Summary
Este protocolo descreve um experimento de migração in vitro adequado para a análise funcional das moléculas envolvidas na migração in vivo de células da crista neural para a matriz extracelular rica em hialuronano.
Abstract
As células da crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que se originam da região dorsal do tubo neural. A emigração de NCCs do tubo neural é um processo essencial para a produção de NCC e sua subsequente migração para os locais alvo. A rota migratória das NCCs, incluindo os tecidos do tubo neural circundantes, envolve matriz extracelular rica em hialuronano (AH). Para modelar a migração de NCC para esses tecidos circundantes ricos em AH a partir do tubo neural, um ensaio misto de migração de substrato consistindo de AH (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) e colágeno tipo I (Col1) foi estabelecido neste estudo. Este ensaio de migração demonstra que as células da linhagem celular NCC, O9-1, são altamente migratórias sobre o substrato misto e que o revestimento do AH é degradado no local das aderências focais no curso da migração. Este modelo in vitro pode ser útil para uma maior exploração das bases mecanicistas envolvidas na migração de NCC. Este protocolo também é aplicável para avaliar diferentes substratos como scaffolds para estudar a migração de NCC.
Introduction
As células da crista neural (NCCs) são uma população celular multipotente que está presente em embriões em desenvolvimento, e se originam da borda da placa neural durante a neurulação. Contribuem para a formação de uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso periférico, o sistema cardiovascular, os tecidos craniofaciais e o esqueleto1. Após indução e especificação da NCC na borda da placa neural, as NCCs emigram do neuroepitélio e migram para sítios teciduais derivados da NCC1.
O hialuronano (AH) é um glicosaminoglicano não sulfatado que se distribui em uma variedade de tecidos como componente da matriz extracelular (MEC). A importância do AH no desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada em sistemas modelo através da ablação de genes responsáveis pelo metabolismo do hialuronano. Por exemplo, mutações nos genes hialuronano sintase (Has1 e Has2) em Xenopus levaram a defeitos de migração de NCC e malformação craniofacial2. Além disso, os proteoglicanos ligantes de AH, agrecan e versican, têm sido relatados como exercendo efeitos inibitórios sobre a migração de NCC3. Em camundongos, a ablação de Has2 leva a graves defeitos na formação do coxim endocárdico, resultando em letalidade no meio da gestação (E9,5-10)4,5,6.
A proteína transmembrana 2 (Tmem2), uma hialuronidase de superfície celular, demonstrou recentemente desempenhar um papel crítico na promoção da adesão e migração de células cancerosas mediadas por integrinas, removendo o AH associado à matriz nos sítios de adesão 7,8. Mais recentemente, Inubushi et al.9 demonstraram que a deficiência de Tmem2 leva a graves defeitos craniofaciais devido a anormalidades na emigração/migração e sobrevida das NCC. No estudo anterior9, a expressão de Tmem2 foi analisada durante a formação e migração de NCC. A expressão de Tmem2 foi observada no local de delaminação de NCC e em NCCs Sox9-positivos emigrados (Figura 1). Além disso, utilizando células da crista neural O9-1 de camundongos depletadas de Tmem2, o estudo demonstrou que a expressão in vitro de Tmem2 foi essencial para que as células O9-1 formassem aderências focais e para sua migração para substratos contendo AH (Figura 2 e Figura 3)9.
Esses resultados indicam fortemente que o Tmem2 também é importante para a adesão e migração do NCC através da MEC rica em AH. No entanto, o mecanismo molecular de adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH ainda não está claro. Portanto, é necessário estabelecer um sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente a adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH.
