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Cancer Research

चूहों में तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया उत्पन्न करने के लिए इंट्रा-पेरिटोनियल प्रत्यारोपण

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64834
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

Summary

यहां, ल्यूकेमिया कोशिकाओं के इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग चूहों में तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) को स्थापित करने और फैलाने के लिए किया जाता है। यह नई विधि एएमएल कोशिकाओं के सीरियल प्रत्यारोपण में प्रभावी है और उन लोगों के लिए एक विकल्प के रूप में काम कर सकती है जो चूहों में अंतःशिरा इंजेक्शन के साथ कठिनाइयों और विसंगतियों का अनुभव कर सकते हैं।

Abstract

तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) और संबंधित रिलैप्स के इलाज के लिए नवीन उपचारों की आवश्यकता है जिसमें लगातार ल्यूकेमिया स्टेम सेल (एलएससी) शामिल हैं। प्राप्तकर्ता चूहों में रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के माध्यम से इन कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपण करने के आधार पर उपचारों का परीक्षण करने के लिए एक प्रयोगात्मक एएमएल कृंतक मॉडल चुनौतियों से भरा है। इस अध्ययन का उद्देश्य इंट्रा-पेरिटोनियल मार्ग का उपयोग करके एएमएल के एक मजबूत मुराइन मॉडल को उत्पन्न करने के लिए एक आसान, विश्वसनीय और सुसंगत विधि विकसित करना था। वर्तमान प्रोटोकॉल में, अस्थि मज्जा कोशिकाओं को मानव एमएलएल-एएफ 9 संलयन ऑन्कोप्रोटीन को व्यक्त करने वाले रेट्रोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। प्राथमिक एएमएल के विकास में दाता एलएससी के रूप में वंश नकारात्मक (लिन-) और लिन-एससीए -1 + सी-किट + (एलएसके) आबादी की दक्षता का परीक्षण किया गया था, और एएमएल उत्पन्न करने के लिए इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन को एक नई विधि के रूप में अपनाया गया था। इंट्रा-पेरिटोनियल और रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के बीच तुलना सीरियल प्रत्यारोपण में दो तरीकों की तुलना और विपरीत करने के लिए की गई थी। लिन- और एलएसके दोनों कोशिकाओं को मानव एमएलएल-एएफ 9 वायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया, जो प्राप्तकर्ताओं के अस्थि मज्जा और प्लीहा में अच्छी तरह से संलग्न थे, जिससे एक पूर्ण विकसित एएमएल हुआ। दाता कोशिकाओं के इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन ने सीरियल प्रत्यारोपण पर प्राप्तकर्ताओं में एएमएल की स्थापना की, और एएमएल कोशिकाओं की घुसपैठ को फ्लो साइटोमेट्री, क्यूपीसीआर और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा प्राप्तकर्ताओं के रक्त, अस्थि मज्जा, प्लीहा और यकृत में पाया गया। इस प्रकार, इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन दाता ल्यूकेमिक कोशिकाओं के सीरियल प्रत्यारोपण का उपयोग करके एएमएल प्रेरण का एक कुशल तरीका है।

Introduction

तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)खराब रोग निदान के साथ विविध एटियलजि की हेमेटोलॉजिक दुर्भावना का एक प्रकार है। एएमएल पशु मॉडल की पीढ़ी नए उपचारों की खोज के प्रयास में इसकी जटिल विविधताओं और पैथोबायोलॉजी की समझ की नींवरखती है। चूहों में ल्यूकेमोजेनेसिस में संलयन ऑन्कोप्रोटीन व्यक्त करने वाली दाता कोशिकाओं का प्रत्यारोपण शामिल है, जिसमें मिश्रित वंश ल्यूकेमिया (एमएलएल) जीन को एएमएल को शक्तिशाली रूप से प्रेरित करने के लिए संलयन शामिल है, ताकि मनुष्यों में बीमारी की नकल कीजा सके। एमएलएल जीन से जुड़े एएमएल4 के प्रत्यारोपण में दाता कोशिकाओं की विभिन्न सेलुलर उत्पत्ति की सूचना दी गई है, जिसमें रोग की उत्पत्ति के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं के बारे में बहुत कम जानकारी है।

