre ettik. Ketamin / ksilazin / atropin dozajının sırasıyla 50/6 / 0.18 mg / kg'a düşürülmesi, 5.5-8.10 g ağırlığındaki kendiliğinden nefes alan yavruların endotrakeal entübasyonunu sağlamak için yeterli anestezi derinliği ile sonuçlandı (Tablo 1), ancak bu doz daha hafif yavrular tarafından tolere edilmedi. Ketamin / ksilazin / atropin dozajının sırasıyla 30/4 / 0.12 mg / kg'a düşürülmesi, 4.50-5.49 g ağırlığındaki yavruların entübasyonunu sağlarken, ketamin dozajının 20 mg / kg'a düşürülmesi, 3.15-4.49 g ağırlığındaki yavruların entübasyonunu sağlamıştır (Tablo 1). Tablo 1, ameliyata devam eden entübe edilmiş yavruların sayısını ve yüzdesini göstermektedir; ancak anesteziye bağlı mortaliteyi bu verilerden çok fazla entübasyon girişimi ile ilişkili mortaliteden çıkarmak zordur. Hayvan israfını azaltmak amacıyla, anesteziye bağlı mortaliteyi spesifik olarak ölçmedik.
10 günlük farelerin entübasyonu. Entübasyon sadece bir veya iki denemeden sonra elde edildiğinde sonuçlar en iyisiydi. Daha düşük vücut ağırlığına sahip yavruların entübe edilmesi daha ağır yavrulara göre daha zordu ve daha fazla girişim gerektiriyordu (p < 0.001; Tablo 1). Entübasyon sonrası sağkalım düşük, orta ve yüksek ağırlıklı gruplar için sırasıyla %59, %70 ve %80 sağkalım ile vücut ağırlığı ile korelasyon gösterdi (R2 = 0.995, p = 0.04; Tablo 1).
10 günlük farelerin miyokard enfarktüsü ameliyatı. Yavrular ameliyattan sonra 2 gün boyunca izlendi. Ameliyat sonrası ağrı belirtisi yoktu. 48 saatte takibe kadar hayatta kalamayan yavrulardan (Tablo 1), düşük kilolu gruptan biri ameliyattan 6 saat sonra öldü, orta ve yüksek kilolu grupların her birinden bir yavru kuzu baraja geri yerleştirilmeden önce öldü ve orta ve yüksek ağırlıklı grupların her birinden bir yavru ameliyattan sonraki 16 saat içinde baraj tarafından yamyamlaştırıldı, küçük vücut parçaları veya ertesi sabah hiçbir şey kalmadan. Miyokard enfarktüsü ameliyatından 2 gün sonra sağkalım %86-%92 arasında farklı ağırlık grupları arasında tutarlıydı (p=0.91; Tablo 1). Enfarktüslü miyokard, ameliyattan 2 gün sonra kalbin Alcian-mavi perfüzyonu ile değerlendirildiği gibi, lekeli, enfarktüssüz (mavi) dokudan iskemik (lekesiz) dokudan, ligasyona distal olarak net bir şekilde sınırlandırılmasıyla belirgindi (Şekil 1E).
Tüm prosedür için genel sağkalım (entübasyon artı cerrahi), düşük, orta ve yüksek ağırlıklı gruplar için sırasıyla %55, %60 ve %70 oranında yavru vücut ağırlığı ile korelasyon gösterdi (R2 = 0.978, Tablo 1), ancak bu korelasyon istatistiksel anlamlılık elde edemedi (p = 0.09).
