Summary
Bu protokol, nöral krest hücrelerinin hyaluronan bakımından zengin hücre dışı matrise in vivo göçünde rol oynayan moleküllerin fonksiyonel analizi için uygun bir in vitro migrasyon deneyini özetlemektedir.
Abstract
Nöral krest hücreleri (NCC'ler), nöral tüpün dorsal bölgesinden kaynaklanan yüksek oranda göçmen hücrelerdir. NCC'lerin nöral tüpten göçü, NCC üretimi ve ardından hedef bölgelere doğru göçleri için önemli bir süreçtir. Çevreleyen nöral tüp dokuları da dahil olmak üzere NCC'lerin göç yolu, hyaluronan (HA) bakımından zengin hücre dışı matriksi içerir. Bu çalışmada, nöral tüpten HA bakımından zengin bu çevre dokulara NCC migrasyonunu modellemek için, HA (ortalama moleküler ağırlık: 1.200-1.400 kDa) ve kollajen tip I'den (Col1) oluşan karışık bir substrat migrasyon testi yapılmıştır. Bu migrasyon testi, NCC hücre hattının, O9-1 hücrelerinin, karışık substrat üzerinde yüksek oranda göçmen olduğunu ve HA kaplamasının göç sırasında fokal adezyonlar bölgesinde bozulduğunu göstermektedir. Bu in vitro model, NCC göçünde yer alan mekanik temelin daha fazla araştırılması için yararlı olabilir. Bu protokol, NCC göçünü incelemek için farklı substratları iskele olarak değerlendirmek için de geçerlidir.
Introduction
Nöral krest hücreleri (NCC'ler), gelişmekte olan embriyolarda bulunan multipotent bir hücre popülasyonudur ve nörülasyon sırasında nöral plak sınırından köken alırlar. Periferik sinir sistemi, kardiyovasküler sistem, kraniyofasiyal dokular ve iskelet1 dahil olmak üzere çeşitli dokuların oluşumuna katkıda bulunurlar. Nöral plak sınırında indüksiyon ve NCC spesifikasyonundan sonra, NCC'ler nöroepitelden göç eder ve NCC kaynaklı doku bölgelerine doğru göç eder1.
Hyaluronan (HA), hücre dışı matriksin (ECM) bir bileşeni olarak çeşitli dokulara dağılmış sülfatlanmamış bir glikozaminoglikandır. HA'nın embriyo gelişimindeki önemi, hyaluronan metabolizmasından sorumlu genlerin ablasyonu yoluyla model sistemlerde gösterilmiştir. Örneğin, Xenopus'taki hyaluronan sentaz genlerindeki (Has1 ve Has2) mutasyonların NCC migrasyon kusurlarına ve kraniyofasiyal malformasyon2'ye yol açtığı bulunmuştur. Ek olarak, HA bağlayıcı proteoglikanlar, agrekan ve versikanın, NCC migrasyonu3 üzerinde inhibitör etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Farelerde, Has2 ablasyonu endokardiyal yastık oluşumunda ciddi kusurlara yol açarak gebeliğin ortasında (E9.5-10) öldürücülük 4,5,6 ile sonuçlanır.
Bir hücre yüzeyi hyaluronidaz olan transmembran protein 2'nin (Tmem2), yakın zamanda, yapışma bölgelerinde matriksle ilişkili HA'yı çıkararak integrin aracılı kanser hücresi yapışmasını ve göçünü teşvik etmede kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir 7,8. Daha yakın zamanlarda, Inubushi ve ark.9, Tmem2'deki bir eksikliğin, NCC göçü / göçü ve sağkalımındaki anormallikler nedeniyle ciddi kraniyofasiyal defektlere yol açtığını göstermiştir. Önceki çalışmada9, NCC oluşumu ve migrasyonu sırasında Tmem2 ekspresyonu analiz edilmiştir. Tmem2 ekspresyonu, NCC delaminasyon bölgesinde ve Sox9-pozitif NCC'lerin göç etmesinde gözlendi (Şekil 1). Ek olarak, Tmem2-tükenmiş fare O9-1 nöral krest hücrelerini kullanarak, çalışma, Tmem2'nin in vitro ekspresyonunun, O9-1 hücrelerinin fokal adezyonlar oluşturması ve HA içeren substratlara göçleri için gerekli olduğunu göstermiştir (Şekil 2 ve Şekil 3)9.
