Summary
Este protocolo describe un experimento de migración in vitro adecuado para el análisis funcional de las moléculas involucradas en la migración in vivo de las células de la cresta neural a la matriz extracelular rica en hialuronano.
Abstract
Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que se originan en la región dorsal del tubo neural. La emigración de NCC desde el tubo neural es un proceso esencial para la producción de NCC y su posterior migración hacia los sitios objetivo. La ruta migratoria de los NCC, incluidos los tejidos del tubo neural circundantes, involucra una matriz extracelular rica en hialuronano (HA). Para modelar la migración de NCC en estos tejidos circundantes ricos en HA desde el tubo neural, se estableció en este estudio un ensayo de migración de sustrato mixto que consiste en HA (peso molecular promedio: 1,200-1,400 kDa) y colágeno tipo I (Col1). Este ensayo de migración demuestra que las células de línea celular NCC, O9-1, son altamente migratorias en el sustrato mixto y que el recubrimiento de HA se degrada en el sitio de adherencias focales en el curso de la migración. Este modelo in vitro puede ser útil para una mayor exploración de la base mecanicista involucrada en la migración de NCC. Este protocolo también es aplicable para evaluar diferentes sustratos como andamios para estudiar la migración de NCC.
Introduction
Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular multipotente que está presente en los embriones en desarrollo, y se originan en el borde de la placa neural durante la neurulación. Contribuyen a la formación de una variedad de tejidos, incluyendo el sistema nervioso periférico, el sistema cardiovascular, los tejidos craneofaciales y el esqueleto1. Después de la inducción y la especificación de NCC en el borde de la placa neural, los NCC emigran del neuroepitelio y migran hacia los sitios de tejido derivados de NCC1.
El hialuronano (HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado que se distribuye en una variedad de tejidos como un componente de la matriz extracelular (ECM). La importancia de HA en el desarrollo embrionario se ha demostrado en sistemas modelo a través de la ablación de genes responsables del metabolismo de los hialuronanos. Por ejemplo, se encontró que las mutaciones en los genes de la hialuronano sintasa (Has1 y Has2) en Xenopus conducen a defectos de migración NCC y malformación craneofacial2. Además, se ha informado que los proteoglicanos de unión a HA, agrecano y versicano, ejercen efectos inhibitorios sobre la migración de NCC3. En ratones, la ablación de Has2 conduce a defectos graves en la formación del cojín endocárdico, lo que resulta en la letalidad a mediados de la gestación (E9.5-10) 4,5,6.
Se ha demostrado recientemente que la proteína transmembrana 2 (Tmem2), una hialuronidasa de superficie celular, desempeña un papel crítico en la promoción de la adhesión y migración de células cancerosas mediada por integrina mediante la eliminación de HA asociada a la matriz en los sitios de adhesión 7,8. Más recientemente, Inubushi et al.9 demostraron que una deficiencia en Tmem2 conduce a defectos craneofaciales graves debido a anomalías en la emigración/migración y supervivencia de NCC. En el estudio anterior9, la expresión de Tmem2 se analizó durante la formación y migración de NCC. La expresión de Tmem2 se observó en el sitio de la delaminación de NCC y en la emigración de NCC positivos para Sox9 (Figura 1). Además, utilizando células de la cresta neural O9-1 de ratón sin Tmem2, el estudio demostró que la expresión in vitro de Tmem2 era esencial para que las células O9-1 formaran adherencias focales y para su migración a sustratos que contienen HA (Figura 2 y Figura 3)9.
Estos resultados indican fuertemente que Tmem2 también es importante para la adhesión y migración de NCC a través de la ECM rica en HA. Sin embargo, el mecanismo molecular de adhesión y migración de NCC dentro de la ECM rica en HA aún no está claro. Por lo tanto, es necesario establecer un sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente la adhesión y migración de NCC dentro de la ECM rica en HA.
