Summary
このプロトコルは、神経堤細胞のヒアルロナンに富む細胞外マトリックスへのin vivo移動に関与する分子の機能解析に適したin vitro移行実験の概要を示しています。
Abstract
神経堤細胞(NCC)は、神経管の背側領域に由来する高度に遊走する細胞です。神経管からのNCCの移行は、NCCの産生とその後の標的部位への移動に不可欠なプロセスです。周囲の神経管組織を含むNCCの移動経路には、ヒアルロン酸(HA)に富む細胞外マトリックスが含まれます。神経管からこれらのHAリッチな周辺組織へのNCC移行をモデル化するために、HA(平均分子量:1,200〜1,400 kDa)とコラーゲンI型(Col1)からなる混合基質移動アッセイがこの研究で確立されました。この遊走アッセイは、NCC細胞株O9-1細胞が混合基質上で高度に遊走性であり、HAコーティングが遊走の過程で局所接着部位で分解されることを示しています。この in vitro モデルは、NCC移行に関与する機構的基盤のさらなる探索に有用であり得る。このプロトコルは、NCCの移動を研究するための足場として異なる基質を評価するためにも適用できます。
Introduction
神経堤細胞(NCC)は、発生中の胚に存在する多能性細胞集団であり、神経形成中に神経板境界から発生します。それらは、末梢神経系、心血管系、頭蓋顔面組織、および骨格1を含む様々な組織の形成に寄与する。神経板境界での誘導とNCC仕様化の後、NCCは神経上皮から移動し、NCC由来の組織部位に向かって移動します1。
ヒアルロン酸(HA)は、細胞外マトリックス(ECM)の成分として様々な組織に分布している非硫酸化グリコサミノグリカンである。胚発生におけるHAの重要性は、ヒアルロン代謝に関与する遺伝子の切除を通じてモデルシステムで実証されています。たとえば、アフリカツメガエルのヒアルロン酸合成酵素遺伝子(Has1およびHas2)の変異は、NCCの移動障害と頭蓋顔面奇形につながることがわかりました2。また、HA結合プロテオグリカン、アグリカンおよびバーシカンが、NCC遊走に対して抑制効果を発揮することが報告されている3。マウスでは、Has2アブレーションは心内膜クッション形成に深刻な欠陥をもたらし、妊娠中期(E9.5-10)の致死性をもたらします4,5,6。
細胞表面ヒアルロニダーゼである膜貫通タンパク質2(Tmem2)は、接着部位のマトリックス関連HAを除去することにより、インテグリンを介した癌細胞の接着および遊走を促進する上で重要な役割を果たすことが最近実証されました7,8。最近では、Inubushiら9は、Tmem2の欠損がNCCの移動/移動および生存の異常により、重度の頭蓋顔面欠損につながることを実証しました。先行研究9では、NCC形成および遊走中のTmem2発現を解析した。Tmem2の発現は、NCC層間剥離部位およびSox9陽性NCCの遊走において観察された(図1)。さらに、Tmem2を枯渇させたマウスO9-1神経堤細胞を用いて、この研究では、Tmem2のin vitro発現が、O9-1細胞が局所接着を形成し、HA含有基質への移行に不可欠であることが実証されました(図2および図3)9。
これらの結果は、Tmem2がNCCの接着とHAリッチECMを介した移行にも重要であることを強く示しています。しかし、HAリッチECM内でのNCCの接着と移動の分子メカニズムはまだ不明です。したがって、HAリッチECM内のNCC接着と遊走を完全に探索するための in vitro 培養実験システムを確立する必要があります。
細胞遊走の試験に採用されている数多くのアプローチの中で、細胞創傷閉鎖ベースのアッセイは、生理学および腫瘍学の分野で頻繁に使用される簡単な方法です10。このアプローチは、 in vivo 表現型との関連性のために有用であり、細胞遊走中の薬物および化学誘引物質の役割を決定するのに有効である11。経時的な細胞間隙距離を測定することにより全細胞塊および個々の細胞の両方の遊走能を評価することができる11。この原稿では、神経管周囲のHAリッチ組織へのNCCの移動をモデル化するために、修正された in vitro 創傷閉鎖ベースのアッセイが導入されています。この手順は、NCC移行におけるECM足場の役割を分析するために、さまざまなECMコンポーネント(コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなど)を研究するためにも適用できます。
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Protocol
すべての手続きは、大阪大学大学院歯学研究科の動物倫理委員会で承認されました。
1. マウス脳神経堤細胞の培養
注:この研究で使用された神経堤細胞株は、もともとWnt1-Creに由来するO9-1細胞で構成されています。E8.5マウス胚12から単離されたR26R-GFP発現細胞(考察参照)。O9-1細胞を培養するためにここで説明する方法は、以前に確立されたプロトコル13に従います。
