Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Migrationsexperiment, das für die funktionelle Analyse der Moleküle geeignet ist, die an der in vivo Migration von Neuralleistenzellen in die hyaluronsäurereiche extrazelluläre Matrix beteiligt sind.
Abstract
Neuralleistenzellen (NCCs) sind stark wandernde Zellen, die aus der dorsalen Region des Neuralrohrs stammen. Die Auswanderung von NCCs aus dem Neuralrohr ist ein essentieller Prozess für die NCC-Produktion und deren anschließende Migration in Richtung Zielstellen. Die Migrationsroute der NCCs, einschließlich des umgebenden Neuralrohrgewebes, umfasst eine mit Hyaluronsäure (HA) reiche extrazelluläre Matrix. Um die NCC-Migration aus dem Neuralrohr in dieses HA-reiche umgebende Gewebe zu modellieren, wurde in dieser Arbeit ein Mischsubstrat-Migrationsassay bestehend aus HA (mittleres Molekulargewicht: 1.200-1.400 kDa) und Kollagen Typ I (Col1) etabliert. Dieser Migrationsassay zeigt, dass Zellen der NCC-Zelllinie, O9-1, auf dem gemischten Substrat stark migrieren und dass die HA-Beschichtung an der Stelle der fokalen Adhäsionen im Laufe der Migration abgebaut wird. Dieses In-vitro-Modell kann nützlich sein, um die mechanistischen Grundlagen der NCC-Migration weiter zu erforschen. Dieses Protokoll eignet sich auch für die Evaluierung verschiedener Substrate als Gerüste zur Untersuchung der NCC-Migration.
Introduction
Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine multipotente Zellpopulation, die in sich entwickelnden Embryonen vorhanden ist und während der Neurulation an der Neuralplattengrenze entsteht. Sie tragen zur Bildung einer Vielzahl von Geweben bei, darunter das periphere Nervensystem, das Herz-Kreislauf-System, das kraniofaziale Gewebe und das Skelett1. Nach Induktion und NCC-Spezifizierung an der Neuralplattengrenze wandern NCCs aus dem Neuroepithel in Richtung NCC-abgeleiteter Gewebestellen1.
Hyaluronsäure (HA) ist ein nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan, das als Bestandteil der extrazellulären Matrix (EZM) in einer Vielzahl von Geweben verteilt ist. Die Bedeutung von HA für die Embryonalentwicklung wurde in Modellsystemen durch die Ablation von Genen nachgewiesen, die für den Hyaluronstoffwechsel verantwortlich sind. So wurde beispielsweise festgestellt, dass Mutationen in den Genen der Hyaluronsäuresynthase (Has1 und Has2) in Xenopus zu NCC-Migrationsdefekten und kraniofazialen Fehlbildungenführen 2. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die HA-bindenden Proteoglykane Aggrecan und Versican eine hemmende Wirkung auf die NCC-Migration ausüben3. Bei Mäusen führt die Has2-Ablation zu schweren Defekten in der Bildung von Endokardpolstern, was zu einerLetalität in der Mitte der Schwangerschaft (E9.5-10) führt 4,5,6.
Das Transmembranprotein 2 (Tmem2), eine Hyaluronidase auf der Zelloberfläche, hat kürzlich gezeigt, dass es eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Integrin-vermittelten Krebszelladhäsion und -migration spielt, indem Matrix-assoziierte HA an den Adhäsionsstellen entferntwird 7,8. In jüngerer Zeit zeigten Inubushi et al.9, dass ein Mangel an Tmem2 zu schweren kraniofazialen Defekten führt, die auf Anomalien bei der Auswanderung/Migration und dem Überleben von NCCs zurückzuführen sind. In der vorangegangenen Studie9 wurde die Tmem2-Expression während der NCC-Bildung und -Migration analysiert. Die Expression von Tmem2 wurde an der Stelle der NCC-Delamination und in emigrierenden Sox9-positiven NCCs beobachtet (Abbildung 1). Darüber hinaus zeigte die Studie anhand von Tmem2-depletierten O9-1-Neuralleistenzellen der Maus, dass die In-vitro-Expression von Tmem2 für die Bildung fokaler Adhäsionen der O9-1-Zellen und für ihre Migration in HA-haltige Substrate unerlässlich ist (Abbildung 2 und Abbildung 3)9.
Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Tmem2 auch für die Adhäsion und Migration von NCCs durch das HA-reiche ECM wichtig ist. Der molekulare Mechanismus der NCC-Adhäsion und -Migration innerhalb der HA-reichen ECM ist jedoch noch unklar. Es ist daher notwendig, ein experimentelles System für In-vitro-Kulturen zu etablieren, um die Adhäsion und Migration von NCCs innerhalb der HA-reichen ECM vollständig zu untersuchen.
Von den zahlreichen Ansätzen, die zur Prüfung der Zellmigration eingesetzt werden, ist der auf Zellwundverschluss basierende Assay eine einfache Methode, die häufig in der Physiologie und Onkologie eingesetzt wird10. Dieser Ansatz ist aufgrund seiner Relevanz für den In-vivo-Phänotyp nützlich und eignet sich effektiv zur Bestimmung der Rolle von Medikamenten und Chemolockstoffen während der Zellmigration11. Es ist möglich, die Migrationsfähigkeit sowohl ganzer Zellmassen als auch einzelner Zellen zu bewerten, indem die Zellspaltabstände über die Zeit gemessen werden11. In diesem Manuskript wird ein modifizierter in vitro Wundverschluss-basierter Assay vorgestellt, um die NCC-Migration in HA-reiches Gewebe, das das Neuralrohr umgibt, zu modellieren. Dieses Verfahren eignet sich auch für die Untersuchung verschiedener EZM-Komponenten (d. h. Kollagene, Fibronektin und Laminin), um die Rolle des EZM-Gerüsts bei der NCC-Migration zu analysieren.
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Protocol
Alle Verfahren wurden von der Tierethikkommission der Osaka University Graduate School of Dentistry genehmigt.
1. Kultivierung von kranialen Neuralleistenzellen der Maus
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete Neuralleistenzelllinie besteht aus O9-1-Zellen, die ursprünglich von Wnt1-Cre abgeleitet wurden. R26R-GFP-exprimierende Zellen, die aus E8.5-Mausembryonen isoliertwurden 12 (siehe Diskussion). Das hier beschriebene Verfahren zur Kultivierung von O9-1-Zellen folgt einem zuvor etablierten Protokoll13.
- Bereiten Sie die mit der Basalmembranmatrix beschichtete Platte vor.
- Tauen Sie die Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) auf Eis auf. Die Matrix 1:50 in gekühltem 1x PBS verdünnen und auf Eis aufbewahren.
- Eine 10 cm große Kulturplatte mit 10 ml der verdünnten Basalmembran-Matrixlösung bestreichen. Inkubieren Sie die Platte 1 h lang bei Raumtemperatur und saugen Sie die Matrix vor Gebrauch ab.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 2 ml PBS.
- Kultivieren Sie O9-1-Zellen auf der mit der Basalmembranmatrix beschichteten Platte.
- Erwärmen Sie das gesamte embryonale Stammzellmedium (ES) (siehe Materialtabelle) in einem Wasserbad bei 37 °C.
- Mischen Sie die O9-1-Zellsuspension vorsichtig (siehe Materialtabelle) und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem automatischen Zellzähler (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1,1 × 106/ml mit vollständigem ES-Zellmedium ein.
- Geben Sie 8 ml vorgewärmtes komplettes ES-Zellmedium in die matrixbeschichtete 10-cm-Kulturplatte und besiedeln Sie die O9-1-Zellen mit 1,1 x 106 Zellen/Platte. Inkubieren bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 .
- Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch frisches, vollständig auf 37 °C vorgewärmtes ES-Zellmedium. Danach alle 2-3 Tage durch frisches Medium ersetzen.
Anmerkungen: Wenn die Zellen zu etwa 80 % konfluent sind (3-4 Tage nach dem Plattieren), können sie mit 0,25 % Trypsin-EDTA dissoziiert und für die spätere Verwendung weiter durchgelassen oder eingefroren werden. Repräsentative Bilder von O9-1-Zellen sind in Abbildung 1 dargestellt. - Waschen Sie die Kulturplatte vor der Trypsinisierung mit 2 ml 1x PBS. 2 ml vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA zugeben und 5 min bei 37 °C inkubieren. Prüfen Sie, ob sich die Zellen vollständig abgelöst haben. Klopfen Sie bei Bedarf ein paar Mal vorsichtig auf die Seite des Tellers.