Bu sonuçlar, Tmem2'nin NCC yapışması ve HA bakımından zengin ECM yoluyla migrasyon için de önemli olduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir. Bununla birlikte, HA bakımından zengin ECM içindeki NCC yapışması ve göçünün moleküler mekanizması hala belirsizdir. Bu nedenle, HA bakımından zengin ECM içinde NCC yapışmasını ve göçünü tam olarak araştırmak için bir in vitro kültür deneysel sistemi kurmak gereklidir.
Hücre göçünü test etmede kullanılan sayısız yaklaşımdan, hücre yarası kapatma temelli tahlil, fizyoloji ve onkoloji alanlarında sıklıkla kullanılan basit bir yöntemdir10. Bu yaklaşım, in vivo fenotiple ilgisi nedeniyle yararlıdır ve hücre göçü sırasında ilaçların ve kemoattractanların rollerinin belirlenmesinde etkilidir11. Hem tüm hücre kütlelerinin hem de tek tek hücrelerin migrasyon kabiliyetini, zaman içindeki hücre boşluk mesafelerini ölçerek değerlendirmek mümkündür11. Bu makalede, nöral tüpü çevreleyen HA bakımından zengin dokulara NCC migrasyonunu modellemek için modifiye edilmiş in vitro yara kapatma temelli bir tahlil tanıtılmıştır. Bu prosedür, ECM iskelesinin NCC göçündeki rolünü analiz etmek için farklı ECM bileşenlerini (yani, kollajenler, fibronektin ve laminin) incelemek için de geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Osaka Üniversitesi Diş Hekimliği Enstitüsü Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Fare kranial nöral krest hücrelerinin kültürü
NOT: Bu çalışmada kullanılan nöral krest hücre hattı, başlangıçta Wnt1-Cre'den türetilen O9-1 hücrelerini içerir; E8.5 fare embriyolarından izole edilen R26R-GFP eksprese eden hücreler12 (tartışmaya bakınız). O9-1 hücrelerini kültürlemek için burada açıklanan yöntem, daha önce belirlenmiş bir protokol13'ü izler.
- Bazal membran matris kaplı plakayı hazırlayın.
- Bazal membran matrisini (bakınız Malzeme Tablosu) buz üzerinde çözün. Matrisi 1:50 soğutulmuş 1x PBS ile seyreltin ve buzda tutun.
- 10 cm'lik bir kültür plakasını 10 mL seyreltilmiş bazal membran matris çözeltisi ile kaplayın. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve kullanmadan önce matrisi aspire edin.
- Plakayı 2 mL PBS ile 3x yıkayın.
- Kültür O9-1 hücreleri bazal membran matris kaplı plaka üzerinde.
- Tüm embriyonik kök (ES) hücre ortamını (bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'de bir su banyosunda ısıtın.
- O9-1 hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın (bkz. Tam ES hücre ortamı ile hücre konsantrasyonunu 1.1 × 106 / mL'ye ayarlayın.
- Matris kaplı 10 cm'lik kültür plakasına 8 mL önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve O9-1 hücrelerini 1.1 x 106 hücre / plakada tohumlayın. %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, ortamı taze tam ES hücre ortamı ile değiştirin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış). Bundan sonra her 2-3 günde bir taze ortamla değiştirin.
NOT: Hücreler yaklaşık% 80 akışkan olduğunda (kaplamadan 3-4 gün sonra), % 0.25 tripsin-EDTA ile ayrıştırılabilir ve daha sonra kullanılmak üzere daha fazla geçirilebilir veya dondurulabilir. O9-1 hücrelerinin temsili görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. - Tripsinizasyondan önce kültür plakasını 2 mL 1x PBS ile yıkayın. 2 mL önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Tam hücre ayrılmasını kontrol edin; gerekirse plakanın yan tarafına birkaç kez hafifçe dokunun.