De los numerosos enfoques empleados en la prueba de la migración celular, el ensayo basado en el cierre de heridas celulares es un método simple utilizado con frecuencia en los campos de la fisiología y la oncología10. Este enfoque es útil debido a su relevancia para el fenotipo in vivo y es eficaz para determinar el papel de fármacos y quimioatrayentes durante la migración celular11. Es posible evaluar la capacidad de migración tanto de masas celulares enteras como de células individuales midiendo las distancias de brecha celular a lo largo del tiempo11. En este manuscrito, se introduce un ensayo modificado in vitro basado en el cierre de heridas para modelar la migración de NCC en tejidos ricos en HA que rodean el tubo neural. Este procedimiento también es aplicable para estudiar diferentes componentes de ECM (es decir, colágenos, fibronectina y laminina) para analizar el papel del andamio de ECM en la migración de NCC.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Facultad de Odontología de la Universidad de Osaka.
1. Cultivo de células de la cresta neural craneal de ratón
NOTA: La línea celular de la cresta neural utilizada en este estudio comprende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expresan R26R-GFP aisladas de embriones de ratón E8.512 (ver discusión). El método descrito aquí para el cultivo de células O9-1 sigue un protocolo previamente establecido13.
- Prepare la placa recubierta de matriz de la membrana basal.
- Descongele la matriz de la membrana basal (ver Tabla de materiales) en hielo. Diluir la matriz 1:50 en 1x PBS refrigerado y mantener en hielo.
- Cubra una placa de cultivo de 10 cm con 10 ml de la solución de matriz de membrana basal diluida. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 h y aspirar la matriz antes de usarla.
- Lave el plato 3 veces con 2 ml de PBS.
- Cultive células O9-1 en la placa recubierta de matriz de la membrana basal.
- Calentar el medio de células madre embrionarias (ES) completo (ver Tabla de materiales) en un baño maría a 37 °C.
- Mezcle suavemente la suspensión de celdas O9-1 (consulte la Tabla de materiales) y cuente el número de celdas con un contador de celdas automatizado (consulte la Tabla de materiales). Ajustar la concentración celular a 1,1 × 106/ml con un medio de células madre embrionarias completo.
- Agregue 8 ml de medio celular CE completo precalentado a la placa de cultivo de 10 cm recubierta de matriz y siembre las células O9-1 a 1.1 x 106 células/placa. Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.
- Al día siguiente, sustituya el medio por un medio de células madre embrionarias completo fresco (precalentado a 37 °C). Reemplace con medio fresco cada 2-3 días a partir de entonces.
NOTA: Cuando las células son aproximadamente 80% confluentes (3-4 días después de la placa), pueden disociarse con tripsina-EDTA al 0,25% y pasar más lejos o congelarse para su uso posterior. En la Figura 1 se muestran imágenes representativas de las células O9-1. - Lave la placa de cultivo con 2 ml de 1x PBS antes de la tripsinización. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% precalentada e incubar durante 5 min a 37 °C. Verifique el desprendimiento completo de células; Golpee suavemente el costado del plato un par de veces si es necesario.
- Agregue 2 ml de medio celular madre embrionaria completo precalentado a la placa de cultivo y transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante sin alterar la bolita celular. Luego, agregue 2 ml de medio celular ES completo precalentado al tubo y resuspenda completamente las células mediante pipeteo. Sembrar las células en una nueva placa de cultivo con la densidad celular deseada.
- Alternativamente, prepare un stock de células congeladas agregando 1 ml de medio de congelación celular que contenga 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) al tubo en lugar de un medio celular ES completo y resuspendiendo completamente las células. Transfiera la suspensión celular a tubos criogénicos y guárdela a -80 °C.
2. Preparación del plato recubierto de HA/Col1
NOTA: El método original de recubrimiento de HA/Col1 sobre platos con fondo de vidrio fue propuesto por Irie et al.7.
- Agregue cuidadosamente 50 μL de trietoxisilano sin diluir a un plato con fondo de vidrio de 3,5 cm (consulte la Tabla de materiales). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y proteger de la luz.
NOTA: La incubación con trietoxisilano no debe exceder los 5 min. Esto puede afectar la eficiencia del recubrimiento y producir productos indeseables. - Lave el plato rápidamente 3 veces con 2 ml de agua destilada. Añadir 50 μL de glutaraldehído al 0,25%, diluido 100x en PBS, por plato, e incubar a RT durante 30 min.