- Geben Sie 2 ml vorgewärmtes komplettes ES-Zellmedium in die Kulturplatte und übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 Minuten.
- Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Geben Sie dann 2 ml des vorgewärmten vollständigen ES-Zellmediums in das Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen gründlich durch Pipettieren. Säen Sie die Zellen auf einer neuen Kulturplatte mit der gewünschten Zelldichte aus.
- Alternativ können Sie einen gefrorenen Zellbestand herstellen, indem Sie 1 ml Zellgefriermedium mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) anstelle des vollständigen ES-Zellmediums in das Röhrchen geben und die Zellen gründlich resuspendieren. Die Zellsuspension in Kryoröhrchen umfüllen und bei −80 °C lagern.
2. Zubereitung der HA/Col1-beschichteten Schale
HINWEIS: Die ursprüngliche Methode, HA/Col1 auf Glasbodenschalen zu beschichten, wurde von Irie et al.7 vorgeschlagen.
- Geben Sie vorsichtig 50 μl unverdünntes Triethoxysilan in eine 3,5 cm große Glasbodenschale (siehe Materialtabelle). 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren und vor Licht schützen.
HINWEIS: Die Inkubation mit Triethoxysilan sollte 5 min nicht überschreiten. Dies kann die Beschichtungseffizienz beeinträchtigen und unerwünschte Produkte erzeugen. - Spülen Sie das Geschirr 3x schnell mit 2 ml destilliertem Wasser. Fügen Sie 50 μl 0,25%iges Glutaraldehyd, 100-fach in PBS verdünnt, pro Schale hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei RT.
- 4x schnell mit 2 ml PBS waschen. Anschließend bestreichen Sie die Schalen 1 h lang mit 300 μl Kollagen Typ I in 0,2 N Essigsäure bei RT.
- 3x mit 2 ml PBS schnell waschen. 300 μl 200 μg/ml fluoresceinamin-markiertes Natriumhyaluronat-H2 (FAHA-H2) (verdünnt in PBS) in jede Schale geben und über Nacht bei RT inkubieren. Nochmals 3x mit 2 mL PBS waschen. Nachdem Sie das PBS abgesaugt haben, lassen Sie die Platte 5 Minuten lang auf einer sauberen Bank an der Luft trocknen.
HINWEIS: FAHA-H2 ist ein Fluoresceinamin-markiertes Natriumhyaluronat mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 1.200 und 1.600 KDa. HA mit einem geeigneten Molekulargewicht können entsprechend dem Forschungsdesign verwendet werden.
3. Migrationsassay auf der HA/Col1-beschichteten Schale
HINWEIS: Ein Wundverschluss-basierter Assay mit definierten 500 μm zellfreien Lücken in Col1/HA-Substraten wurde unter Verwendung von 2-Well-Kultureinsätzen durchgeführt (siehe Materialtabelle). Die O9-1-Zellen exprimieren Tmem2, das für die Adhäsion und den Abbau von HA im extrazellulären Raum9 benötigt wird (Abbildung 2 und Abbildung 3).
- Befestigen Sie nach dem Trocknen der beschichteten Glasbodenschale die 2-Well-Kultureinsätze an den Schalen und füllen Sie die Einsätze von außen mit 1 ml PBS.
- Säen Sie die O9-1-Zellen in 1 x 104 Zellen in 100 μl Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 2 % fötalem Kälberserum (FBS) pro Einsatz in die Vertiefungen. Kultivieren Sie die Zellen 2 Tage lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 .
- Entfernen Sie die Einsätze vorsichtig mit einer Pinzette von der beschichteten Glasbodenschale. Waschen Sie das beschichtete Glasbodengeschirr vorsichtig mit 2 ml 1x PBS, um die Zellen und Zellrückstände zu entfernen. Geben Sie 2 ml frisches DMEM mit 2 % FBS in die Kulturschalen.