- Kültür plakasına 2 mL önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve ayrışmış hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Tüpü 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
- Hücre topağını rahatsız etmeden süpernatantı atın. Ardından, tüpe 2 mL önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve pipetleme ile hücreleri iyice askıya alın. Hücreleri istenen hücre yoğunluğunda yeni bir kültür plakasına tohumlayın.
- Alternatif olarak, tam ES hücre ortamı yerine tüpe %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren 1 mL hücre dondurma ortamı ekleyerek ve hücreleri iyice askıya alarak dondurulmuş bir hücre stoğu hazırlayın. Hücre süspansiyonunu kriyo tüplerine aktarın ve -80 ° C'de saklayın.
2. HA/Col1 kaplı tabağın hazırlanması
NOT: HA / Col1'i cam tabanlı tabaklara kaplamanın orijinal yöntemi Irie ve ark.7 tarafından önerilmiştir.
- 3,5 cm'lik cam tabanlı bir kaba dikkatlice 50 μL seyreltilmemiş trietoksisilan ekleyin ( bkz. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin ve ışıktan koruyun.
NOT: Trietoksisilan ile inkübasyon 5 dakikayı geçmemelidir. Bu, kaplama verimliliğini etkileyebilir ve istenmeyen ürünler üretebilir. - Kabı 2 mL damıtılmış su ile 3 kat hızlı bir şekilde yıkayın. Çanak başına PBS'de 100x seyreltilmiş 50 μL% 0.25 glutaraldehit ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- 2 mL PBS ile hızlı bir şekilde 4 kat yıkayın. Daha sonra, bulaşıkları RT'de 1 saat boyunca 0.2 N asetik asit içinde 300 μL kollajen tip I ile kaplayın.
- 2 mL PBS ile 3 kat hızlı bir şekilde yıkayın. Her bir yemeğe 300 μL 200 μg / mL floresenamin etiketli sodyum hyaluronat-H2 (FAHA-H2) (PBS'de seyreltilmiş) ekleyin ve RT'de gece boyunca inkübe edin. PBS'yi aspire ettikten sonra, plakayı temiz bir tezgahta 5 dakika boyunca hava ile kurutun.
NOT: FAHA-H2, ortalama moleküler ağırlığı 1.200-1.600 KDa arasında değişen floreseinamin etiketli bir sodyum hyaluronattır. Araştırma tasarımına göre uygun bir moleküler ağırlıkta HA kullanılabilir.
3. HA/Col1 kaplı çanak üzerinde migrasyon testi
NOT: Col1/HA substratlarında tanımlanmış 500 μm hücresiz boşluklar kullanılarak yara kapatma bazlı bir tahlil, 2 kuyucuklu kültür ekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. O9-1 hücreleri, HA'nın hücredışı boşlukta yapışması ve bozulması için gerekli olan Tmem2'yi eksprese eder 9 (Şekil 2 ve Şekil 3).
- Kaplanmış cam tabanlı kabı kuruttuktan sonra, 2 kuyucuklu kültür eklerini bulaşıklara takın ve uçları harici olarak 1 mL PBS ile doldurun.
- O9-1 hücrelerini, uç başına %2 fetal sığır serumu (FBS) içeren 100 μL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) içindeki 1 x 104 hücredeki kuyucuklara tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de 2 gün boyunca% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde kültürleyin.
- Uçları cımbızla kaplanmış cam tabanlı tabaklardan dikkatlice çıkarın. Hücreleri ve hücre kalıntılarını temizlemek için kaplanmış cam tabanlı bulaşıkları 2 mL 1x PBS ile nazikçe yıkayın. Kültür yemeklerine %2 FBS içeren 2 mL taze DMEM ekleyin.