- 基底膜マトリックス被覆プレートを準備します。
- 基底膜マトリックス( 材料表を参照)を氷上で解凍します。マトリックスを冷やした1x PBSで1:50に希釈し、氷上に保ちます。
- 10 cmの培養プレートに10 mLの希釈基底膜マトリックス溶液をコーティングします。プレートを室温で1時間インキュベートし、使用前にマトリックスを吸引します。
- プレートを2 mLのPBSで3回洗浄します。
- 基底膜マトリックスコーティングプレート上でO9-1細胞を培養する。
- 完全な胚性幹(ES)細胞培地( 材料の表を参照)を37°Cの水浴中で温める。
- O9-1細胞懸濁液を穏やかに混合し(材料 表を参照)、自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントします( 材料表を参照)。完全なES細胞培地で細胞濃度を1.1×106 / mLに調整します。
- 8 mLの予温した完全ES細胞培地をマトリックスコーティングされた10 cm培養プレートに加え、O9-1細胞を1.1 x 106 細胞/プレートで播種します。5%CO2 加湿インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
- 翌日、培地を新鮮な完全ES細胞培地(37°Cに予め加温)と交換します。その後、2〜3日ごとに新しい培地と交換してください。
注:細胞が約80%コンフルエントになったら(メッキ後3〜4日)、0.25%トリプシン-EDTAで解離させ、さらに継代するか、後で使用するために凍結することができます。O9-1細胞の代表的な画像を 図1に示す。 - トリプシン処理の前に、培養プレートを2 mLの1x PBSで洗浄します。2 mLの予熱した0.25%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで5分間インキュベートします。 完全な細胞剥離を確認します。必要に応じて、プレートの側面を数回軽くたたきます。
- 2 mLの加温済みの完全ES細胞培地を培養プレートに加え、解離した細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。チューブを300 x g で5分間遠心分離します。
- 細胞ペレットを乱すことなく上清を捨てる。次いで、予め加温した完全ES細胞培地2mLをチューブに加え、ピペッティングにより細胞を完全に再懸濁する。細胞を新しい培養プレートに希望の細胞密度で播種します。
- あるいは、完全なES細胞培地の代わりに10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む細胞凍結培地1 mLをチューブに加え、細胞を完全に再懸濁することにより、凍結細胞ストックを調製します。細胞懸濁液をクライオチューブに移し、-80°Cで保存します。
2. HA/Col1コーティングディッシュの準備
注:HA / Col1をガラス底皿にコーティングする独自の方法は、入江らによって提案されました7。
- 50 μLの未希釈のトリエトキシシランを3.5 cmのガラス底皿に注意深く加えます( 材料の表を参照)。室温(RT)で5分間インキュベートし、光から保護します。
注:トリエトキシシランとのインキュベーションは5分を超えてはなりません。これはコーティング効率に影響を与え、望ましくない製品を生成する可能性があります。 - 皿を3mLの蒸留水で2回すばやく洗います。PBSで100倍に希釈した0.25%グルタルアルデヒドをディッシュあたり50 μL加え、RTで30分間インキュベートします。
- 2 mLのPBSで4回すばやく洗浄します。次に、0.2 N酢酸中のコラーゲンI型コラーゲン300 μLをRTで1時間コーティングします。
- 2 mLのPBSで3回すばやく洗浄します。300 μLの200 μg/mLフルオレセインアミン標識ヒアルロン酸ナトリウム-H2(FAHA-H2)(PBSで希釈)を各皿に加え、RTで一晩インキュベートします。PBSを吸引した後、プレートをクリーンベンチで5分間風乾します。
注:FAHA-H2は、平均分子量が1,200〜1,600 KDaの範囲のフルオレセインアミン標識ヒアルロン酸ナトリウムです。研究設計に応じて適切な分子量のHAを用いることができる。
3. HA/Col1コーティングディッシュでの移行アッセイ
注:Col1/HA基質に定義された500 μmの無細胞ギャップを使用した創傷閉鎖ベースのアッセイは、2ウェル培養インサートを使用して実行されました( 材料の表を参照)。O9-1細胞は、細胞外空間9 におけるHAの接着および分解に必要なTmem2を発現する(図2 および 図3)。
- コーティングされたガラス底皿を乾燥させた後、2ウェル培養インサートをディッシュに取り付け、インサートに1 mLのPBSを外部から充填します。