- Nehmen Sie jetzt Phasenkontrastbilder als Startzeitpunkt mit einem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop im Monochrommodus mit hochauflösenden Einstellungen auf (Verstärkung bei 6 dB, kein Binning). Für die Bildgebung wurden in dieser Studie Objektive mit 4- bis 20-facher Vergrößerung verwendet (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Nehmen Sie die Phasenkontrastbilder mit den entsprechenden Maßstabsleisten auf und speichern Sie sie im TIFF-Format. - Kulturieren Sie die Zellen für weitere 48 h bei 37 °C und 5 % CO2. Mit dem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop können Sie Phasenkontrastbilder nach 24 h und 48 h in Kultur aufnehmen.
- Fixieren Sie die Zellen nach 48 h mit 1 ml 4%igem Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Spülen Sie dann das Geschirr 3x für jeweils 5 min mit 1 ml frischem PBS.
- Legen Sie ein Deckglas mit Eindeckmedium (siehe Materialtabelle) zur weiteren morphologischen Betrachtung auf.
HINWEIS: Die Gerichte können sofort abgebildet oder bis zu 2 Monate bei 4 °C gelagert werden. - Optional: Immunmarkierung der Zellen für Proteine von Interesse.
HINWEIS: Ein Protokoll zum Nachweis des fokalen Adhäsionskomplexes (FA) unter Verwendung eines aus der Maus stammenden monoklonalen Anti-Vinkulin-Antikörpers (siehe Materialtabelle) wird hier als Beispiel beschrieben.- Die Schalen (ab Schritt 3.6) werden mit 0,5 ml Blockierpuffer (5 % normales Ziegenserum in PBS) für 60 min inkubiert.
HINWEIS: Wählen Sie einen geeigneten Blockierungspuffer für den primären Antikörper. Ein typischer Blockierungspuffer wäre 5 % normales Serum von der gleichen Spezies wie der verwendete Sekundärantikörper. - Bereiten Sie den verdünnten Primärantikörper in Antikörperverdünnungspuffer (1% normales Ziegenserum in PBS) vor. Die Schalen werden mit 0,5 ml verdünntem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert.
HINWEIS: Wählen Sie den geeigneten Antikörper-Verdünnungspuffer. Typischerweise wird der Antikörper in einer Verdünnung von 1:50-1:200 verwendet. - 3x für je 5 min mit 2 ml PBS ausspülen. Bereiten Sie den verdünnten, von Ziegen abgeleiteten Anti-Maus-Sekundärantikörper im Antikörper-Verdünnungspuffer (1% normales Ziegenserum in PBS) vor. Inkubieren Sie die Schalen mit 0,5 ml verdünntem Sekundärantikörper für 1-3 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: In der Regel wird der Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:500-1:1.000 verwendet. DAPI kann zur Färbung der Zellkerne verwendet werden. - Spülen Sie 3x mit 2 ml PBS für jeweils 5 Minuten. Legen Sie das Deckglas mit 50 μl Eindeckmedium auf.
HINWEIS: Die Schüsseln können mit dem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP-Filter (Anregung: 470/40, Emission: 525/50) und einem TexasRed-Filter (Anregung: 560/40, Emission: 630/75) im Monochrom-Modus mit hochauflösenden Einstellungen (Verstärkung bei 6 dB, kein Binning) abgebildet werden. Für die Bildgebung wurden in dieser Studie Objektive mit 4- bis 20-facher Vergrößerung verwendet.
HINWEIS: Der Objektträger kann bis zu 2 Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Die Schalen (ab Schritt 3.6) werden mit 0,5 ml Blockierpuffer (5 % normales Ziegenserum in PBS) für 60 min inkubiert.
4. Datenanalyse
- Öffnen Sie die ImageJ 1.51s-Software. Wählen Sie im ImageJ-Fenster in der Menüleiste Datei > Öffnen aus, um die gespeicherte Bilddatei zu öffnen.
- Zeichnen Sie zum Einstellen des Messmaßstabs eine Linie mit dem gleichen Abstand wie die Maßstabsleiste. Gehen Sie zu Analysieren > Maßstab festlegen und geben Sie den bekannten Abstand und die Einheiten der Linie in die entsprechenden Felder des Fensters Maßstab festlegen ein.