Şekil 1: 10 günlük bir C57BL/6J fare yavrusunun endotrakeal entübasyonu . (A) Entübasyon sırasında ses tellerinin görselleştirilmesine yardımcı olmak için kullanılan büyük ısınma lambası (WL), entübasyon platformu (IP) ve esnek fiber optik aydınlatma (FL) gösteren entübasyon kurulumu. (B) Forseps, laringoskop, endotrakeal tüp olarak kullanılan 24 gauge kanül ve entübasyon sırasında kanülü sertleştirmek için luer kilit adaptörü aracılığıyla endotrakeal tüpe yerleştirilen bir bakır tel parçası (ölçek çubuğu = 1 cm). (C) Anestezi uygulanan yavru, kuyruğu ve ön bacakları entübasyon platformuna (12 cm (L) x 8,5 cm (G) x 7,5 cm (Y)) bantlanarak sırtüstü sabitlenir. Kesici dişlerin üzerine yerleştirilen bir iplik, kafayı uzatmak için kullanılır ve pozisyonda bantlanır. (D) Fiber optik ışık, ses tellerinin hemen altındaki trakeayı trans-aydınlatmak için boynun üzerine yerleştirilir. Dil küçük forsepslerle tutulur ve daha sonra glottisin laringoskopla açığa çıkarılmasıyla ses tellerinin hareketi görselleştirilir. Ses telleri açıkken endotrakea tüpü trakeaya sokulur. (E) Sol koroner arterin 48 saat sonrası ligasyonu (siyah sütür, siyah ok) ile Alcian mavisi (üstte kalbin tabanı ve altta tepe noktası ve atriyumu çıkarılmış olarak önden görünüm) ile perfüze edilmiş temsili bir fare yavrusu kalbinin fotoğrafı, bir kamera ile monte edilmiş cerrahi mikroskop (10x objektif) altında çekilmiştir. Enfarktüssüz miyokard maviye boyanır, tepedeki enfarktüslü miyokard lekesiz ve soluktur; ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam17'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 10 günlük C57BL/6 yavrularının vücut ağırlığı, çöp büyüklüğü ile ters orantılıdır. Yavrular, 4-10 arasında değişen büyüklükte litrelerdendi. Ortalama C57BL/6 çöp boyutu yedi18'dir. Veriler basit doğrusal regresyon ile analiz edilmiş, p < 0.05 anlamlı kabul edilmiştir. Bu rakam17'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Anestezi rejimi: ketamin / ksilazin / atropin (mg / kg); 10 mL/g vücut ağırlığında verilir, ip | Vücut ağırlığı, g | İncelenen yavru sayısı | Entübasyon girişimleri (A, 1-2; B, 3-4 veya C, >4) ve entübe edilen yavru sayısı, n (%) | Entübe yavrular ameliyata devam ederken, n (%) | Ameliyat sonrası iki gün sağkalım, n (%) | Entübasyon artı cerrahi sonrası genel sağkalım, n (%) | ||
| A | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (Ki-kare testi) | s<0.001 | p=0,91 | ||||||
| R2 (Korelasyon katsayısı, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| p değeri) | p=0,04 | p=0,09 | ||||||
Tablo 1: Anestezi rejimi, entübasyon girişimi sayısı ve 10 günlük fare yavrularının işlem sonrası sağkalımı. Veriler Ki-kare testi ile analiz edildi ve p < 0.05 anlamlı kabul edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şu anda, kardiyotorasik cerrahi için 10 günlük farelerin anestezisi ve entübasyonu için iyi belgelenmiş bir yöntem yoktur. Bu amaçla, ketamin / ksilazin / atropin dozaj rejimlerini vücut ağırlığına göre titre ettik, böylece sırasıyla 20/4/0.12 mg / kg, 30/4/0.12 mg / kg ve 50/6/0.18 mg / kg'lık dozlar, düşük (3.15-4.49 g), orta (4.50-5.49 g) ve yüksek (5.50-8.10 g) vücut ağırlığına sahip yavruların entübasyonunu kolaylaştırdı. Entübasyon sonrası sağkalım vücut ağırlığı ile korelasyon gösterdi (düşük, orta ve yüksek ağırlıklı gruplar için sırasıyla% 59,% 70 ve% 80). 10 günlük yavruların entübasyonunda karşılaşılan zorluk ve buna bağlı yüksek mortalite göz önüne alındığında, 10 günlük yavrularda kardiyotorasik cerrahinin en az 5.50 g ağırlığındaki hayvanlarla sınırlı olmasını öneriyoruz. Bu entübasyon tekniğinin bir sınırlaması, operatörün beceri ve deneyimine ve ne kadar çabuk öğrenebileceklerine bağlı olmasıdır. Bununla birlikte, yetişkin entübasyonlarında deneyimli bir operatörün, yedi ila sekiz yavrudan oluşan 10 litre üzerinde pratik yaptıktan sonra ergenlik öncesi entübasyonda yeterlilik kazanabileceği tahmin edilmektedir. Diğer bir sınırlama ise, entübasyon ve miyokard enfarktüsü cerrahisinden sonra genel yavru sağkalımının% 55 (en düşük vücut ağırlığı grubu) ile% 70 (en yüksek vücut ağırlığı grubu) arasında değişmesidir. Bununla birlikte, bu, buz8'de immobilizasyondan sonra miyokard enfarktüsüne maruz kaldığında entübasyon gerektirmeyen 1 günlük yavrular için bildirilen % 60-70 sağkalıma benzer.