Das inúmeras abordagens empregadas no teste da migração celular, o ensaio baseado no fechamento de feridas celulares é um método simples e frequentemente utilizado nos campos da fisiologia eoncologia10. Essa abordagem é útil devido à sua relevância para o fenótipo in vivo e é eficaz na determinação do papel de drogas e quimioatrativos durante a migração celular11. É possível avaliar a capacidade de migração tanto de massas celulares inteiras quanto de células individuais medindo as distâncias de gap celular ao longo do tempo11. Neste manuscrito, um ensaio modificado in vitro baseado no fechamento de feridas é introduzido para modelar a migração de NCC para tecidos ricos em AH ao redor do tubo neural. Esse procedimento também é aplicável para estudar diferentes componentes da MEC (i.e., colágenos, fibronectina e laminina) para analisar o papel do arcabouço da MEC na migração da NCC.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Escola de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade de Osaka.
1. Cultura de células da crista neural do crânio de camundongos
NOTA: A linhagem celular da crista neural utilizada neste estudo compreende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expressam R26R-GFP isoladas de embriões de camundongo E8.512 (ver discussão). O método aqui descrito para a cultura de células O9-1 segue um protocolo previamenteestabelecido13.
- Prepare a placa revestida com matriz de membrana basal.
- Descongelar a matriz da membrana basal (ver Tabela de Materiais) no gelo. Diluir a matriz 1:50 em PBS refrigerado 1x e manter no gelo.
- Revestir uma placa de cultura de 10 cm com 10 mL da solução diluída da matriz basal-membrana. Incubar a placa à temperatura ambiente por 1 h e aspirar a matriz antes do uso.
- Lave a placa 3x com 2 mL de PBS.
- Cultura de células O9-1 na placa revestida com matriz da membrana basal.
- Aquecer o meio de células estaminais embrionárias (ES) completo (ver Tabela de Materiais) em banho-maria a 37 °C.
- Misture suavemente a suspensão de células O9-1 (consulte Tabela de Materiais) e conte o número de células usando um contador de células automatizado (consulte Tabela de Materiais). Ajustar a concentração celular para 1,1 × 106/mL com meio celular ES completo.
- Adicionar 8 mL de meio de célula ES completo pré-aquecido à placa de cultura de 10 cm revestida com matriz e semear as células O9-1 a 1,1 x 106 células/placa. Incubar a 37 °C numa estufa humidificada a 5% CO2 .
- No dia seguinte, substitua o meio por meio de célula ES completo fresco (pré-aquecido a 37 °C). Substitua por meio fresco a cada 2-3 dias depois.
NOTA: Quando as células são aproximadamente 80% confluentes (3-4 dias após o plaqueamento), elas podem ser dissociadas com 0,25% de tripsina-EDTA e passadas posteriormente ou congeladas para uso posterior. Imagens representativas das células O9-1 são mostradas na Figura 1. - Lavar a placa de cultura com 2 mL de PBS 1x antes da tripsinização. Adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% pré-aquecido e incubar por 5 min a 37 °C. Verifique se há descolamento completo da célula; Toque suavemente na lateral do prato algumas vezes, se necessário.
- Adicionar 2 mL de meio celular ES completo pré-aquecido à placa de cultura e transferir as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar o tubo a 300 x g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Em seguida, adicione 2 mL de meio celular ES completo pré-aquecido ao tubo e ressuspenda completamente as células por pipetagem. Semeando as células em uma nova placa de cultura na densidade celular desejada.
- Alternativamente, prepare um estoque de células congeladas adicionando 1 mL de meio de congelamento celular contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) ao tubo no lugar do meio de célula ES completo e ressuspendendo completamente as células. Transfira a suspensão celular para tubos de crio e armazene a -80 °C.
2. Preparo do prato revestido com HA/Col1
NOTA: O método original de revestimento de HA/Col1 em placas com fundo de vidro foi proposto por Irie et al.7.
- Adicione cuidadosamente 50 μL de trietoxissilano não diluído a um prato com fundo de vidro de 3,5 cm (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente (TR) e proteger da luz.
NOTA: A incubação com trietoxisilano não deve exceder 5 min. Isso pode afetar a eficiência do revestimento e produzir produtos indesejáveis. - Lave o prato rapidamente 3x com 2 mL de água destilada. Adicionar 50 μL de glutaraldeído a 0,25%, diluído 100x em PBS, por prato, e incubar em TR por 30 min.