- Zeichnen Sie eine gerade Linie zwischen dem Zellenabstand, und drücken Sie Analysieren > Messen , um die Werte in ein Datenfenster zu übertragen. Messen Sie mindestens fünf verschiedene Positionen in jeder Probe und mitteln Sie die Abstände, um die repräsentativen Probendaten zu erhalten. Führen Sie die statistischen Auswertungen mit einer geeigneten Software durch (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Ein Migrationsassay wurde an gemischten Substraten aus Col1 und hochmolekularem HA (mittleres Molekulargewicht: 1.200-1.400 kDa) unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass O9-1-Zellen am Rand der Lücke leicht in die HA-reiche Lücke migrieren (Abbildung 4). Die Immunfärbung eines FA-Markers, Vinculin14, bestätigte, dass die O9-1-Zellen fokale Adhäsionen (FAs) an den Orten des HA-Abbaus bildeten (Abbildung 5).
Abbildung 1: TMEM2-Expression in NCCs. Querschnitte des Neuralrohrs von Tmem2-FLAGKI-Embryonen bei E9.0. (A) Schnitte auf Schädel- und Rumpfebene des Neuralrohrs wurden doppelt für das TMEM2-FLAG-Protein und HA markiert. Die TMEM2-Expression wurde in der Neuralplatte und im Randbereich des Neuralrohrs (gefüllte Pfeilspitzen) beobachtet, während diese Stellen keine HA-Färbung aufwiesen (offene Pfeilspitzen). (B) Doppelmarkierung der Neuralleistenzellen für TMEM2-FLAG und Sox9. Querschnitte des Neuralrohrs E9.0 wurden für TMEM2-FLAG und Sox9 gefärbt. Sox9-positive prämigrierende und emigrierende NCCs am Rand des Neuralrohrs exprimierten TMEM2. Abkürzung: nt = Neuralrohr. Maßstabsbalken: (A) 300 μm; (B) 100 μm. Adaptiert mit freundlicher Genehmigung von Inubushi et al.9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Abbau von HA durch TMEM2 in O9-1-Zellen. (A) Repräsentative Bilder von Tmem2-depletierten und Kontroll-O9-1-Zellen, die auf einer regulären Kulturschale kultiviert wurden (links). (B) Die Expression von Tmem2 in diesen Zellen wurde mittels qPCR evaluiert, wobei Gapdh als interne Kontrolle für die Normalisierung diente (Balkendiagramm). Mittelwerte ± SD (n = 5) werden als horizontale Balken dargestellt. p < 0,001 durch ungepaarten Student's t-Test. Maßstabsleiste, 5,0 μm. (C) Zellbasierter Hyaluronidase-Assay. Tmem2-depletierte und Kontroll-O9-1-Zellen wurden für 48 h auf Glasdeckgläsern kultiviert, die mit fluoresceiniertem HA (FA-HA) beschichtet waren. HA-abbauende Aktivität zeigt sich als dunkle Bereiche im fluoreszierenden Hintergrund. Das Ausmaß des HA-Abbaus wurde auch quantitativ zwischen Tmem2-depletierten und Kontroll-O9-1-Zellen verglichen, wie in Materials and Methods (Bargraph) beschrieben. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD der Fluoreszenzintensität unter einer Zelle im Verhältnis zu der in der zellfreien Fläche dar (n > 50 Zellen pro Bedingung, die aus drei unabhängigen Experimenten gepoolt wurden). p < 0,001 durch ungepaarten Student's t-Test. Übernommen mit freundlicher Genehmigung von Inubushi et al.9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Abbau von substratgebundener HA an FAs in O9-1-Zellen. Zellbasierte Hyaluronidase-Assays wurden für 16 h durchgeführt und die Zellen wurden auf Vinculin gefärbt. In Kontroll-O9-1-Zellen kommt es zu einem HA-Abbau in Vinculin-positiven FAs. In Tmem2-depletierten O9-1-Zellen sind der HA-Abbau und die FA-Bildung stark vermindert. Die Anzahl der FAs pro Zelle wurde quantitativ zwischen Tmem2-depletierten und Kontroll-O9-1-Zellen verglichen (Balkendiagramm). Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n >30 Zellen pro Bedingung, zusammengefasst aus drei unabhängigen Experimenten). p < 0,001 durch ungepaarten Student's t-Test. Übernommen mit freundlicher Genehmigung von Inubushi et al.9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder der O9-1-Zellmigration in einen zellfreien Spalt auf gemischten Col1/HA-Substraten. (A) Das obere Bild zeigt die Lücken zu Beginn des Experiments (Tag 0). Die unteren Tafeln zeigen Lückenbilder nach 24 h (Tag 1) bzw. 48 h (Tag 2) Inkubation. Maßstabsbalken = 150 μm. (B) Ein Balkendiagramm, das die quantitative Analyse der Zellmigration zeigt. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD der von wandernden Zellen bedeckten Lückenfläche im Verhältnis zur Fläche der ursprünglichen Lücke dar (n = 5 pro Bedingung). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 durch ungepaarten Student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Abbau von HA in den gemischten Col1/HA-Substraten an FAs in O9-1-Zellen. O9-1-Zellen, die auf gemischten Substraten aus Col1/HA kultiviert wurden, wurden mit Anti-Vinkulin-Antikörpern (rot) immunmarkiert. Die dunklen Flecken/Streifen repräsentieren die HA-Abbauaktivität im FAHA-H2-Substrat (grün). Die Stellen des HA-Abbaus und der fokalen Adhäsionen (Vinculin) wurden auf den gemischten Substraten (Pfeilspitzen) kolokalisiert. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Verschiedene ECM-Komponenten regeln die NCC-Auswanderung/-Migration. Zum Beispiel reguliert HA die NCC-Migration positiv 2,15. Interessanterweise verdeutlichte eine Studie, die auf genetischen Mausmodellen von Tmem2, einer Zelloberflächen-Hyaluronidase, basierte, die Notwendigkeit des HA-Abbaus bei der NCC-Migration9. Kollagene sind auch in der EZM, die das Neuralrohr umgibt, reichlich vorhanden16. Decorin, ein kleines Leucin-reiches Proteoglykan, reguliert nachweislich die NCC-Migration während der neuronalen Entwicklung17. Andere ECM-Komponenten, einschließlich Laminin und Fibronektin, beeinflussen die Adhäsion und Migration von NCCs18. Die spezifische Rolle von ECM-Komponenten bei der NCC-Migration ist jedoch noch unbekannt.
Das hier beschriebene in vitro Modell zielt darauf ab, das Verhalten von migrierenden NCCs zu untersuchen, die auf HA-reiche ECM treffen. Wir haben uns für 2D- und nicht für 3D-Substrate entschieden, da es schwierig ist, Kollagen-HA-Kompositgele mit gleichmäßigen Gelierungseigenschaften herzustellen. In einem 2D-Kultursystem unterscheiden sich die räumlichen Gradienten der löslichen Faktorkonzentrationen und die Steifigkeiten der extrazellulären Matrixsubstrate von denen von lebendem Gewebe19. Unter diesem Gesichtspunkt hat ein 3D-Kultursystem große Vorteile und kann tiefere Einblicke in Zellmigrationsmechanismen liefern20,21. In diesem Zusammenhang wird ggf. der Aufbau eines 3D-Assay-Systems bevorzugt. Dieses experimentelle In-vitro-Modell könnte auf die Untersuchung des Migrationsverhaltens von NCCs als Reaktion auf unterschiedliche EZM-Komponenten anwendbar sein. Dies würde ein besseres Verständnis der mechanistischen Grundlagen der NCC-Migration ermöglichen, die die Morphogenese von Embryonen steuert.
