Summary
Cardiothoracale chirurgische modellen bij muizen >7 dagen oud vereisen intubatie, maar dit is een uitdaging voor preadolescente (8-14 dagen oude) muispups en er is weinig informatie over anesthetische regimes voor intubatie. Hier presenteren we doseringsschema's van ketamine / xylazine / atropine in 10 dagen oude C57BL / 6J-muispups die endotracheale intubatie mogelijk maken, terwijl de diersterfte wordt geminimaliseerd.
Abstract
Murine chirurgische modellen spelen een belangrijke rol in preklinisch onderzoek. Mechanistische inzichten in myocardiale regeneratie na hartletsel kunnen worden verkregen uit cardiothoracale operatiemodellen bij 0-14 dagen oude muizen, waarvan de cardiomyocyten, in tegenstelling tot die van volwassenen, proliferatieve capaciteit behouden. Muizenpups tot 7 dagen oud worden effectief geïmmobiliseerd door onderkoeling en hebben geen intubatie nodig voor cardiothoracale chirurgie. Preadolescente (8-14 dagen oude) muispups hebben echter wel intubatie nodig, maar dit is een uitdaging en er is weinig informatie over anesthesie om intubatie te vergemakkelijken. Hier presenteren we doseringsschema's van ketamine / xylazine / atropine in 10 dagen oude C57BL / 6J-muispups die endotracheale intubatie mogelijk maken, terwijl de diersterfte wordt geminimaliseerd. Empirische titratie van ketamine/xylazine/atropine doseringsschema's op lichaamsgewicht gaf aan dat de respons op anesthesie van muizenjongen met verschillende gewichten niet-lineair was, waarbij doses van 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg en 50/6/0,18 mg/kg de intubatie van pups met een gewicht tussen 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) en 5,50-8,10 g (n = 20) vergemakkelijkten, respectievelijk. Pups met een lager lichaamsgewicht hadden meer intubatiepogingen nodig dan zwaardere pups (p < 0,001). Overleving na intubatie correleerde met lichaamsgewicht (59%, 70% en 80% voor groepen met een laag, midden en hoog gewicht, respectievelijk R2 = 0,995). Voor myocardinfarctchirurgie na intubatie werd een chirurgisch anesthesievlak geïnduceerd met 4,5% isofluraan in 100% zuurstof en onderhouden met 2% isofluraan in 100% zuurstof. De overleving na de operatie was vergelijkbaar voor de drie gewichtsgroepen met 92%, 86% en 88% (p = 0,91). Samen met verfijningen in dierbehandelingspraktijken voor intubatie en chirurgie, en het minimaliseren van kannibalisatie door de moeder na de operatie, correleerde de totale overleving voor de hele procedure (intubatie plus chirurgie) met het lichaamsgewicht (55%, 60% en 70% voor groepen met een laag, midden en hoog gewicht, respectievelijk R2 = 0,978). Gezien de moeilijkheden bij intubatie van 10 dagen oude pups en de bijbehorende hoge mortaliteit, raden wij aan om cardiothoracale chirurgie bij 10 dagen oude pups te beperken tot pups met een gewicht van ten minste 5,5 g.
Introduction
Muizenmodellen zijn van onschatbare waarde in preklinisch cardiothoracaal onderzoek, met name vanwege het gemak waarmee genetisch gemanipuleerde muislijnen kunnen worden gegenereerd, en ook het gemak waarmee de muizen chirurgisch kunnen worden gemanipuleerd om pathologische ziektemodellen te bieden om bijvoorbeeld de studie van myocardiale regeneratie na hartletsel mogelijk te maken1 . In dit verband is het van belang dat, in tegenstelling tot volwassen muizen waarbij cardiomyocyten zich uit de celcyclus hebben teruggetrokken, 0-2 dagen oude neonatale muizenharten herstellen met minimale littekens na apicale resectie of inductie van myocardinfarct 2,3,4. Daarentegen regenereren 7 dagen oude neonatale harten onvolledig met een hogere incidentie van littekens 2,3. Aangezien cardiomyocyten in de top van de linker ventrikel tot 2 weken na de geboorte proliferatieve capaciteit behouden, kunnen mechanistische studies van regeneratie na hartletsel bij 0-14 dagen oude muizen informatief zijn voor het identificeren van therapeutische doelen voor regeneratie van het gewonde volwassen hart5.