- Lave rapidamente 4x com 2 mL de PBS. Em seguida, revestir as placas com 300 μL de colágeno tipo I em ácido acético 0,2 N em TR por 1 h.
- Lave rapidamente 3x com 2 mL de PBS. Adicionar 300 μL de 200 μg/mL de hialuronato de sódio marcado com fluoresceinamina-H2 (FAHA-H2) (diluído em PBS) a cada prato e incubar durante a noite em RT. Lave novamente 3x com 2 mL de PBS. Após a aspiração do PBS, seque a placa ao ar por 5 min em uma bancada limpa.
NOTA: FAHA-H2 é um hialuronato de sódio marcado com fluoresceinamina com peso molecular médio variando de 1.200-1.600 KDa. AH de peso molecular adequado pode ser utilizado de acordo com o desenho da pesquisa.
3. Ensaio de migração na placa revestida com HA/Col1
NOTA: Um ensaio baseado no fechamento da ferida usando lacunas livres de células definidas de 500 μm em substratos de Col1/HA foi realizado usando pastilhas de cultura de 2 poços (ver Tabela de Materiais). As células O9-1 expressam Tmem2, necessário para a adesão e degradação do AH no espaçoextracelular9 (Figura 2 e Figura 3).
- Depois de secar a placa de fundo de vidro revestida, anexe as pastilhas de cultura de 2 poços às placas e preencha as pastilhas externamente com 1 mL de PBS.
- Semeando as células O9-1 nos poços a 1 x 104 células em 100 μL de meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 2% de soro fetal bovino (SFB) por inserção. Cultivar as células por 2 dias a 37 °C em estufa umidificada com CO2 a 5%.
- Retire cuidadosamente as pastilhas das placas com fundo de vidro revestido com uma pinça. Lave suavemente os pratos com fundo de vidro revestido com 2 mL de 1x PBS para remover as células e os detritos celulares. Adicionar 2 mL de DMEM fresco contendo 2% de FBS nos pratos de cultura.
- Capture imagens de contraste de fase agora como o ponto de partida usando um microscópio de fluorescência tudo-em-um em modo monocromático com configurações de alta resolução (ganho a 6 dB, sem binning). Lentes objetivas com aumentos de 4x a 20x foram utilizadas para aquisição de imagens neste estudo (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Capture as imagens de contraste de fase com as barras de escala correspondentes e salve-as no formato TIFF. - Cultivar as células por mais 48 h a 37 °C e 5% de CO2. Capturar imagens de contraste de fase em 24 h e 48 h em cultura usando o microscópio de fluorescência tudo-em-um.
- Fixar as células a 48 h com 1 ml de paraformaldeído (PFA) a 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Em seguida, lave a louça 3x por 5 min cada com 1 mL de PBS fresco.
- Coloque uma lamínula com meio de montagem (ver Tabela de Materiais) para observação morfológica adicional.
NOTA: Os pratos podem ser fotografados imediatamente ou armazenados por até 2 meses a 4 °C. - Opcional: Imunomarcar as células para proteínas de interesse.
NOTA: Um protocolo para detectar o complexo de adesão focal (FA) usando um anticorpo anti-vinculina monoclonal derivado de camundongo (consulte a Tabela de Materiais) é descrito aqui como um exemplo.- Incubar as placas (a partir do passo 3.6) com 0,5 ml de tampão de bloqueio (5% de soro normal de cabra em PBS) durante 60 minutos.
Observação : escolha um buffer de bloqueio apropriado para o anticorpo primário. Um tampão de bloqueio típico seria 5% de soro normal da mesma espécie que o anticorpo secundário usado. - Preparar o anticorpo primário diluído em tampão de diluição de anticorpos (1% de soro normal de cabra em PBS). Incubar as placas com 0,5 ml de anticorpo primário diluído durante a noite a 4 °C.