- Yüksek çözünürlüklü ayarlara sahip tek renkli modda hepsi bir arada floresan mikroskobu kullanarak şimdi başlangıç zamanı noktası olarak faz kontrastlı görüntüler yakalayın (6 dB'de kazanç, gruplama yok). Bu çalışmada görüntüleme için 4x ila 20x büyütmeli objektif lensler kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu).
NOT: Faz kontrastlı görüntüleri karşılık gelen ölçek çubuklarıyla yakalayın ve TIFF biçiminde kaydedin. - Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de ek bir 48 saat boyunca kültürleyin. Hepsi bir arada floresan mikroskobunu kullanarak kültürde 24 saat ve 48 saatte faz kontrastlı görüntüler yakalayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca veya gece boyunca 4 ° C'de 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile 48 saatte sabitleyin. Ardından, bulaşıkları her biri 1 mL taze PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- Daha fazla morfolojik gözlem için montaj ortamına sahip bir kapak fişi yerleştirin (bkz.
NOT: Tabaklar hemen görüntülenebilir veya 4 °C'de 2 aya kadar saklanabilir. - İsteğe bağlı: İlgilenilen proteinler için hücreleri immüno-etiketleyin.
NOT: Fare kaynaklı monoklonal anti-vinkülin antikoru kullanarak fokal adezyon (FA) kompleksini tespit etmek için bir protokol (bkz.- Bulaşıkları (adım 3.6'dan itibaren) 0.5 mL bloke edici tamponla (PBS'de% 5 normal keçi serumu) 60 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Birincil antikor için uygun bir bloke edici tampon seçin. Tipik bir bloke edici tampon, kullanılan ikincil antikor ile aynı türden% 5 normal serum olacaktır. - Seyreltilmiş primer antikoru antikor seyreltme tamponunda hazırlayın (PBS'de %1 normal keçi serumu). Bulaşıkları gece boyunca 4 ° C'de 0.5 mL seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.
NOT: Uygun antikor seyreltme tamponunu seçin. Tipik olarak, antikor 1:50-1:200 seyreltmede kullanılır. - Her biri 2 mL PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez durulayın. Seyreltilmiş keçi kaynaklı anti-fare sekonder antikorunu antikor seyreltme tamponunda hazırlayın (PBS'de %1 normal keçi serumu). Bulaşıkları oda sıcaklığında 1-3 saat boyunca 0.5 mL seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin.
NOT: Tipik olarak, ikincil antikor 1:500-1:1.000 seyreltmede kullanılır. DAPI, çekirdekleri boyamak için kullanılabilir. - Her seferinde 5 dakika boyunca 2 mL PBS ile 3 kat durulayın. Kapak kapağını 50 μL montaj ortamına yerleştirin.
NOT: Çanaklar, GFP filtreli hepsi bir arada floresan mikroskobu (uyarma: 470/40, emisyon: 525/50) ve TexasRed filtreli (uyarım: 560/40, emisyon: 630/75) tek renkli modda yüksek çözünürlüklü ayarlarla (6 dB'de kazanç, ciltleme yok) görüntülenebilir. Bu çalışmada görüntüleme için büyütmeleri 4x-20x arasında olan objektif lensler kullanılmıştır.
NOT: Slayt, 4 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.
- Bulaşıkları (adım 3.6'dan itibaren) 0.5 mL bloke edici tamponla (PBS'de% 5 normal keçi serumu) 60 dakika boyunca inkübe edin.
4. Veri analizi
- ImageJ 1.51s yazılımını açın. ImageJ penceresinde, kaydedilen görüntü dosyasını açmak için menü çubuğundan Dosya > Aç'ı seçin.
- Ölçüm ölçeğini ayarlamak için, ölçek çubuğuyla aynı mesafede bir çizgi çizin. Ölçeği Analiz Et > Ayarla'ya gidin ve çizginin bilinen mesafesini ve birimlerini Ölçek ayarla penceresinin uygun kutularına yazın.