- Lavar rápidamente 4 veces con 2 ml de PBS. Luego, cubra los platos con 300 μL de colágeno tipo I en ácido acético 0.2 N a RT durante 1 h.
- Lavar rápidamente 3 veces con 2 ml de PBS. Agregue 300 μL de hialuronato-H2 sódico marcado con fluorescemina (FAHA-H2) marcado con fluorescemina (diluido en PBS) a cada plato e incube durante la noche en RT. Lave nuevamente 3 veces con 2 ml de PBS. Después de aspirar el PBS, seque al aire la placa durante 5 minutos en un banco limpio.
NOTA: FAHA-H2 es un hialuronato de sodio marcado con fluoresceinamina con un peso molecular promedio que oscila entre 1.200 y 1.600 KDa. Se puede utilizar HA de un peso molecular apropiado de acuerdo con el diseño de la investigación.
3. Ensayo de migración en el plato recubierto de HA/Col1
NOTA: Se realizó un ensayo basado en el cierre de heridas utilizando huecos definidos de 500 μm libres de células en sustratos de Col1/HA utilizando insertos de cultivo de 2 pocillos (ver Tabla de materiales). Las células O9-1 expresan Tmem2, que es necesario para la adhesión y degradación de HA en el espacio extracelular9 (Figura 2 y Figura 3).
- Después de secar el plato con fondo de vidrio recubierto, adhiera los insertos de cultivo de 2 pocillos a los platos y llene los insertos externamente con 1 ml de PBS.
- Sembrar las células O9-1 en los pocillos a 1 x 104 células en 100 μL del medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 2% de suero fetal bovino (FBS) por inserto. Cultivar las células durante 2 días a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.
- Retire las inserciones con cuidado de los platos recubiertos con fondo de vidrio con pinzas. Lave los platos recubiertos con fondo de vidrio suavemente con 2 ml de 1x PBS para eliminar las células y los desechos celulares. Agregue 2 ml de DMEM fresco que contenga 2% de FBS en los platos de cultivo.
- Capture imágenes de contraste de fase ahora como punto de inicio utilizando un microscopio de fluorescencia todo en uno en modo monocromo con ajustes de alta resolución (ganancia a 6 dB, sin agrupación). En este estudio se utilizaron lentes objetivas con aumentos de 4x a 20x para obtener imágenes (ver Tabla de materiales).
NOTA: Capture las imágenes de contraste de fase con las barras de escala correspondientes y guárdelas en formato TIFF. - Cultivar las células durante 48 h adicionales a 37 °C y 5% deCO2. Capture imágenes de contraste de fase a las 24 h y 48 h en cultivo utilizando el microscopio de fluorescencia todo en uno.
- Fijar las células a las 48 h con 1 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 15 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Luego, lave los platos 3 veces durante 5 minutos cada uno con 1 ml de PBS fresco.
- Coloque un cubreobjetos con medio de montaje (ver Tabla de materiales) para una observación morfológica adicional.
NOTA: Los platos pueden ser fotografiados inmediatamente o almacenados hasta 2 meses a 4 °C. - Opcional: Inmunomarcar las células en busca de proteínas de interés.
NOTA: Aquí se describe como ejemplo un protocolo para detectar el complejo de adhesión focal (FA) utilizando un anticuerpo monoclonal antivinculina derivado del ratón (consulte la Tabla de materiales).- Incubar los platos (a partir del paso 3.6) con 0,5 ml de tampón de bloqueo (5% de suero normal de cabra en PBS) durante 60 min.
NOTA: Elija un tampón de bloqueo apropiado para el anticuerpo primario. Un tampón de bloqueo típico sería un 5% de suero normal de la misma especie que el anticuerpo secundario utilizado. - Preparar el anticuerpo primario diluido en tampón de dilución de anticuerpos (suero de cabra normal al 1% en PBS). Incubar los platos con 0,5 ml de anticuerpo primario diluido durante la noche a 4 °C.