- O9-1細胞を、インサートあたり2%のウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の100 μL中の1 x 104 細胞のウェルに播種します。細胞を5%CO2 加湿インキュベーター内で37°Cで2日間培養した。
- ピンセットでコーティングされたガラス底皿からインサートを慎重に取り外します。コーティングされたガラス底皿を2 mLの1x PBSで穏やかに洗浄し、細胞と細胞の破片を取り除きます。2%FBSを含む新鮮なDMEM2 mLを培養皿に加えます。
- 高解像度設定(6 dBのゲイン、ビニングなし)のモノクロモードのオールインワン蛍光顕微鏡を使用して、位相差画像を開始時点としてキャプチャします。この研究では、4倍から20倍の倍率の対物レンズをイメージングに使用しました( 材料表を参照)。
注: 位相差画像を対応する縮尺記号でキャプチャし、TIFF 形式で保存します。 - 細胞をさらに48時間、37°C、5%CO2で培養します。オールインワン蛍光顕微鏡を使用して、培養24時間および48時間で位相差画像をキャプチャします。
- 細胞を1 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で15分間、または4°Cで一晩48時間固定します。 次に、1mLの新鮮なPBSで皿を3回ずつ5分間洗浄します。
- さらに形態学的観察のために、封入剤( 材料表を参照)を含むカバーガラスを置きます。
注:皿はすぐに画像化することも、4°Cで最大2か月間保存することもできます。 - オプション:目的のタンパク質について細胞を免疫標識します。
注:マウス由来のモノクローナル抗ビンキュリン抗体( 材料の表を参照)を使用して局所接着(FA)複合体を検出するためのプロトコルを例としてここで説明します。- 皿(ステップ3.6から)を0.5 mLのブロッキングバッファー(PBS中の5%正常ヤギ血清)で60分間インキュベートします。
注:一次抗体に適したブロッキングバッファーを選択してください。典型的なブロッキングバッファーは、使用される二次抗体と同じ種からの5%正常血清です。 - 抗体希釈バッファー(PBS中の1%正常ヤギ血清)で希釈した一次抗体を調製します。0.5 mLの希釈一次抗体で皿を4°Cで一晩インキュベートします。
注:適切な抗体希釈バッファーを選択してください。通常、抗体は1:50〜1:200の希釈で使用されます。 - 2 mLのPBSでそれぞれ5分間3回すすぎます。希釈したヤギ由来抗マウス二次抗体を抗体希釈バッファー(PBS中の1%正常ヤギ血清)で調製する。皿を0.5 mLの希釈二次抗体とともに室温で1〜3時間インキュベートします。
注:通常、二次抗体は1:500〜1:1,000の希釈で使用されます。DAPIは核の染色に使用できます。 - 毎回2mLのPBSで5分間3回すすぎます。カバーガラスに50μLの封入剤を置きます。
注:ディッシュは、GFPフィルター(励起:470/40、発光:525/50)およびTexasRedフィルター(励起:560/40、発光:630/75)を備えたオールインワン蛍光顕微鏡を使用して、高解像度設定(6dBのゲイン、ビニングなし)のモノクロモードで画像化できます。この研究では、倍率4倍から20倍の対物レンズをイメージングに使用しました。
注:スライドは4°Cで最大2か月間保存できます。
- 皿(ステップ3.6から)を0.5 mLのブロッキングバッファー(PBS中の5%正常ヤギ血清)で60分間インキュベートします。
4.データ分析
- ImageJ 1.51s ソフトウェアを開きます。ImageJウィンドウで、メニューバーから[ファイル]>[開く]を選択して、保存した画像ファイルを開きます。
- 測定スケールを設定するには、スケールバーと同じ距離の線を引きます。 [解析] > [縮尺の設定] に移動し、[ 縮尺の設定 ] ウィンドウの適切なボックスにラインの既知の距離と単位を入力します。
- セルギャップの間に直線を描画し、[分析]>[計測]を押して値をデータウィンドウに転送します。各サンプルの少なくとも5つの異なる位置を測定し、距離を平均して代表的なサンプルデータを取得します。適切なソフトウェアを使用して統計解析を実行します(材料表を参照)。
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Representative Results
ここで説明したプロトコルを使用して、Col1と高分子量HA(平均分子量:1,200〜1,400 kDa)で構成される混合基質に対して移行アッセイを実施しました。ギャップの境界にあるO9-1細胞は、HAリッチギャップに容易に移動することがわかりました(図4)。FAマーカーであるビンキュリン14の免疫染色により、O9-1細胞がHA分解部位に限局性接着(FA)を形成することが確認されました(図5)。