De ontwikkeling van muismodellen van hartletsel omvat chirurgische manipulatie onder anesthesie. Dit vereist dat de thorax wordt geopend om toegang te krijgen tot het hart, dat over het algemeen intubatie en mechanische ventilatie verplicht stelt. Muizenspanning, lichaamsgewicht en leeftijd beïnvloeden de gevoeligheid voor anesthetica6. Volwassen muizen kunnen worden verdoofd met een breed scala aan middelen, een gemeenschappelijk regime voor intubatie is ketamine / xylazine / atropine bij 100/13/0,5 mg / kg 6,7. Neonatale muizen (0-7 dagen oud) missen een gecentraliseerde pijnreflex en kunnen effectief worden geïmmobiliseerd op ijs en worden onderworpen aan een operatie zonder intubatie 6,8,9. Preadolescente (8-14 dagen oude) muispups kunnen niet worden verdoofd met onderkoeling 9,10; ze vereisen intubatie voor cardiothoracale chirurgie. Er zijn geen eerdere studies over cardiothoracale chirurgie bij preadolescente muizen jonger dan 14 dagen oud. In onze ervaring is intubatie van isofluraan-verdoofde preadolescente muizen jonger dan 14 dagen moeilijk. Het aanbevolen injecteerbare anestheticum dat wordt gerapporteerd voor muizen ouder dan 7 dagen is 50-150 mg / kg ketamine en 5-10 mg / kg xylazine10. Preadolescente muizen ontwikkelen zich nog steeds neurologisch en hun reacties op medicijnen en medicijnmetabolisme zijn heel anders dan bij volwassen dieren6. Dit vormt een verhoogd risico op vocht-, elektrolyt- en zuur-base-onbalans, evenals hypoglykemie en hypothermie vanwege niet alleen hun hoge stofwisseling, die hun beperkte energievoorraden snel uitput, maar ook vanwege hun thermoregulerende onvolwassenheid 6,11,12. Er is dus weinig informatie over anesthetische regimes die zowel intubatie vergemakkelijken als de overleving van preadolescente muizen maximaliseren.
Hier hebben we empirisch doseringsschema's van ketamine / xylazine / atropine getitreerd in 10-dagen oude C57BL / 6J-muispups variërend in gewicht van 3-8 g om een niveau van anesthesie te bereiken dat voldoende is om endotracheale intubatie mogelijk te maken voor daaropvolgende cardiothoracale chirurgie, terwijl de diersterfte wordt geminimaliseerd. We hebben ook de behandelingspraktijken voor dieren verfijnd om de mortaliteit door intubatie, chirurgie en postoperatief kannibalisme van de moeder te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Garvan / St Vincent's Hospital Animal Ethics Committee in overeenstemming met de Australische praktijkcode voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en de ARRIVE-richtlijnen, en alle experimenten werden uitgevoerd door een ervaren kleine dierenchirurg (JW) met begeleiding van een pediatrische anesthesist (JJS).
1. Voorbereiding van instrumenten
- Stel op de dag van de operatie gespecialiseerde apparatuur in voor intubatie van 10 dagen oude pups (figuur 1A, B). Dit omvat een warmtelamp, intubatieplatform, glasvezellicht, kleine tang, een laryngoscoop gevormd uit een stuk koperdraad met een diameter van 0,02 mm (60 mm lang met het uiteinde van de draad gevormd in een cirkel met een diameter van 3 mm onder een hoek van 175 °; Figuur 1B), en een 24-gauge plastic intraveneuze (i.v.) canule, die wordt gebruikt als een endotracheale buis.
- Zorg ervoor dat de canule bestaat uit een 19 mm lange plastic buis (0,7 mm OD) bevestigd aan een 21 mm plastic vrouwelijke luerslotadapter (figuur 1B). Verstijf de slang van de canule door een stuk koperdraad in te brengen via de luerslotadapter. Gebruik een canule met een totaal volume van 130 μL voor een muis met een getijdenvolume van ~8 μL/g13,14.
2. Anesthesie van 10 dagen oude muizen
- Verwijder op de dag van de operatie de moeder uit een kooi van 10 dagen oude C57BL/6J pups en plaats de kooi op een opwarmkussen (37 °C).