NOTA: Elija el tampón de dilución de anticuerpos adecuado. Por lo general, el anticuerpo se usa en una dilución 1:50-1:200. - Enjuague 3 veces durante 5 minutos cada una con 2 ml de PBS. Prepare el anticuerpo secundario anti-ratón derivado de cabra diluido en el tampón de dilución de anticuerpos (suero de cabra normal al 1% en PBS). Incubar los platos con 0,5 ml de anticuerpo secundario diluido durante 1-3 h a temperatura ambiente.
NOTA: Normalmente, el anticuerpo secundario se utiliza en una dilución 1:500-1:1.000. DAPI se puede utilizar para teñir los núcleos. - Enjuague 3 veces con 2 ml de PBS durante 5 minutos cada vez. Coloque el cubreobjetos con 50 μL de medio de montaje.
NOTA: Las antenas se pueden visualizar utilizando el microscopio de fluorescencia todo en uno con un filtro GFP (excitación: 470/40, emisión: 525/50) y un filtro TexasRed (excitación: 560/40, emisión: 630/75) en modo monocromo con ajustes de alta resolución (ganancia a 6 dB, sin agrupación). En este estudio se utilizaron lentes objetivas con aumentos de 4x a 20x para la obtención de imágenes.
NOTA: El portaobjetos puede almacenarse hasta 2 meses a 4 °C.
- Incubar los platos (a partir del paso 3.6) con 0,5 ml de tampón de bloqueo (5% de suero normal de cabra en PBS) durante 60 min.
4. Análisis de datos
- Abra el software ImageJ 1.51s. En la ventana ImageJ, seleccione Archivo > Abrir en la barra de menús para abrir el archivo de imagen guardado.
- Para ajustar la escala de medición, dibuje una línea de la misma distancia que la barra de escala. Vaya a Analizar > Definir escala y escriba la distancia y las unidades conocidas de la línea en los cuadros correspondientes de la ventana Definir escala .
- Dibuje una línea recta entre el espacio de celda y presione Analizar > Medir para transferir los valores a una ventana de datos. Mida al menos cinco posiciones diferentes en cada muestra y promedie las distancias para obtener los datos representativos de la muestra. Realice los análisis estadísticos utilizando el software apropiado (ver Tabla de materiales).
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Representative Results
Se realizó un ensayo de migración en sustratos mixtos compuestos de Col1 y HA de alto peso molecular (peso molecular promedio: 1.200-1.400 kDa) utilizando el protocolo descrito aquí. Se encontró que las células de O9-1 en el límite de la brecha migran fácilmente a la brecha rica en HA (Figura 4). La inmunotinción para un marcador de AF, la vinculina14, confirmó que las células O9-1 formaron adherencias focales (FA) en los sitios de degradación de HA (Figura 5).
Figura 1: Expresión de TMEM2 en NCCs. Secciones transversales del tubo neural de embriones Tmem2-FLAGKI en E9.0. (A) Las secciones en los niveles craneal y troncal del tubo neural fueron doblemente marcadas para la proteína TMEM2-FLAG y HA. La expresión de TMEM2 se observó en la placa neural y la región del borde del tubo neural (puntas de flecha llenas), mientras que estos sitios carecían de tinción de HA (puntas de flecha abiertas). (B) Doble etiquetado de las células de la cresta neural para TMEM2-FLAG y Sox9. Las secciones transversales del tubo neural E9.0 se tiñeron para TMEM2-FLAG y Sox9. Las NCC premigratorias y emigratorias positivas para Sox9 en el borde del tubo neural altamente expresan TMEM2. Abreviatura: nt = tubo neural. Barras de escala: (A) 300 μm; B) 100 μm. Adaptado con permiso de Inubushi et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Degradación de HA por TMEM2 en células O9-1. (A) Imágenes representativas de células O9-1 agotadas en Tmem2 y control cultivadas en una placa de cultivo regular (izquierda). (B) La expresión de Tmem2 en estas células se evaluó mediante qPCR, con Gapdh como control interno para la normalización (gráfico de barras). Las medias ± SD (n = 5) se muestran como barras horizontales. p < 0,001 por la prueba t de Student no pareada. Barra de escala, 5,0 μm. (C) Ensayo de hialuronidasa basada en células. Las células O9-1 agotadas en Tmem2 y control se cultivaron durante 48 h en cubreobjetos de vidrio recubiertos con AH fluorescente (FA-HA). La actividad degradante de HA se revela como áreas oscuras en el fondo fluorescente. El nivel de