चूहों में प्रत्यारोपण के लिए कई मार्ग विकसित किए गए हैं; एक इंट्रा-फेमोरल इंजेक्शन के बजाय, जो सीधे अस्थि मज्जा5 में उत्परिवर्ती दाता कोशिकाओं का परिचय देता है, एक अंतःशिरा इंजेक्शन जो शिरापरक साइनस प्लेक्सस, पूंछ की नस और जुगुलर नस का उपयोग करता है, व्यापक रूप से मुराइन एएमएल मॉडल 6,7,8,9 उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया है। रेट्रो-ऑर्बिटल (आर.ओ.) इंजेक्शन के मामले में, विभिन्न अंतर्निहित नुकसान, जैसे कि मात्रा सीमा, उच्च तकनीकी मांग, बार-बार प्रयासों या त्रुटि के लिए कुछ संभावनाएं, और संभावित ओकुलर चोटें, सीमित या बिना किसी व्यवहार्य विकल्पके साथ प्रमुख बाधाएं रही हैं। टेल वेन इंजेक्शन में स्थानीय चोटों के अलावा समान समस्याएं हो सकती हैं; प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, चूहों को अक्सर अपनी पूंछनसों को पतला करने के लिए गर्म करने की आवश्यकता होती है। अतिरिक्त प्रकाश स्रोत के बिना पूंछ की नस का पता लगाना भी मुश्किल है, खासकर चूहों के सी 57बीएल / 6 तनाव में। जुगुलर नस इंजेक्शन के लिए, अनुसंधान कर्मियों को नस का पता लगाने और संभावित जटिलताओं को सीमित करने के लिए पर्याप्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, शिरापरक साइनस और जुगुलर नस इंजेक्शन दोनों को संज्ञाहरण के तहत करने की आवश्यकता होती है, जो जटिलता का एक और स्तर जोड़ता है। इस प्रकार, एएमएल मुराइन मॉडल की स्थापना की सुविधा के लिए प्रत्यारोपण के लिए नए मार्गों का पता लगाना आकर्षक है।

इंट्रा-पेरिटोनियल (आई.पी.) इंजेक्शन का उपयोग आमतौर पर दवाओं, रंगों और एनेस्थेटिक्स11,12,13,14,15 को प्रशासित करने के लिए किया जाता है; इसका उपयोग एक्टोपिक हेमटोपोइजिस 16 के लिए हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को पेश करने और विभिन्न माउस मॉडल 17,18,19,20,21 में अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने के लिए भी किया गया है। हालांकि, इसका उपयोग अक्सर चूहों में हेमटोपोइएटिक विकृतियों को स्थापित करने के लिए किया जाता है, विशेष रूप से एएमएल रोग की प्रगति का अध्ययन करने के लिए।

वर्तमान अध्ययन दाता कोशिकाओं के रूप में वंश नकारात्मक (लिन-) और लिन-एससीए -1 + सी-किट + (एलएसके) आबादी की प्रत्यारोपण दक्षता की तुलना करने के अलावा, एएमएल माउस मॉडल की पीढ़ी में आईपी इंजेक्शन की व्यवहार्यता का वर्णन करता है। ये निष्कर्ष एएमएल और संबंधित माइलॉयड ल्यूकेमिया के प्रयोगात्मक मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक सरल और कुशल तरीका प्रदान करते हैं। इस तरह की विधि में रोग तंत्र की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के साथ-साथ प्रयोगात्मक उपचारों का परीक्षण करने के लिए अपेक्षाकृत आसान मॉडल प्रदान करने की क्षमता है।

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Protocol

पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी प्रयोगों को पूर्व अनुमोदित किया गया था।