NOTA: Escolha o tampão de diluição de anticorpos apropriado. Normalmente, o anticorpo é usado em uma diluição de 1:50-1:200. - Enxaguar 3x por 5 min cada com 2 mL de PBS. Preparar o anticorpo secundário diluído derivado da cabra anti-rato no tampão de diluição de anticorpos (1% de soro normal de cabra em PBS). Incubar as placas com 0,5 mL de anticorpo secundário diluído por 1-3 h à temperatura ambiente.
NOTA: Normalmente, o anticorpo secundário é usado em uma diluição de 1:500-1:1.000. DAPI pode ser usado para coloração dos núcleos. - Enxaguar 3x com 2 mL de PBS por 5 min de cada vez. Coloque a lamínula com 50 μL de meio de montagem.
NOTA: As placas podem ser fotografadas usando o microscópio de fluorescência tudo-em-um com um filtro GFP (excitação: 470/40, emissão: 525/50) e um filtro TexasRed (excitação: 560/40, emissão: 630/75) em modo monocromático com configurações de alta resolução (ganho a 6 dB, sem binning). Lentes objetivas com aumentos de 4x a 20x foram utilizadas para a realização de exames neste estudo.
NOTA: O slide pode ser armazenado por até 2 meses a 4 °C.
- Incubar as placas (a partir do passo 3.6) com 0,5 ml de tampão de bloqueio (5% de soro normal de cabra em PBS) durante 60 minutos.
4. Análise dos dados
- Abra o software ImageJ 1.51s. Na janela ImageJ, selecione Arquivo > Abrir na barra de menus para abrir o arquivo de imagem salvo.
- Para definir a escala de medição, desenhe uma linha da mesma distância que a barra de escala. Vá para Analisar > Definir escala e digite a distância conhecida e as unidades da linha nas caixas apropriadas da janela Definir escala .
- Desenhe uma linha reta entre a lacuna da célula e pressione Analisar > Medir para transferir os valores para uma janela de dados. Meça pelo menos cinco posições diferentes em cada amostra e faça a média das distâncias para obter os dados representativos da amostra. Realizar as análises estatísticas utilizando software apropriado (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
Um ensaio de migração foi realizado em substratos mistos compostos por Col1 e AH de alto peso molecular (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) utilizando o protocolo aqui descrito. Células O9-1 no limite da falha migraram prontamente para a lacuna rica em AH (Figura 4). A imunomarcação para um marcador de AG, a vinculina14, confirmou que as células O9-1 formaram aderências focais (AGs) nos locais de degradação do AH (Figura 5).
Figura 1: Expressão de TMEM2 em NCCs. Cortes transversais do tubo neural de embriões Tmem2-FLAGKI em E9.0. (A) Cortes nos níveis cranial e do tronco do tubo neural foram duplamente marcados para a proteína TMEM2-FLAG e AH. A expressão de TMEM2 foi observada na placa neural e na região da borda do tubo neural (cabeças de setas preenchidas), sendo esses locais desprovidos de coloração de AH (cabeças de setas abertas). (B) Dupla marcação das células da crista neural para TMEM2-FLAG e Sox9. Cortes transversais do tubo neural E9.0 foram corados para TMEM2-FLAG e Sox9. NCCs pré-migratórias e emigratórias positivas para Sox9 na borda do tubo neural altamente expressas TMEM2. Abreviação: nt = tubo neural. Barras de escala: (A) 300 μm; (B) 100 μm. Adaptado com permissão de Inubushi et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Degradação do AH por TMEM2 em células O9-1. (A) Imagens representativas de células O9-1 depletadas e controle de Tmem2 cultivadas em uma placa de cultura regular (esquerda). (B) A expressão de Tmem2 nessas células foi avaliada por qPCR, com Gapdh como controle interno para normalização (gráfico de barras). As médias ± DP (n = 5) são apresentadas como barras horizontais. p < 0,001 pelo teste t de Student não pareado. Barra de escala, 5,0 μm. (C) Ensaio de hialuronidase à base de células. Células O9-1 depletadas de Tmem2 e controle foram cultivadas por 48 h em lamínulas de vidro revestidas com AH fluoresceinado (FA-HA). A atividade degradadora do AH revela-se como áreas escuras no fundo fluorescente. O nível de degradação do AH também foi