Farklı ağırlıklardaki 10 günlük fare yavrularının ketamin / ksilazin / atropin anestezik rejimine doğrusal olmayan bir yanıt verdiğini bulduk. Bu, bir dizi önemli alandaki gelişimsel farklılıkları yansıtabilir. Bazal metabolizma hızı, tek hücrelerden memelilere kadar kütlenin dörtte üçlük gücüne allometrik olarak ölçeklenir19. Bu, çalışmadaki hayvanlarda, ağırlıkça iki buçuk kat değişen ilaç eğilimini etkileyecektir. İlaç metabolizmasının veya detoksifikasyon mekanizmalarının olgunluğu, protein bağlama20 gibi serbest ilaç mevcudiyetini etkileyen mekanizmalar gibi, doğum sonrası dönemde hızla değişen başka bir faktördür. Farmakokinetik farklılıklar, doğrusal olmayan ilaç-etki ilişkilerinin tek açıklaması olmayabilir, çünkü sedatif ajanlara farmakodinamik yanıtlardaki farklılıklar da mümkündür6. İntraperitoneal anestezik enjeksiyonundan sonra ve entübasyondan önce oksijenasyon kullanımı, son zamanlarda yetişkinler21 için belirtildiği gibi, prosedürün güvenliğini muhtemelen arttırmıştır. Özellikle en düşük vücut ağırlığı grubu için dozajda daha fazla ayarlama, hayatta kalmayı artırabilir.
Başarılı entübasyon için anestezi derinliği kritik öneme sahipti. Entübasyon anestezi düzlemi çok hafifse ve çok derinse, yavrular entübasyon sırasında veya entübasyondan sonra oksijenle havalandırılırken kendiliğinden nefes almayı bıraktı. Yavruların taşınması da bazen özellikle entübasyon sırasında nefes tutmaya neden oldu. Entübasyon sırasında solunum durduysa, ayağın veya kuyruğun uyarılması veya yavruların ısıtılmış oksijen dolu odaya geri dönmesi, düzenli nefes almayı sağlamak için kritik öneme sahipti. Entübasyon, yavru düzenli nefes almaya devam ettiğinde tekrar denendi. Entübasyondan sonra solunum durduysa, hayvanlar oksijenle 10 dakikaya kadar havalandırıldı. Bu süre zarfında spontan solunum devam ederse, hayvanlar ameliyata devam etti. Bununla birlikte, spontan solunum bu süre içinde restore edilmezse, yavruların anesteziden iyileşmediğini veya ameliyata tabi tutulursa iyileşme döneminde öldüğünü bulduk.
10 günlük yavruların yüksek metabolik hızı göz önüne alındığında, barajı yavrularından mümkün olduğunca kısa bir süre ayırarak ve böylece cerrahi operasyon sayısını maksimum 5-6 saatlik bir süre boyunca çöp başına dört veya beş yavru ile sınırlayarak enerji depolarının tükenmesini sınırlamak en iyisidir. Ameliyat geçiren yavruların anne yamyamlığını azaltmak için, ameliyat edilmeyen çöp arkadaşları anneleri beslemek için çıkarıldı veya barajın kafese geri dönmesinden önce itlaf edildi. Ameliyat sonrası maternal yamyamlıktan kaynaklanan mortaliteyi azaltmaya yönelik uygulamalarımız, yenidoğanlar için bildirilenlere benzerdi9.
Sonuç olarak, fizibilite çalışmamız, entübasyon, cerrahi ve ameliyat sonrası maternal yamyamlıktan kaynaklanan mortaliteyi azaltmak için 10 günlük fare yavrularının entübasyonundan mortaliteyi en aza indirmek için yaşlı fareler için kullanılandan oldukça düşük enjekte edilebilir bir ketamin / ksilazin / atropin anestezik rejiminin gerekli olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, NHMRC Program Grant [ID 1074386], Leducq Transatlantik Kardiyovasküler Araştırmalarda Mükemmellik Ağı hibesi [RMG] ve RT Hall Trust [RMG & SEI] tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , Elsevier Inc. (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Boston University Institutional Animal Care and Use Committee. Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats. , Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019).
- University of Texas at Austin Animal Resources Center. Mouse-Specific Anesthesia Guidance. , Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019).
- Paddleford, R. Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , Masson. (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 1 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