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. एम्पीसिलीन पूरक (एपी) एलबी एगर प्लेटें (बाँझ 10 सेमी प्लेटें) तैयार करें। ऐसा करने के लिए, 400 एमएल आसुत जल में एगर के साथ 10 ग्राम एलबी शोरबा को घोलें, हिलाएं, और मात्रा को 500 एमएल तक लाएं। आटोक्लेविंग द्वारा घोल को निष्फल करें, फिर घोल को ठंडा होने दें, घोल में 0.5 एमएल एम्पीसिलीन (स्टॉक: 150 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें, और इसे मिश्रण करने के लिए हिलाएं। तुरंत अल्कोहल लैंप के पास बाँझ 10 सेमी प्लेट में 18 एमएल घोल जोड़ें, कमरे के तापमान पर जमने दें, और आगे के उपयोग तक प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा स्टोर करें।
  2. आसुत जल के 500 एमएल में एगर के बिना 10 ग्राम एलबी को भंग करके एलबी मीडिया तैयार करें। आटोक्लेविंग द्वारा घोल को निष्फल करें, घोल को ठंडा होने दें, घोल में 0.5 एमएल एम्पीसिलीन (स्टॉक: 150 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें, और इसे मिश्रण करने के लिए हिलाएं।
  3. स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 एमएल और हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण बोवाइन सीरम (एचआईएफबीएस) के 10 एमएल को 1 एक्स डलबेको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के 485 एमएल में जोड़कर प्रवाह बफर तैयार करें।
    नोट: गर्म करके एफबीएस को निष्क्रिय करने के लिए, पिघली हुई एफबीएस बोतलों को 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। सुनिश्चित करें कि बोतलें पानी के स्नान में डूबी हुई न हों या अन्यथा न हों। पूर्ण गिरावट के लिए तापमान महत्वपूर्ण है; यह सुनिश्चित करने के लिए, बोतलों को पानी के स्नान में डालने के बाद तापमान 56 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें। धीरे से बोतलों को हर 10 मिनट में तीन बार घुमाएं। सीरम को 30 मिनट से अधिक समय तक इनक्यूबेट करने की अनुमति न दें।
  4. डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 440 एमएल में 50 एमएल एचआईएफबीएस, 5 एमएल एल-ग्लूटामाइन और 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़कर रखरखाव मीडिया तैयार करें। डीएमईएम मीडिया के 445 एमएल में 50 एमएल एचआईएफबीएस और 5 एमएल एल-ग्लूटामाइन जोड़कर अभिकर्मक मीडिया तैयार करें।
  5. 500 एमएल आसुत जल में 4.145 ग्राम एनएच 4 सीएल,एनएएचसीओ3 के 0.504 ग्राम और एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 16.81 मिलीग्राम को जोड़कर लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लाइसिस बफर तैयार करें। 75 एमएल एचआईएफबीएस, 5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), 10 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन के 0.5 एमएल, 4 मिलीग्राम / एमएल होलो-ट्रांसफरिन के 2.5 एमएल, 3.5 मिलीलीटर β-मर्काप्टोएथेनॉल, 5 एमएल एल-ग्लूटामाइन, और 0.5 एमएल सिप्रोफ्लोक्सासिन को 416.5 एमएल आईएमडीएम मीडिया में जोड़कर अपूर्ण इसकोव के संशोधित डुलबेको के माध्यम (आईएमडीएम) मीडिया को तैयार करें।
  6. 2x IMDM मीडिया का 10 mL तैयार करें, जिसमें साइटोकिन्स की सांद्रता 1x IMDM मीडिया में दोगुनी मात्रा में होती है, जिसमें 50 ng/μL mr-SCF के 10 μL, 25 ng/μL mr-Flt3L का 20 μL mr-Flt3L, 10 ng/μL mr-IL-6, 10 ng/μL mr-IL-3, 10 ng/μL mr-IL-3, 10 ng/μL का 10 μL mr-IL-3, 10 mg/mL इंसुलिन का 10 μL, 10 ng/μL mr-IL-3, 10 mg/mL इंसुलिन का 10 μL, 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL का 10 μL mr-SCF, 10 ng/μL mr-L का 20 μL mr-IL-3, 10 mg/mL इंसुलिन का 10 μL, 10 ng/μL mr-IL-3, 10 mg/mL इंसुलिन का 20 μL, 10 ng/μL mr-IL-3, 10 mg/mL इंसुलिन का 10 μL, 10 ng/μL mr-SCF का 10 μL mr-SCF, 20 μL mr-Flt3L, 10 ng/μL mr-IL-6, 10 mg/mL इंसुलिन का 10 μL mr-IL-6, 10 mg और 4 मिलीग्राम / एमएल होलो-ट्रांसफरिन के 50 μL को 9.87 एमएल अपूर्ण आईएमडीएम मीडिया में बदल दिया।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्रवाह बफर, आरबीसी लाइसिस बफर, रखरखाव मीडिया, अभिकर्मक मीडिया और अपूर्ण आईएमडीएम मीडिया उपयोग से पहले फ़िल्टर निष्फल हैं।