degradación de HA también se comparó cuantitativamente entre las células de O9-1 sin Tmem2 y de control como se describe en Materiales y métodos (gráfico de barras). Los datos representan la media ± SD de la intensidad de fluorescencia debajo de una célula en relación con la del área libre de células (n > 50 células por condición agrupadas de tres experimentos independientes). p < 0,001 por prueba t de Student no pareada. Adoptado con permiso de Inubushi et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Degradación de HA unido al sustrato en FAs en células O9-1. Se realizaron ensayos de hialuronidasa basados en células durante 16 h y las células se tiñeron para la vinculina. En las células O9-1 de control, la degradación de HA ocurre en AF positivas para vinculina. En las células O9-1 agotadas en Tmem2, la degradación de HA y la formación de FA disminuyen considerablemente. El número de FA por celda se comparó cuantitativamente entre las células de O9-1 sin Tmem2 y las células de control O9-1 (gráfico de barras). Los datos representan la media ± SD (n >30 células por condición agrupadas de tres experimentos independientes). p < 0,001 por la prueba t de Student no pareada. Adoptado con permiso de Inubushi et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de la migración celular O9-1 en un espacio libre de células en sustratos mixtos de Col1/HA. (A) El panel superior muestra los huecos al inicio del experimento (Día 0). Los paneles inferiores muestran imágenes de separación después de 24 h (Día 1) o 48 h (Día 2) de incubación. Barra de escala = 150 μm. (B) Un gráfico de barras que muestra el análisis cuantitativo de la migración celular. Los datos representan la media ± DE del área de brecha cubierta por las células migratorias en relación con el área de la brecha original (n = 5 por condición). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 por la prueba t de Student no pareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Degradación de HA en los sustratos mixtos Col1/HA en FAs en células O9-1. Las células O9-1 cultivadas en sustratos mixtos que consisten en Col1/HA fueron inmunomarcadas con anticuerpos anti-vinculina (rojo). Las manchas oscuras/rayas representan la actividad de degradación de HA en el sustrato FAHA-H2 (verde). Los sitios de degradación de HA y adherencias focales (vinculina) se colocalizaron en los sustratos mixtos (puntas de flecha). Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Varios componentes de ECM regulan la emigración/migración de NCC. Por ejemplo, la HA regula positivamente la migración de NCC 2,15. Curiosamente, un estudio basado en modelos genéticos de ratón de Tmem2, una hialuronidasa de superficie celular, elucidó el requisito de degradación de HA en la migración de NCC9. Los colágenos también son abundantes en la ECM que rodea el tubo neural16. Se ha demostrado que la decorina, un pequeño proteoglicano rico en leucina, regula la migración de NCC durante el desarrollo neuronal17. Otros componentes de la ECM, incluyendo laminina y fibronectina, influyen en la adhesión y migración de NCC18. Sin embargo, aún se desconocen las funciones específicas de los componentes de ECM en la migración de NCC.
El modelo in vitro descrito aquí tiene como objetivo examinar el comportamiento de los NCC migratorios que encuentran ECM rica en HA. Elegimos sustratos 2D, en lugar de 3D, debido a las dificultades para preparar geles compuestos de colágeno-HA con propiedades de gelificación uniformes. En un sistema de cultivo 2D, los gradientes espaciales de las concentraciones de factor soluble y las rigideces de los sustratos de la matriz extracelular son diferentes de los del tejido vivo19. Desde este punto de vista, un sistema de cultivo 3D tiene grandes ventajas y puede proporcionar una visión más profunda de los mecanismos de migración celular20,21. En este contexto, se prefiere configurar un sistema de ensayo 3D, si corresponde. Este modelo experimental in vitro puede ser aplicable para examinar el comportamiento de migración de NCC en respuesta a diferentes componentes de ECM. Esto permitiría una mejor comprensión de la base mecanicista de la migración NCC, que gobierna la morfogénesis embrionaria.