- Anesthetiseer pups met 10 μL per g lichaamsgewicht intraperitoneale injectie met behulp van een insulinespuit van 0,5 ml en een naald van 29 g met ketamine/xylazine/atropine in de verhoudingen die in tabel 1 voor verschillende gewichtsgroepen zijn beschreven.
- Plaats de pup onmiddellijk na de injectie in een verwarmde (37 °C) plexiglas kamer die is voorgeoxygeneerd met 100% zuurstof.
3. Intubatie van 10 dagen oude muizen
- Breng de pup na 3-4 minuten oxygenatie over naar een platform voor intubatie, in wezen zoals voor volwassen muizen. Voer dit uit met de pup in rugligging (figuur 1C) of opgehangen in een hoek van 45°15. Houd de temperatuur op peil met een opwarmlamp.
- Beoordeel vóór intubatie de diepte van de anesthesie door de pootknijpreflex. Voor een optimale intubatie moet de pootknijflex nog steeds aanwezig zijn, maar duidelijk verminderd ten opzichte van die van een bewust dier.
- Nadat u de verdoofde pup hebt vastgezet aan een intubatieplatform (figuur 1C), houdt u de tong vast met een kleine tang en gebruikt u een laryngoscoop gemaakt van een stuk koperdraad (figuur 1B) om de glottis en stembanden bloot te leggen. Help de visualisatie van de stembanden door transverlichting met een flexibel glasvezellicht (figuur 1D).
- Gebruik een verstijfde canule om de canule zo te kantelen dat het luerslotuiteinde iets lager is (~ 10 °) dan de punt, en zodra de stembanden scheiden, plaatst u de canule en schuift u deze naar voren totdat de luerslotadapter zich net buiten de mond bevindt. Verwijder de draad onmiddellijk na intubatie.
OPMERKING: Er wordt geen resistentie tijdens intubatie verwacht bij muizen van deze leeftijd, tenzij de canule te ver gevorderd is en weerstand wordt gevoeld vanuit de carina.- Beoordeel de diepte van de anesthesie na intubatie door het vermogen van het dier om spontaan te ademen. Bevestig succesvolle tracheale intubatie van spontaan ademende pups door de intubatiekatheter kort te blokkeren om te controleren of dit beweging van de borst voorkomt.
- Breng de geïntubeerde pup onmiddellijk over naar een opwarmkussen (37 °C) en sluit de endotracheale canule aan op een ventilator die 100% zuurstof levert met een stroomsnelheid van 1 L/min met respectievelijk 30 μL/slag, 40 μL/beroerte, of 50 μL/beroerte gedurende respectievelijk 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g of 5,50-8,10 g pups en 150 slagen/min.
- Voer deze procedures snel uit, binnen <15 s om het opnieuw ademen te minimaliseren.
4. Myocardinfarctchirurgie bij 10 dagen oude muizen
- Om een chirurgisch anesthesievlak voor een operatie te induceren, schakelt u het gas dat in de ventilator stroomt van 100% zuurstof naar 4,5% isofluraan in zuurstof (de isofluraanconcentratie wordt bepaald door een verdamper) gedurende 4-5 minuten.
- Nadat u bent overgeschakeld op isofluraan, bevestigt u de tracheale intubatie opnieuw door te controleren of de frequentie van de beweging van de borstwand gelijk is aan die van de ventilator. Verlies van spontane ademhaling gevolgd door afwezigheid van een staart- of pootknijpreflex geeft aan dat een chirurgisch niveau van anesthesie is bereikt (na 4-5 minuten).
- Onderhoud anesthesie met 2% isofluraan in zuurstof.
- Voer een hartinfarctoperatie uit onder een chirurgische microscoop (10x en 16x objectief) zoals beschreven in16.
- Desinfecteer de huid meerdere keren in een cirkelvormige beweging met afwisselende rondes van een scrub op basis van jodium of chloorhexidine en 70% alcohol. Maak met behulp van een fijne schaar een horizontale huidincisie tussen de derde en vierde rib (vierde intercostale ruimte) in de linker laterale wand van de borst. Gebruik een fijne tang om de thorax te openen door stompe dissectie van de intercostale ruimte en gebruik een retractor om de ruimte open te houden.
- Induceer een myocardinfarct door ligatie van de linker kransslagader net distale aan het linker atriale aanhangsel met 9-0 polypropyleen monofilament hechting. Sluit na de infarctoperatie van ~ 10 minuten de huid met 7-0 prolene en desinfecteer de incisie met betadine. Reinig de pup van bloed met 70% ethanol of zoutoplossing.