- Hücre boşluğu arasına düz bir çizgi çizin ve değerleri bir veri penceresine aktarmak için Analyze > Measure (Ölçüm) düğmesine basın. Her örnekte en az beş farklı konum ölçün ve temsili örnek verilerini elde etmek için mesafelerin ortalamasını alın. İstatistiksel analizleri uygun yazılımları kullanarak gerçekleştirin (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol kullanılarak Col1 ve yüksek moleküler ağırlıklı HA'dan (ortalama moleküler ağırlık: 1.200-1.400 kDa) oluşan karışık substratlar üzerinde bir migrasyon testi yapıldı. Boşluğun sınırındaki O9-1 hücrelerinin HA bakımından zengin boşluğa kolayca göç ettiği bulunmuştur (Şekil 4). Bir FA belirteci olan vinkülin14 için immün boyama, O9-1 hücrelerinin HA yıkımı bölgelerinde fokal adezyonlar (FA'lar) oluşturduğunu doğruladı (Şekil 5).
Şekil 1: NCC'lerde TMEM2 ekspresyonu. E9.0'da Tmem2-FLAGKI embriyolarının nöral tüpünün enine kesitleri. (A) Nöral tüpün kranial ve gövde seviyelerindeki kesitler TMEM2-FLAG proteini ve HA için çift etiketlendi. TMEM2 ekspresyonu nöral plakada ve nöral tüpün sınır bölgesinde (dolu ok uçları) gözlenirken, bu bölgeler HA boyamasından yoksundu (açık ok uçları). (B) TMEM2-FLAG ve Sox9 için nöral krest hücrelerinin çift etiketlenmesi. E9.0 nöral tüpün enine kesitleri TMEM2-FLAG ve Sox9 için boyandı. Nöral tüpün kenarındaki Sox9-pozitif göç öncesi ve göç eden NCC'ler yüksek oranda TMEM2 eksprese etti. Kısaltma: nt = nöral tüp. Ölçek çubukları: (A) 300 μm; (B) 100 μm. Inubushi ve ark.9'un izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: O9-1 hücrelerinde TMEM2 tarafından HA'nın parçalanması. (A) Normal bir kültür kabında kültürlenen Tmem2 tükenmiş ve kontrol O9-1 hücrelerinin temsili görüntüleri (solda). (B) Bu hücrelerdeki Tmem2 ekspresyonu qPCR ile değerlendirildi ve normalizasyon için bir iç kontrol olarak Gapdh kullanıldı (çubuk grafik). SD ± (n = 5) yatay çubuklar olarak gösterildiği anlamına gelir. p < 0.001, eşlenmemiş Student's t-testi ile. Ölçek çubuğu, 5.0 μm. (C) Hücre bazlı hyaluronidaz testi. Tmem2-tükenmiş ve kontrol O9-1 hücreleri, floresanlı HA (FA-HA) ile kaplanmış cam kapaklar üzerinde 48 saat boyunca kültürlendi. HA bozunma aktivitesi, floresan arka planda karanlık alanlar olarak ortaya çıkar. HA bozunma düzeyi ayrıca Gereç ve Yöntemler'de (bargraf) açıklandığı gibi Tmem2-tükenmiş ve kontrol O9-1 hücreleri arasında kantitatif olarak karşılaştırıldı. Veriler± hücresiz alandakine göre bir hücrenin altındaki floresan yoğunluğunun ortalama SD'sini temsil eder (üç bağımsız deneyden toplanan koşul başına n > 50 hücre). p < 0.001, eşlenmemiş Öğrencinin t-testi ile. Inubushi ve ark.9'un izniyle kabul edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: O9-1 hücrelerindeki FA'larda substrata bağlı HA'nın bozulması. Hücre bazlı hyaluronidaz testleri 16 saat boyunca yapıldı ve hücreler vinkülin için boyandı. Kontrol O9-1 hücrelerinde, vinkülin pozitif FA'larda HA yıkımı meydana gelir. Tmem2-tükenmiş O9-1 hücrelerinde, HA bozunması ve FA oluşumu büyük ölçüde azalır. Hücre başına FA sayısı, Tmem2-tükenmiş ve kontrol O9-1 hücreleri arasında nicel olarak karşılaştırıldı (çubuk grafik). Veriler ortalama ± SD'yi (üç bağımsız deneyden toplanan koşul başına n >30 hücre) temsil eder. p < 0.001, eşlenmemiş Student's t-testi ile. Inubushi ve ark.9'un izniyle kabul edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Karışık Col1/HA substratlarında hücresiz bir boşluğa O9-1 hücre göçünün temsili görüntüleri. (A) Üst panel, denemenin başlangıcındaki boşlukları gösterir (Gün 0). Alt paneller 24 saat (1. Gün) veya 48 saat (2. Gün) inkübasyondan sonra boşluk görüntüleri gösterir. Ölçek çubuğu = 150 μm. (B) Hücre göçünün nicel analizini gösteren bir çubuk grafik. Veriler, göçmen hücreler tarafından kapsanan boşluk alanının orijinal boşluğun alanına göre ortalama ± SD'sini temsil eder (koşul başına n = 5). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, eşlenmemiş Öğrencinin t-testi ile. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: O9-1 hücrelerindeki FA'larda karışık Col1 / HA substratlarında HA'nın bozulması. Col1/HA'dan oluşan karışık substratlar üzerinde kültürlenen O9-1 hücreleri, anti-vinkülin antikoru (kırmızı) ile immün olarak etiketlendi. Koyu lekeler/çizgiler FAHA-H2 substratındaki (yeşil) HA bozunma aktivitesini temsil eder. HA bozunması ve fokal adezyonlar (vinkülin) bölgeleri karışık substratlarda (ok uçları) birlikte lokalize edildi. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli ECM bileşenleri NCC göçünü/göçünü düzenler. Örneğin, HA, NCC göçünü 2,15 pozitif olarak düzenler. İlginç bir şekilde, bir hücre yüzeyi hyaluronidaz olan Tmem2'nin genetik fare modellerine dayanan bir çalışma, NCC migrasyonunda HA bozunmasının gerekliliğini aydınlatmıştır9. Kollajenler ayrıca nöral tüp16'yı çevreleyen ECM'de de bol miktarda bulunur. Küçük bir lösin bakımından zengin proteoglikan olan Decorin'in, nöral gelişim sırasında NCC göçünü düzenlediği gösterilmiştir17. Laminin ve fibronektin dahil olmak üzere diğer ECM bileşenleri, NCC yapışmasını ve göçünü etkiler18. Bununla birlikte, ECM bileşenlerinin NCC göçündeki spesifik rolleri hala bilinmemektedir.
Burada açıklanan in vitro model, HA bakımından zengin ECM ile karşılaşan göç eden NCC'lerin davranışını incelemeyi amaçlamaktadır. Homojen jelasyon özelliklerine sahip kompozit kollajen-HA jellerinin hazırlanmasındaki zorluklar nedeniyle 3D yerine 2D substratları seçtik. Bir 2B kültür sisteminde, çözünür faktör konsantrasyonlarının uzamsal gradyanları ve hücre dışı matris substratlarının sertlikleri, canlı doku19'unkinden farklıdır. Bu açıdan bakıldığında, bir 3D kültür sisteminin büyük avantajları vardır ve hücre göç mekanizmaları hakkında daha derin bilgiler sağlayabilir20,21. Bu bağlamda, eğer mümkünse, bir 3D tahlil sistemi kurulması tercih edilir. Bu in vitro deneysel model, değişen ECM bileşenlerine yanıt olarak NCC migrasyon davranışını incelemek için uygulanabilir olabilir. Bu, embriyo morfogenezini yöneten NCC göçünün mekanik temelinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Bu çalışmada kullanılan O9-1 hücreleri, kök hücre belirteçlerini (CD44, Sca-1 ve Bmi1) ve nöral krest belirteçlerini (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 ve Itgb1) kararlı bir şekilde eksprese eder. Farklılaşmayan kültür koşulları altında, O9-1 hücreleri çok güçlü kök hücre benzeri özellikleri korur. O9-1 hücreleri, belirli kültür koşulları altında osteoblastlar, kondrositler, düz kas hücreleri ve glial hücreler dahil olmak üzere çoklu hücre tiplerine farklılaşma potansiyeline sahiptir12. Bu nedenle, O9-1 hücreleri kraniyal NCC göçü ve farklılaşmasının moleküler özelliklerini araştırmak için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, O9-1 hücreleri yerine birincil NCC'lerin (örneğin, tavuk veya fare embriyonik nöral tüplerinden) kullanılması, NCC göçünün doğasının daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için daha ayrıntılı veriler sağlayacaktır.