Las células O9-1 utilizadas en este estudio expresan de manera estable marcadores de células madre (CD44, Sca-1 y Bmi1) y marcadores de cresta neural (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 e Itgb1). En condiciones de cultivo no diferenciadoras, las células O9-1 mantienen características similares a las células madre multipotentes. Las células O9-1 tienen el potencial de diferenciarse en múltiples tipos de células, incluyendo osteoblastos, condrocitos, células musculares lisas y células gliales bajo condiciones de cultivo específicas12. Por lo tanto, las células O9-1 son una herramienta útil para investigar las propiedades moleculares de la migración y diferenciación craneal de NCC. Sin embargo, el uso de NCC primarios (por ejemplo, de tubos neurales embrionarios de pollo o ratón) en lugar de células O9-1 proporcionará datos más detallados para facilitar una mejor comprensión de la naturaleza de la migración de NCC.
En el ensayo de migración basado en el cierre de heridas, el NCC también proliferará y el aumento en el número de células también contribuirá a la expansión de la población celular en el área de brecha22. Para minimizar la proliferación durante el ensayo de cicatrización de heridas, la inanición sérica es el método más común en lugar del uso de agentes farmacológicos23. Sin embargo, los efectos de la inanición sérica deben probarse en cada tipo de célula.
El paso más crítico de este protocolo es agregar el recubrimiento covalente de HA a los platos con fondo de vidrio. El tratamiento superficial del vidrio con reactivos de silano se utiliza para el análisis de adherencias focales a sustratos ECM24. El trietoxisilano es un compuesto de organosilicio que contiene muchos grupos amino libres que pueden unirse a grupos hidroxilo libres en superficies de vidrio de sílice25. En este estudio se desarrolló y optimizó una técnica para producir una capa delgada y estable de silano en una superficie de vidrio de sílice utilizando trietoxisilano. La amina en la superficie de vidrio recubierta de trietoxisilano puede unirse a los grupos carboxilo en HA, inmovilizando químicamente HA en la superficie de vidrio8. Sin embargo, con este método, no es posible unir otros sustratos de ECM basados en proteínas a la superficie del vidrio. Por lo tanto, el glutaraldehído se usó aquí para inmovilizar químicamente el colágeno tipo I a través del acoplamiento de aminas al aldehído. En particular, el recubrimiento inadecuado de HA puede conducir a la eliminación del recubrimiento de HA incluso sin digestión enzimática (por ejemplo, por la acción de la fuerza mecánica durante la adhesión y migración celular). Es posible el recubrimiento con sustratos ECM en lugar de colágeno tipo I, siempre que los sustratos posean grupos amina. Sin embargo, pueden existir limitaciones en el recubrimiento covalente de la ECM en platos con fondo de vidrio debido a las propiedades químicas del sustrato; por lo tanto, puede ser necesario probar y error.
Aunque no es un modelo perfecto para imitar la migración de NCC en la ECM rica en HA que rodea el tubo neural, este experimento de migración in vitro puede ser útil para el análisis funcional de las moléculas involucradas en la migración de NCC in vivo . Además, este ensayo in vitro puede ser útil para la detección terapéutica de fármacos para acelerar o prevenir la degradación de HA, así como la migración de otros tipos de células, incluidos los fibroblastos de la piel y los queratinocitos.
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Disclosures
El autor declara que no existen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Expreso un gran agradecimiento a Fumitoshi Irie y Yu Yamaguchi por su aliento y amables sugerencias para establecer este método. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para programas de investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (#19KK0232 a T.I., #20H03896 a T.I.). El método original para el recubrimiento de HA sobre sustratos de vidrio y ensayos de degradación de HA in situ en los sustratos se describió en Yamamoto et al. (2017)8, mientras que el método para la preparación de sustratos mixtos de HA/Col1 se describió en Irie et al. (2021)7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
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