図1:NCCにおけるTMEM2の発現。 E9.0における Tmem2-FLAGKI 胚の神経管の横断面。(A)神経管の頭蓋レベルおよび体幹レベルの切片をTMEM2-FLAGタンパク質およびHAについて二重標識した。TMEM2の発現は神経板と神経管の境界領域(塗りつぶされた矢じり)で観察されましたが、これらの部位にはHA染色がありませんでした(開いた矢じり)。(B)TMEM2-FLAGおよびSox9に対する神経堤細胞の二重標識。E9.0神経管の横断切片をTMEM2-FLAGおよびSox9について染色した。神経管の端にあるSox9陽性の前遊走および遊走NCCはTMEM2を高発現させた。略称:nt =神経管。スケールバー:(A)300μm;(B)100μm。犬節らの許可を得て翻案9. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:O9-1細胞におけるTMEM2によるHAの分解。 (A)通常の培養皿で培養したTmem2枯渇細胞とコントロールO9-1細胞の代表的な画像(左)。(b)これらの細胞におけるTmem2の発現は、正規化のための内部コントロールとしてGapdhを用いてqPCRによって評価した(棒グラフ)。平均± SD(n = 5)は水平バーとして表示されます。p < 0.001 対応のないスチューデントのt検定による。スケールバー、5.0 μm。 (C)細胞ベースのヒアルロニダーゼアッセイ。Tmem2を枯渇させたコントロールO9-1細胞を、蛍光化HA(FA-HA)でコーティングしたガラスカバーガラス上で48時間培養した。HA分解活性は、蛍光バックグラウンドの暗い領域として明らかにされる。HA分解のレベルは、材料と方法(棒グラフ)に記載されているように、Tmem2枯渇細胞と対照O9-1細胞の間で定量的に比較されました。データは±無細胞領域における蛍光強度に対する細胞下の蛍光強度の平均SDを表す(3つの独立した実験からプールされた条件当たりn>50細胞)。p < 対応のないスチューデントのt検定で0.001。犬伏らの許可を得て採択9。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:O9-1細胞のFAにおける基質結合HAの分解。 細胞ベースのヒアルロニダーゼアッセイを16時間実施し、細胞をビンキュリンについて染色した。コントロールO9-1細胞では、ビンキュリン陽性FAでHA分解が起こります。 Tmem2が枯渇したO9-1細胞では、HA分解とFA形成が大幅に減少します。細胞当たりのFA数を、 Tmem2枯渇細胞とコントロールO9-1細胞の間で定量的に比較した(棒グラフ)。データは平均±SD(3つの独立した実験からプールされた条件当たりn > 30細胞)を表す。p < 対応のないスチューデント のt検定で0.001。犬伏らの許可を得て採択9。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:混合Col1/HA基質上の無細胞ギャップへのO9-1細胞の遊走の代表的な画像。 (A)トップパネルは、実験開始時(0日目)のギャップを示しています。下のパネルは、24時間(1日目)または48時間(2日目)のインキュベーション後のギャップ画像を示しています。スケールバー=150μm。 (B)細胞遊走の定量的解析を示す棒グラフ。データは、元のギャップの面積に対する遊走細胞によって覆われたギャップ領域の平均±SDを表す(条件あたりn = 5)。対応のないスチューデントのt検定による*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:O9-1細胞のFAにおけるCol1/HA混合基質におけるHAの分解。 Col1/HAからなる混合基質上で培養したO9-1細胞を抗ビンキュリン抗体(赤色)で免疫標識した。ダークスポット/ストリークは、FAHA-H2基板(緑色)のHA分解活性を表します。HA分解および局所接着(ビンキュリン)の部位は、混合基質(矢じり)上に共局在した。スケールバー= 500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
さまざまなECMコンポーネントがNCCの移行/移行を規制します。たとえば、HAはNCC移行2,15を積極的に規制しています。興味深いことに、細胞表面ヒアルロニダーゼであるTmem2の遺伝子マウスモデルに基づく研究では、NCC遊走におけるHA分解の要件が解明されました9。コラーゲンは、神経管16を取り囲むECMにも豊富に存在する。ロイシンに富む小さなプロテオグリカンであるデコリンは、神経発達中のNCC遊走を調節することが示されています17。ラミニンおよびフィブロネクチンを含む他のECM成分は、NCCの接着および遊走に影響を及ぼす18。ただし、NCC移行におけるECMコンポーネントの具体的な役割はまだ不明です。