comparado quantitativamente entre células O9-1 depletadas de Tmem2 e controle, conforme descrito em Materiais e Métodos (bargraph). Os dados representam a média ± DP da intensidade de fluorescência abaixo de uma célula em relação àquela na área livre (n > 50 células por condição agrupadas a partir de três experimentos independentes). p < 0,001 pelo teste t de Student não pareado. Adotado com permissão de Inubushi et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Degradação do AH ligado ao substrato em AGs em células O9-1. Ensaios de hialuronidase à base de células foram realizados por 16 h e as células foram coradas para vinculina. Em células O9-1 controle, a degradação do AH ocorre em AGs vinculina-positivas. Nas células O9-1 depletadas de Tmem2, a degradação do AH e a formação de AG estão muito diminuídas. O número de AGs por célula foi comparado quantitativamente entre células O9-1 depletadas de Tmem2 e controle (gráfico de barras). Os dados representam a média ± DP (n >30 células por condição agrupadas a partir de três experimentos independentes). p < 0,001 pelo teste t de Student não pareado. Adotado com permissão de Inubushi et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens representativas da migração de células O9-1 para uma lacuna livre de células em substratos mistos de Col1/HA. (A) O painel superior mostra as lacunas no início do experimento (Dia 0). Os painéis inferiores mostram imagens de lacunas após 24 h (Dia 1) ou 48 h (Dia 2) de incubação. Barra de escala = 150 μm. (B) Gráfico de barras mostrando a análise quantitativa da migração celular. Os dados representam a média ± DP da área da lacuna coberta por células migratórias em relação à área da lacuna original (n = 5 por condição). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 pelo teste t de Student não pareado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Degradação do AH nos substratos mistos Col1/HA em AGs em células O9-1. Células O9-1 cultivadas em substratos mistos constituídos por Col1/HA foram imunomarcadas com anticorpo anti-vinculina (vermelho). As manchas escuras/estrias representam atividade de degradação do AH no substrato FAHA-H2 (verde). Os sítios de degradação do AH e aderências focais (vinculina) foram co-localizados nos substratos mistos (pontas de setas). Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Vários componentes do ECM regulam a emigração/migração do NCC. Por exemplo, o AH regula positivamente a migração deNCC2,15. Curiosamente, um estudo baseado em modelos genéticos murinos de Tmem2, uma hialuronidase de superfície celular, elucidou a exigência de degradação do AH na migração deNCC9. Os colágenos também são abundantes na MEC ao redor do tubo neural16. Demonstrou-se que a decorina, um pequeno proteoglicano rico em leucina, regula a migração de NCC durante o desenvolvimento neural17. Outros componentes da MEC, incluindo laminina e fibronectina, influenciam a adesão e migração da NCC18. No entanto, as funções específicas dos componentes do ECM na migração do NCC ainda são desconhecidas.
O modelo in vitro aqui descrito tem como objetivo examinar o comportamento de migração de NCCs encontrando ECM rica em AH. Optamos por substratos 2D em vez de 3D devido às dificuldades na preparação de géis compostos de colágeno-HA com propriedades de gelificação uniformes. Em um sistema de cultivo 2D, os gradientes espaciais das concentrações dos fatores solúveis e as rigidezes dos substratos da matriz extracelular são diferentes daqueles dos tecidosvivos19. Desse ponto de vista, um sistema de cultivo 3D apresenta grandes vantagens e pode fornecer informações mais profundas sobre os mecanismos de migração celular20,21. Neste contexto, a configuração de um sistema de ensaio 3D é preferível, se aplicável. Este modelo experimental in vitro pode ser aplicável para examinar o comportamento da migração de NCC em resposta a diferentes componentes da MEC. Isso permitiria uma melhor compreensão das bases mecanicistas da migração NCC, que rege a morfogênese embrionária.