OPMERKING: Ligatie van de linker kransslagader bij preadolescente pups is in wezen bloedeloos, net als bij volwassen ligaties. - Dien elkaar toe met een insulinespuit van 0,5 ml en een naald van 29 g: atipamezole (1-5 mg/kg, 10 μL, intraperitoneaal) voor snel herstel van sedatie, analgesie (buprenorfine, 0,075 mg/kg, 10 μL, subcutaan) en zoutoplossing (50 μL, intraperitoneaal).
- Laat dieren herstellen door de isofluraan te staken. Zorg ervoor dat spontane ademhaling binnen enkele minuten daarna wordt hervat.
- Breng de pup terug naar de verwarmde voorgeoxygeneerde kamer en controleer continu tijdens het herstel totdat de rechtzettingsreflex is herwonnen, waarna de pup wordt geëxtubeerd.
- Wrijf de pup voorzichtig in met het strooisel van de thuiskooi, houd de pup warm, controleer of de ademhaling regelmatig is en of de pup in staat is tot spontane beweging. Dit zal het kannibalisme na de operatie door de moeder verminderen.
- Breng de moeder terug naar de kooi wanneer alle pups volledig hersteld zijn van de anesthesie.
OPMERKING: De totale tijd die nodig is voor voorbereiding, anesthesie, intubatie, chirurgie en herstel van één pup kan variëren van 40-60 minuten. - Huismoeder en pups overnachten in een kooi half op/half van een 37 °C opwarmpad geplaatst.
5. Postoperatieve beoordeling van de grootte van het infarct
- Op de3e dag na de operatie verdoven pups door ze in een plexiglas kamer te plaatsen die vooraf in evenwicht is gebracht met 4,5% isofluraan in zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 ml / min.
- Zodra een chirurgisch niveau van anesthesie is bereikt (na 4-5 minuten), beoordeeld door de pootknijflex, verwijdert u de pup uit de kamer en bevestigt u zich in rugligging op een verwarmend pad door de staart te tapen.
- Plaats een draad over de snijtanden en tape in positie om de kop uitgestrekt te houden en plaats de kop in een neuskegel die is aangesloten op een ventilator die 4,5% isofluraan aan zuurstof levert bij 200 μL / slag, 150 slagen / min. Onderhoud een chirurgisch vlak van anesthesie met 2% isofluraan in zuurstof.
- Desinfecteer de huid met 70% ethanol. Maak met een fijne schaar een incisie van 1 cm in de huid over de rechter gemeenschappelijke halsslagader langs de luchtpijp en kan het blootgestelde vat met behulp van een polyethyleenbuis met één lumen (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) om 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing (200 U) gedurende 1 minuut toe te dienen om bloedstolling te voorkomen.
- Verhoog isofluraan tot 4,5% in zuurstof gedurende 1 minuut voordat u snel 0,2 ml 3,3 M KCl binnen 2 s toedient om het hart in diastole te stoppen.
- Ontleed de rechter halsader via dezelfde incisie en transect deze. Perfuseer het hart met 0,2 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en perfuseer vervolgens met 0,1 ml 0,2% Alcian Blue om het niet-infarcte externe myocardium te kleuren. Controleer succesvolle perfusie, wat blijkt uit het uitspoelen van bloed, PBS en vervolgens Alcian Blue via de halsader.