ここで説明するin vitroモデルは、HAリッチECMに遭遇したNCCの移行の挙動を調べることを目的としています。均一なゲル化特性を持つ複合コラーゲン-HAゲルを調製することが困難であるため、3Dではなく2D基質を選択しました。2D培養系では、可溶性因子濃度の空間勾配および細胞外マトリックス基質の剛性は、生組織のものとは異なる19。この観点から、3D培養システムには大きな利点があり、細胞移動メカニズムへのより深い洞察を提供することができます20,21。これに関連して、該当する場合は、3Dアッセイシステムのセットアップが好ましい。このインビトロ実験モデルは、様々なECM成分に応答してNCC遊走挙動を調べるために適用可能であり得る。これにより、胚の形態形成を支配するNCC移動の機構的基盤をよりよく理解することができます。
本研究で用いたO9-1細胞は、幹細胞マーカー(CD44、Sca-1、Bmi1)および神経堤マーカー(AP-2a、Twist1、Sox9、Myc、Ets1、Dlx1、Dlx2、Crabp1、Epha2、およびItgb1)を安定に発現します。非分化培養条件下では、O9-1細胞は多能性幹細胞のような特性を維持します。O9-1細胞は、特定の培養条件下で骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、グリア細胞など、複数の細胞型に分化する可能性があります12。したがって、O9-1細胞は、頭蓋NCCの移動と分化の分子特性を調べるための有用なツールです。それにもかかわらず、O9-1細胞の代わりに一次NCC(例えば、ニワトリまたはマウスの胚性神経管から)を使用すると、NCC移動の性質をよりよく理解するためのより詳細なデータが提供されます。
創傷閉鎖ベースの遊走アッセイでは、NCCも増殖し、細胞数の増加は、ギャップ領域22への細胞集団の拡大にも寄与するであろう。創傷治癒アッセイ中の増殖を最小化するために、薬理学的物質を使用する代わりに血清飢餓が最も一般的な方法である23。ただし、血清飢餓の影響は各細胞型でテストする必要があります。
このプロトコルの最も重要なステップは、ガラス底皿にHAの共有結合コーティングを追加することです。シラン試薬によるガラス表面処理は、ECM基板24への焦点接着の分析に使用される。トリエトキシシランは、シリカガラス表面25上の遊離ヒドロキシル基に結合することができる多くの遊離アミノ基を含有する有機ケイ素化合物である。本研究では、トリエトキシシランを用いてシリカガラス表面に薄く安定なシラン層を生成する技術を開発し、最適化しました。トリエトキシシラン被覆ガラス表面のアミンは、HA上のカルボキシル基を結合することができ、その結果、ガラス表面8にHAを化学的に固定化する。しかしながら、この方法では、他のタンパク質ベースのECM基板をガラス表面に結合させることはできない。したがって、ここではグルタルアルデヒドを使用して、アルデヒドへのアミンカップリングを介してI型コラーゲンを化学的に固定化しました。特に、不適切なHAコーティングは、酵素消化がなくても(例えば、細胞接着および遊走中の機械的な力の作用によって)HAコーティングの除去につながる可能性があります。コラーゲンタイプIの代わりにECM基板でコーティングすることは、基質がアミン基を有する場合、可能である。ただし、基板の化学的性質により、ECMをガラス底皿に共有結合でコーティングすることには制限が存在する場合があります。したがって、試行錯誤が必要になる場合があります。
神経管を取り囲むHAリッチECMへのNCC移行を模倣する完全なモデルではありませんが、このin vitro 移行実験は、 in vivoNCC 移行に関与する分子の機能解析に役立つ可能性があります。さらに、この in vitro アッセイは、HA分解、ならびに皮膚線維芽細胞およびケラチノサイトを含む他の細胞タイプの遊走を加速または防止するための治療薬スクリーニングに有用であり得る。
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Disclosures
著者は、競合する利益は存在しないと宣言します。
Acknowledgments
入江文俊さんと山口悠さんには、この方法を確立するための励ましとご提案を賜り、心より感謝申し上げます。本研究は、日本学術振興会の科学研究費補助金(#19KK0232からT.I.、#20H03896からT.I.)の支援を受けて行われました。ガラス基板上へのHAのコーティングおよび基板上のin situHA分解アッセイの元の方法はYamamoto et al. (2017)8に記載され、HA/Col1混合基板の調製方法は入江ら(2021)7に記載されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
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