As células O9-1 utilizadas neste estudo expressam de forma estável marcadores de células-tronco (CD44, Sca-1 e Bmi1) e marcadores da crista neural (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 e Itgb1). Sob condições de cultura não diferenciadoras, as células O9-1 mantêm características semelhantes às células-tronco multipotentes. As células O9-1 têm o potencial de se diferenciar em múltiplos tipos celulares, incluindo osteoblastos, condrócitos, células musculares lisas e células gliais sob condições específicas decultura12. Portanto, as células O9-1 são uma ferramenta útil para investigar as propriedades moleculares da migração e diferenciação craniana de NCC. No entanto, o uso de NCCs primárias (por exemplo, de tubos neurais embrionários de galinhas ou camundongos) em vez de células O9-1 fornecerá dados mais detalhados para facilitar uma melhor compreensão da natureza da migração de NCC.
No ensaio de migração baseado no fechamento da ferida, o NCC também proliferará e o aumento do número de células também contribuirá para a expansão da população celular para a área de lacuna22. Para minimizar a proliferação durante o ensaio de cicatrização de feridas, a inanição sérica é o método mais comum em vez do uso de agentes farmacológicos23. No entanto, os efeitos da inanição de soro devem ser testados em cada tipo celular.
A etapa mais crítica deste protocolo é adicionar o revestimento covalente de AH aos pratos com fundo de vidro. O tratamento da superfície vítrea com reagentes silanos é utilizado para a análise de aderências focais a substratos de MEC24. Trietoxisilano é um composto organossilício contendo muitos grupos amino livres que podem se ligar a grupos hidroxila livres em superfícies de vidro de sílica25. Uma técnica foi desenvolvida e otimizada neste estudo para produzir uma fina camada de silano estável sobre uma superfície de vidro de sílica usando trietoxissilano. A amina na superfície de vidro revestida com trietoxissilano pode ligar os grupos carboxila no AH, consequentemente imobilizando quimicamente o AH na superfície do vidro8. No entanto, com esse método, não é possível ligar outros substratos de MEC à superfície do vidro à base de proteínas. Portanto, o glutaraldeído foi usado aqui para imobilizar quimicamente o colágeno tipo I através do acoplamento da amina ao aldeído. Notavelmente, o revestimento inadequado do AH pode levar à remoção do revestimento do AH mesmo sem digestão enzimática (por exemplo, pela ação da força mecânica durante a adesão e migração celular). O revestimento com substratos de MEC em substituição ao colágeno tipo I é possível, desde que os substratos possuam grupos amina. No entanto, podem existir limitações no revestimento covalente da MEC em placas com fundo de vidro devido às propriedades químicas do substrato; assim, tentativa e erro podem ser necessários.
Embora não seja um modelo perfeito para mimetizar a migração de NCC para a MEC rica em AH ao redor do tubo neural, este experimento de migração in vitro pode ser útil para a análise funcional das moléculas envolvidas na migração in vivo de NCC. Além disso, este ensaio in vitro pode ser útil para a triagem terapêutica de drogas para acelerar ou prevenir a degradação do AH, bem como a migração de outros tipos celulares, incluindo fibroblastos da pele e queratinócitos.
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Disclosures
O autor declara que não existem interesses concorrentes.
Acknowledgments
Expresso grande reconhecimento a Fumitoshi Irie e Yu Yamaguchi por seu encorajamento e sugestões gentis no estabelecimento deste método. Este trabalho foi apoiado por bolsas de auxílio para programas de pesquisa científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (#19KK0232 para T.I., #20H03896 para T.I.). O método original para o revestimento de AH em substratos de vidro e ensaios de degradação in situ de AH nos substratos foi descrito em Yamamoto et al (2017)8, enquanto o método para a preparação de substratos mistos HA/Col1 foi descrito em Irie et al (2021)7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
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