- Open de thorax en snijd het hart af door het omliggende bindweefsel en de bloedvaten te ontleden om het hart vrij te maken. Spoel het hart in PBS, verwijder de boezems indien gewenst en fotografeer het hart met een camera gemonteerd op een chirurgische microscoop met behulp van een 10x objectief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anesthesie van 10 dagen oude muizen. De 10 dagen oude pups kunnen in 4-5 min worden verdoofd met 4,5% isofluraan; ze herstellen echter van anesthesie tijdens het voorbereidingsproces op intubatie. Vanwege hun kleine formaat is intubatie onder isofluraanane anesthesie door een standaard neuskegel niet haalbaar. We hebben eerder een ketamine / xylazine / atropine-anesthesieregime van respectievelijk 100/13/0,5 mg / kg gebruikt voor cardiothoracale chirurgie bij 15- en 21-daagse pups en volwassenen 4,7. In voorlopige experimenten, waaronder zuurstofsuppletie, bleek dat het aanbevolen injecteerbare regime van 50-150 mg / kg ketamine en 5-10 mg / kg xylazine10 resulteerde in een onaanvaardbare mortaliteit bij 10 dagen oude pups. Gezien de omgekeerde correlatie tussen lichaamsgewicht en worpgrootte van 10 dagen oude pups (R2 = 0,250, p < 0,0001; Figuur 2), hebben we het anesthesieregime getitreerd op basis van lichaamsgewichtgroepen. Het verlagen van de ketamine/xylazine/atropine dosering tot respectievelijk 50/6/0,18 mg/kg resulteerde in een voldoende diepte van de anesthesie om endotracheale intubatie van spontaan ademende pups met een gewicht van 5,5-8,10 g mogelijk te maken (tabel 1), maar deze dosis werd niet getolereerd door lichtere pups. Door de dosering ketamine/xylazine/atropine te verlagen tot respectievelijk 30/4/0,12 mg/kg, kon pups met een gewicht van 4,50-5,49 g intubatie worden geïnitieerd, terwijl verdere verlaging van de ketaminedosering tot 20 mg/kg intubatie van pups met een gewicht van 3,15-4,49 g mogelijk maakte (tabel 1). Tabel 1 toont het aantal en het percentage geïntubeerde pups dat tot een operatie is overgegaan; het is echter moeilijk om uit deze gegevens anesthesiegerelateerde mortaliteit te halen uit mortaliteit geassocieerd met te veel intubatiepogingen. In het belang van het verminderen van dierlijke verspilling hebben we de anesthesiegerelateerde sterfte niet specifiek gekwantificeerd.
Intubatie van 10 dagen oude muizen. De resultaten waren het beste wanneer intubatie werd bereikt na slechts één of twee pogingen. Pups met een lager lichaamsgewicht waren moeilijker te intuberen dan zwaardere pups en hadden meer pogingen nodig (p < 0,001; Tabel 1). Overleving na intubatie correleerde met lichaamsgewicht met 59%, 70% en 80% overleving voor groepen met een laag, midden- en hoog gewicht (R2 = 0,995, p = 0,04; Tabel 1).
Myocardinfarctchirurgie van 10 dagen oude muizen. Pups werden gedurende 2 dagen na de operatie gecontroleerd. Er waren geen tekenen van pijn na de operatie. Van de pups die de follow-up na 48 uur niet overleefden (tabel 1), stierf één uit de groep met een laag gewicht 6 uur na de operatie, één pup uit elk van de midden- en hooggewichtgroepen stierf voordat hij weer bij de moeder werd geplaatst, en één pup uit elk van de midden- en hooggewichtgroepen werd binnen 16 uur na de operatie door de moeder gekannibaliseerd, met kleine lichaamsdelen of niets dat de volgende ochtend overblijft. Overleving 2 dagen na myocardinfarctchirurgie was consistent tussen de verschillende gewichtsgroepen bij 86%-92% (p = 0,91; Tabel 1). Infarct myocardium, zoals beoordeeld 2 dagen na de operatie door Alcian-blauwe perfusie van het hart, was duidelijk door duidelijke afbakening van gekleurd, niet-geïnfarcteerd (blauw) van ischemisch (ongekleurd) weefsel, distale naar de ligatie (figuur 1E).
De totale overleving voor de gehele procedure (intubatie plus chirurgie) correleerde met het lichaamsgewicht van de pup op respectievelijk 55%, 60% en 70% voor groepen met een laag, midden en hoog gewicht (R2 = 0,978, tabel 1), hoewel deze correlatie geen statistische significantie bereikte (p = 0,09).