Yara kapatma temelli migrasyon testinde NCC de çoğalacak ve hücre sayısındaki artış da hücre popülasyonunun boşluk alanı22'ye genişlemesine katkıda bulunacaktır. Yara iyileşmesi testi sırasında proliferasyonu en aza indirmek için, farmakolojik ajanlar kullanmak yerine serum açlığı en yaygın yöntemdir23. Bununla birlikte, serum açlığının etkileri her hücre tipinde test edilmelidir.
Bu protokolün en kritik adımı, cam tabanlı tabaklara HA'nın kovalent kaplamasının eklenmesidir. Silan reaktifleri ile cam yüzey işleme, ECM substratlarına fokal yapışmaların analizi için kullanılır24. Trietoksisilan silika cam yüzeylerdeki serbest hidroksil gruplarına bağlanabilen birçok serbest amino grubu içeren bir organosilikon bileşiğidir25. Bu çalışmada, trietoksisilan kullanılarak silika cam yüzey üzerinde ince, stabil bir silan tabakası üretmek için bir teknik geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Trietoksisilan kaplı cam yüzeydeki amin, karboksil gruplarını HA'ya bağlayabilir ve sonuç olarak cam yüzey8'deki HA'yı kimyasal olarak hareketsiz hale getirebilir. Ancak bu yöntemle diğer protein bazlı ECM substratlarını cam yüzeye bağlamak mümkün değildir. Bu nedenle, glutaraldehit burada tip I kollajeni aldehit'e amin bağlantısı yoluyla kimyasal olarak hareketsiz hale getirmek için kullanılmıştır. Özellikle, yetersiz HA kaplama, enzimatik sindirim olmadan bile HA kaplamanın çıkarılmasına yol açabilir (örneğin, hücre yapışması ve göçü sırasında mekanik kuvvetin etkisiyle). Kollajen tip I yerine ECM substratları ile kaplama, substratların amin gruplarına sahip olması koşuluyla mümkündür. Bununla birlikte, substratın kimyasal özellikleri nedeniyle ECM'nin cam tabanlı tabaklara kovalent olarak kaplanmasında sınırlamalar olabilir; Bu nedenle, deneme yanılma gerekebilir.
Nöral tüpü çevreleyen HA bakımından zengin ECM'ye NCC göçünü taklit etmek için mükemmel bir model olmasa da, bu in vitro migrasyon deneyi, in vivo NCC göçünde yer alan moleküllerin fonksiyonel analizi için yararlı olabilir. Ek olarak, bu in vitro tahlil, HA yıkımını hızlandırmak veya önlemek için terapötik ilaç taramasının yanı sıra cilt fibroblastları ve keratinositler de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinin göçü için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar, hiçbir rakip çıkar olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Fumitoshi Irie ve Yu Yamaguchi'ye bu yöntemin oluşturulmasındaki teşvikleri ve nazik önerileri için büyük teşekkürlerimi sunuyorum. Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden (#19KK0232 T.I.'a, #20H03896 T.I.'a) bilimsel araştırma programları için hibe yardımı ile desteklenmiştir. HA'nın cam substratlar üzerine kaplanması ve substratlar üzerindeki in situ HA bozunma tahlilleri için orijinal yöntem Yamamoto et al. (2017) 8'de tarif edilirken, HA / Col1 karışık substratlarının hazırlanması için yöntem Irie et al. (2021) 7'de açıklanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