Die in dieser Studie verwendeten O9-1-Zellen exprimieren Stammzellmarker (CD44, Sca-1 und Bmi1) und Neuralleistenmarker (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 und Itgb1) stabil. Unter nicht-differenzierenden Kulturbedingungen behalten O9-1-Zellen multipotente stammzellähnliche Eigenschaften bei. O9-1-Zellen haben das Potenzial, sich unter bestimmten Kulturbedingungen in mehrere Zelltypen zu differenzieren, darunter Osteoblasten, Chondrozyten, glatte Muskelzellen und Gliazellen12. Daher sind O9-1-Zellen ein nützliches Werkzeug, um die molekularen Eigenschaften der kranialen NCC-Migration und -Differenzierung zu untersuchen. Nichtsdestotrotz wird die Verwendung von primären NCCs (z.B. von embryonalen Neuralrohren von Hühnern oder Mäusen) anstelle von O9-1-Zellen detailliertere Daten liefern, um ein besseres Verständnis der Art der NCC-Migration zu ermöglichen.
Im wundverschlussbasierten Migrationsassay wird sich der NCC ebenfalls vermehren und die Erhöhung der Zellzahl wird auch zur Ausdehnung der Zellpopulation in den Lückenbereichbeitragen 22. Um die Proliferation während des Wundheilungstests zu minimieren, ist die Serumverhungerung die gebräuchlichste Methode anstelle des Einsatzes pharmakologischer Wirkstoffe23. Die Auswirkungen des Serummangels sollten jedoch in jedem Zelltyp getestet werden.
Der kritischste Schritt dieses Protokolls ist das Hinzufügen der kovalenten HA-Beschichtung zu den Glasbodenschalen. Die Glasoberflächenbehandlung mit Silanreagenzien wird für die Analyse fokaler Adhäsionen auf ECM-Substraten24 verwendet. Triethoxysilan ist eine siliciumorganische Verbindung, die viele freie Aminogruppen enthält, die an freie Hydroxylgruppen auf Quarzglasoberflächen binden können25. In dieser Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt und optimiert, um mit Triethoxysilan eine dünne, stabile Silanschicht auf einer Quarzglasoberfläche herzustellen. Das Amin in der mit Triethoxysilan beschichteten Glasoberfläche kann die Carboxylgruppen an HA binden und somit HA auf der Glasoberfläche8 chemisch immobilisieren. Mit dieser Methode ist es jedoch nicht möglich, andere proteinbasierte ECM-Substrate an die Glasoberfläche zu binden. Daher wurde hier Glutaraldehyd verwendet, um das Typ-I-Kollagen durch Aminkopplung an den Aldehyd chemisch zu immobilisieren. Insbesondere kann eine unzureichende HA-Beschichtung dazu führen, dass die HA-Beschichtung auch ohne enzymatischen Aufschluss entfernt wird (z. B. durch die Einwirkung mechanischer Kraft während der Zelladhäsion und -migration). Eine Beschichtung mit ECM-Substraten anstelle von Kollagen Typ I ist möglich, sofern die Substrate Amingruppen besitzen. Aufgrund der chemischen Eigenschaften des Substrats können jedoch Einschränkungen bei der kovalenten Beschichtung des ECM auf Glasbodenschalen bestehen. Daher kann Versuch und Irrtum erforderlich sein.
Obwohl es kein perfektes Modell ist, um die NCC-Migration in die HA-reiche EZM, die das Neuralrohr umgibt, nachzuahmen, könnte dieses in vitro Migrationsexperiment für die funktionelle Analyse der Moleküle nützlich sein, die an der in vivo NCC-Migration beteiligt sind. Darüber hinaus kann dieser In-vitro-Assay für das therapeutische Wirkstoffscreening nützlich sein, um den HA-Abbau sowie die Migration anderer Zelltypen, einschließlich Hautfibroblasten und Keratinozyten, zu beschleunigen oder zu verhindern.
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Disclosures
Der Autor erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Ich bedanke mich bei Fumitoshi Irie und Yu Yamaguchi für ihre Ermutigung und ihre freundlichen Vorschläge bei der Etablierung dieser Methode. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse für wissenschaftliche Forschungsprogramme der Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 to T.I., #20H03896 to T.I.) unterstützt. Die ursprüngliche Methode zur Beschichtung von HA auf Glassubstraten und in situ HA-Abbauassays auf den Substraten wurde in Yamamoto et al. (2017)8 beschrieben, während die Methode zur Herstellung von HA/Col1-Mischsubstraten in Irie et al. (2021)7 beschrieben wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
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