Figuur 1: Endotracheale intubatie van een 10 dagen oude C57BL/6J muisjong. (A) Intubatieopstelling met grote opwarmingslamp (WL), intubatieplatform (IP) en flexibele glasvezelverlichting (FL) die wordt gebruikt om de visualisatie van de stembanden op het moment van intubatie te ondersteunen. (B) Tang, laryngoscoop, 24-gauge canule die wordt gebruikt als een endotracheale buis, en een stuk koperdraad dat via de luer lock adapter in de endotracheale buis wordt gestoken om de canule tijdens intubatie te verstijven (schaalbalk = 1 cm). (C) De verdoofde pup wordt in rugligging vastgezet door de staart en voorpoten op het intubatieplatform te plakken (12 cm (L) x 8,5 cm (B) x 7,5 cm (H)). Een draad die over de snijtanden wordt geplaatst, wordt gebruikt om de kop uit te strekken en wordt in positie geplakt. (D) Het glasvezellicht wordt over de nek geplaatst om de luchtpijp net onder de stembanden te trans-verlichten. De tong wordt vastgehouden met een kleine tang en vervolgens wordt de beweging van de stembanden gevisualiseerd door de glottis bloot te leggen met de laryngoscoop. De endotracheale buis wordt in de luchtpijp ingebracht terwijl de stembanden open zijn. (E) Foto van een representatief muizenpupshart doordrenkt met Alcian blauw (frontaal zicht met de basis van het hart aan de bovenkant en apex aan de onderkant, en atria verwijderd) 48 uur na ligatie (zwarte hechting, zwarte pijl) van de linker kransslagader genomen onder een chirurgische microscoop (10x objectief) gemonteerd met een camera. Niet-geïnfarcteerd myocardium is blauw gekleurd, infarct myocardium aan de top is onbevlekt en bleek; schaalbalk = 100 μm. Dit cijfer is gewijzigd van17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het lichaamsgewicht van 10 dagen oude C57BL/6 pups is omgekeerd gecorreleerd met de nestgrootte. Pups kwamen uit nesten variërend in grootte van 4-10. De gemiddelde C57BL/6 nestgrootte is zeven18. Gegevens werden geanalyseerd door eenvoudige lineaire regressie, waarbij p < 0,05 als significant werd beschouwd. Dit cijfer is gewijzigd van17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Anesthesieregime: ketamine / xylazine / atropine (mg / kg); gegeven in 10 ml/g lichaamsgewicht, ip | Lichaamsgewicht, g | Aantal onderzochte pups | Intubatiepogingen (A, 1-2; B, 3-4 of C, >4) en aantal geïntubeerde jongen, n (%) | Geïntubeerde pups die overgaan tot een operatie, n (%) | Overleving twee dagen na de operatie, n (%) | Totale overleving na intubatie plus operatie, n (%) | ||
| Een | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (Chi-kwadraattest) | blz<0,001 | p=0,91 | ||||||
| R2 (Correlatiecoëfficiënt, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| p-waarde) | p=0,04 | p=0,09 | ||||||
Tabel 1: Anesthesieregime, aantal intubatiepogingen en overleving na de procedure van 10 dagen oude muizenpups. Gegevens werden geanalyseerd door Chi-kwadraattest, waarbij p < 0,05 als significant werd beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Momenteel zijn er geen goed gedocumenteerde methoden voor anesthesie en intubatie van 10 dagen oude muizen voor cardiothoracale chirurgie. Hiertoe hebben we ketamine / xylazine / atropine doseringsschema's getitreerd tot lichaamsgewicht, waarbij doses van 20/4/0,12 mg / kg, 30/ 4 / 0,12 mg / kg en 50 / 6 / 0,18 mg / kg de intubatie van pups met respectievelijk een laag (3,15-4,49 g), midden (4,50-5,49 g) en hoog (5,50-8,10 g) lichaamsgewicht vergemakkelijkten. Overleving na intubatie correleerde met lichaamsgewicht (respectievelijk 59%, 70% en 80% voor groepen met een laag, midden en hoog gewicht. Gezien de moeilijkheden die optreden bij intubatie van 10 dagen oude pups en de bijbehorende hoge mortaliteit, raden wij aan om cardiothoracale chirurgie bij 10 dagen oude pups te beperken tot dieren met een gewicht van ten minste 5,50 g. Een beperking van deze intubatietechniek is dat deze afhankelijk is van de vaardigheid en ervaring van de operator en hoe snel ze kunnen leren. Er wordt echter verwacht dat een operator die ervaring heeft met volwassen intubaties vaardigheid in preadolescente intubatie kan bereiken na het oefenen op 10 nesten van zeven tot acht pups. Een andere beperking is dat de totale overleving van de pup na intubatie en myocardinfarctchirurgie varieerde van 55% (laagste lichaamsgewichtgroep) tot 70% (hoogste lichaamsgewichtgroep). Niettemin is dit vergelijkbaar met de 60% -70% overleving gerapporteerd voor 1-dag-oude pups, die geen intubatie nodig hebben wanneer ze worden onderworpen aan een myocardinfarct na immobilisatie op ijs8.
We ontdekten dat 10 dagen oude muispups van verschillende gewichten een niet-lineaire reactie hadden op het ketamine / xylazine / atropine-anesthesieregime. Dit kan de ontwikkelingsverschillen op een aantal belangrijke gebieden weerspiegelen. Basale stofwisseling schaalt allometrisch naar het driekwart massavermogen, van enkele cellen tot zoogdieren19. Dit zou van invloed zijn op de medicijndispositie bij de dieren in de studie, die tweeënhalf keer in gewicht varieerde. De volwassenheid van het metabolisme van geneesmiddelen of ontgiftingsmechanismen is een andere factor die snel verandert in de onmiddellijke postnatale periode, net als mechanismen die de beschikbaarheid van vrije geneesmiddelen beïnvloeden, zoals eiwitbinding20. Farmacokinetische verschillen zijn mogelijk niet de enige verklaring voor niet-lineaire geneesmiddel-effectrelaties, aangezien verschillen in farmacodynamische reacties op sedatieve middelen ook mogelijk zijn6. Het gebruik van oxygenatie na intraperitoneale injectie van anesthetica en voorafgaand aan intubatie heeft waarschijnlijk de veiligheid van de procedure verbeterd, zoals onlangs is opgemerkt voor volwassenen21. Verdere aanpassingen in de dosering, met name voor de groep met het laagste lichaamsgewicht, kunnen de overleving verbeteren.
De diepte van de anesthesie was van cruciaal belang voor een succesvolle intubatie. Intubatie was moeilijk als het gebied van anesthesie te licht was en als het te diep was, stopten pups spontaan met ademen, hetzij tijdens intubatie of na intubatie terwijl ze werden beademd met zuurstof. Behandeling van pups veroorzaakte soms ook adem inhouden, vooral tijdens intubatie. Als de ademhaling stopte tijdens de intubatie, was stimulatie van de voet of staart, of het terugbrengen van pups naar de verwarmde met zuurstof gevulde kamer, van cruciaal belang om de regelmatige ademhaling te herstellen. Intubatie werd opnieuw geprobeerd toen de pup weer regelmatig ademde. Als de ademhaling na intubatie stopte, werden de dieren tot 10 minuten met zuurstof geventileerd. Als de spontane ademhaling gedurende deze tijd werd hervat, gingen de dieren over tot een operatie. We ontdekten echter dat als de spontane ademhaling niet binnen deze tijd werd hersteld, pups niet herstelden van anesthesie of, als ze werden onderworpen aan een operatie, stierven tijdens de herstelperiode.
Gezien de hoge stofwisseling van 10 dagen oude pups, is het het beste om de uitputting van energievoorraden te beperken door het moederdier zo kort mogelijk van zijn pups te scheiden en zo het aantal chirurgische ingrepen te beperken tot vier of vijf pups per nest per dag gedurende een maximale periode van 5-6 uur. Om het maternale kannibalisme van pups die een operatie hadden ondergaan te verminderen, werden nestgenoten die geen operatie ondergingen verwijderd naar pleegmoeders of geruimd voordat de moeder terugkeerde naar de kooi. Onze behandelingspraktijken om de mortaliteit door postoperatief kannibalisme van de moeder te verminderen, waren vergelijkbaar met die welke zijn gemeld voor pasgeborenen9.
Concluderend suggereert onze haalbaarheidsstudie dat een injecteerbaar ketamine / xylazine / atropine-anesthetisch regime aanzienlijk lager is dan dat voor oudere muizen nodig is om de mortaliteit door intubatie van 10-dagen oude muispups voor daaropvolgende cardiothoracale chirurgie te minimaliseren, evenals specifieke behandelingspraktijken om de mortaliteit door intubatie, chirurgie en postoperatief maternale kannibalisme te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NHMRC Program Grant [ID 1074386], een Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research grant [RMG] en een subsidie van de RT Hall Trust [RMG &SEI].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , Elsevier Inc. (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Boston University Institutional Animal Care and Use Committee. Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats. , Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019).
- University of Texas at Austin Animal Resources Center. Mouse-Specific Anesthesia Guidance. , Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019).
- Paddleford, R. Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , Masson. (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 1 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