2. प्लास्मिड परिवर्तन

  1. बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं का चयन करें- α के 20 μL पिघलें। पिघली हुई सक्षम कोशिकाओं में एमएससीवी-एमएलएल-एएफ 9-ईएफ 1-ल्यूक 2-पी 2 ए-ईजीएफपी-एलसी 3 प्लास्मिड 22 के 1 μL (~2 ng) जोड़ें और ट्यूब को टैप करके धीरे से मिलाएं। 30 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
  2. 42 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में 40 सेकंड के लिए मिश्रण को इनक्यूबेशन से हिलाएं। ट्यूब को तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर स्थानांतरित करें।
  3. ट्यूब में 1 एमएल एलबी मीडिया (एम्पीसिलीन के बिना) जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर हिलाएं।
  4. कमरे के तापमान पर ट्यूब को 4 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और 0.9 एमएल सुपरनैटेंट को छोड़ दें। एलबी मीडिया के शेष 0.1 एमएल में अवक्षेप को पुन: निलंबित करें।
  5. पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) एपी एलबी एगर प्लेटों पर रूपांतरित सक्षम कोशिकाओं को फैलाएं। 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को उल्टा इनक्यूबेट करें।
  6. एक एकल कॉलोनी चुनें और 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर रात भर एपी एलबी मीडिया के 10 एमएल में रूपांतरित कोशिकाओं को खर्च करें।
  7. एक फ्लास्क में 500 एमएल एपी एलबी मीडिया में 5 एमएल खर्च की गई सक्षम कोशिकाओं को जोड़ें और फ्लास्क को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लास्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग करके प्लास्मिड निकालें और 0.5 एमएल ऑटोक्लेव अल्ट्राप्योर पानी में पुन: निलंबित करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्लास्मिड की मात्रा निर्धारित करें।

3. फीनिक्स इकोट्रोपिक (पीईसीओ) कोशिकाओं का अभिकर्मक

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 10 सेमी प्लेटों में रखरखाव मीडिया में2 x 106 पेको कोशिकाएं / प्लेट। सुनिश्चित करें कि पीईसीओ कोशिकाओं को घातीय विकास चरण में बनाए रखा जाता है और पारित होने से पहले सक्रिय रूप से विभाजित किया जाता है।
  2. जब कोशिकाएं 80% संकुचित हो जाती हैं, तो प्लेटों को 5 एमएल डीपीबीएस के साथ दो बार धोएं, प्लेट में 1 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें, और 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब में 5 एमएल रखरखाव मीडिया के साथ कोशिकाओं को काटें और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 400 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। रखरखाव मीडिया के 5 एमएल में सेल पेलेट को पुन: निलंबित करें।
  3. कोशिकाओं की गणना करने के लिए 10 μL सेल सस्पेंशन और 10 μL ट्रिपैन ब्लू मिलाएं और हेमोसाइटोमीटर पर 10 μL लोड करें।
    कुल कोशिकाएँ/mL = (कुल कोशिकाओं की गणना x तनुकरण कारक x 104 कोशिकाएँ/mL)/गिने गए वर्गों की संख्या)
    बीज 2 x 106 कोशिकाओं /डिश को 6 सेमी व्यंजनों में 5 एमएल रखरखाव मीडिया का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए उपयोग किया जाता है।
  4. रखरखाव मीडिया को 5 एमएल अभिकर्मक मीडिया के साथ बदलें जब कोशिकाएं 18 घंटे की संस्कृति के बाद 50% -60% कंफ्लुएंट हो जाती हैं।
  5. अभिकर्मक अभिकर्मक को अभिकर्मक से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
  6. एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में सादे डीएमईएम मीडिया के 5.5 μg MSCV-MLL-AF9-EF1λ-luc2-P2A-EGFP-LC3 प्लास्मिड22 से 0.5 mL जोड़ें। ट्यूब टैप करके इसे धीरे से मिलाएं और इसे 10 मिनट तक बैठने दें।
  7. ट्यूब में अभिकर्मक अभिकर्मक के 14.6 μL (प्लास्मिड राशि का 3x; v / w) जोड़ें और धीरे से ट्यूब को हर 10 मिनट में तीन बार टैप करें।
  8. समान रूप से मिश्रण को अभिकर्मक मीडिया में पीईसीओ कोशिकाओं के साथ व्यंजन के सभी क्षेत्रों में ड्रॉपवाइज जोड़ें। धीरे से व्यंजन को 10 बार आगे और पीछे ले जाएं और 10 बार साइड में ले जाएं। व्यंजनों को 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  9. 22 में वर्णित हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा अभिकर्मक दक्षता को मापें। कोशिकाओं को पहले एफएससी-ए/एफएससी-एच और एफएससी-ए और एसएससी-ए पर गेट किया जाता है ताकि सिंगल्स प्राप्त किया जा सके। जीएफपी + आबादी को गैर-संक्रमित कोशिकाओं से तुलना करके एफएल 1 प्लॉट पर गेट किया जाता है।
  10. एक बाँझ 50 एमएल ट्यूब में 0.45 μm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से सुपरनैटेंट एकत्र करें और फ़िल्टर करें। ट्रांसडक्शन के लिए तुरंत सुपरनैटेंट का उपयोग करें या उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और उन्हें आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: पीईसीओ कोशिकाओं को ठीक से मिश्रित किया जाना चाहिए और समान रूप से व्यंजनों में बीज दिया जाना चाहिए। बीज बोते समय व्यंजन को 10 बार आगे और पीछे ले जाकर कोशिकाओं को फैलने दें और 10 बार साइडवे करें। बीजित की जाने वाली सेल संख्या गिनती में भिन्नता के आधार पर भिन्न हो सकती है। इष्टतम सीडिंग सेल संख्या खोजने के लिए जो 18 घंटे की संस्कृति के बाद 50% -60% संगम प्राप्त कर सकता है, सीरियल कमजोर पड़ने वाली कोशिकाओं को सीडिंग करना सहायक होता है।

4. लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन

  1. 8-10 सप्ताह की सीडी 45.1 महिला सी 57बीएल 6 / जे चूहों (प्रति प्राप्तकर्ता माउस दो से तीन दाता चूहे) को सीओ2 कक्ष में इच्छामृत्यु करें।
  2. 70% इथेनॉल के साथ चूहों के पूरे शरीर को निष्फल करें। चूहों को स्टायरोफोम बोर्ड पर एक बाँझ सर्जिकल पैड पर रखें और माउस पंजे पैड के माध्यम से पैरों को पिन करें।
  3. मध्य रेखा पर पेट की गुहा के ऊपर की त्वचा को काटें और तेज अंत बाँझ कैंची के साथ पिछले पैरों की ओर चमड़े के नीचे की जगह को चौड़ा करें।
  4. चीरा को पेट की मध्य रेखा से नीचे एड़ियों तक बढ़ाएं। तेज अंत बाँझ कैंची के ब्लेड के साथ पिछले पैरों के नीचे चमड़े के नीचे की जगह को चौड़ा करें।
  5. तेज-अंत बाँझ कैंची के साथ अकिलिस के कण्डरा को काटें। दांतों के साथ बल का उपयोग करके कण्डरा को पकड़ें और गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों को हटाने के लिए फीमर से जुड़े दूसरे छोर को काट लें।
  6. तेज अंत बाँझ कैंची के साथ घुटने से जुड़े क्वाड्रिसेप्स कण्डरा को काटें। दांतों के साथ बल का उपयोग करके कण्डरा को पकड़ें और गैस्ट्रोकैनेमस मांसपेशियों को हटाने के लिए फीमर से जुड़े मांसपेशियों के सिर को काट लें।
  7. टिबिया से जुड़ी अंत में फीमर के आसपास की अन्य मांसपेशियों को तेज-अंत बाँझ कैंची से काटें।
  8. तेज अंत बाँझ कैंची के साथ टखने को काटें, यह सुनिश्चित करें कि टिबिया बरकरार रहे। दांतों के साथ बल का उपयोग करके फीमर के बाहर के छोर को पकड़ें और कूल्हे के जोड़ को तेज-अंत बाँझ कैंची से काटें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ऊरु सिर बरकरार रहे।
  9. टिबियास और फीमर को बाँझ 15 एमएल ट्यूब में प्रवाह बफर में स्थानांतरित करें।
  10. हाथ से घुटने को तोड़कर टिबिया और फीमर को अलग कर लें। हाथ से टिबियल पठार और डिस्टल फीमर को उजागर करने के लिए पेटेला, उपास्थि और ऊरु कोंडिल्स को हटा दें। बाँझ धुंध का उपयोग करके मांसपेशियों को हटा दें और फिर हड्डियों को प्रवाह बफर में भिगोदें।
  11. ऊरु गर्दन को काटें और 23 ग्राम सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके फीमर के दोनों सिरों से प्रवाह बफर के साथ अस्थि मज्जा कोशिकाओं को फ्लश करें।
  12. टिबियल मॉलोलस को काटें और 23 जी सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके टिबिया के दोनों सिरों से प्रवाह बफर के साथ अस्थि मज्जा कोशिकाओं को फ्लश करें।
  13. 18 ग्राम सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके कोशिकाओं को ऊपर और नीचे करके फैलाएं। 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 400 x g पर एकल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  14. सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और आरबीसी लाइसिस बफर के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ताकि आरबीसी को 3 मिनट के लिए लाइस किया जा सके।
  15. लाइसिस को रोकने के लिए 5 एमएल फ्लो बफर जोड़ें और सेल निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस और 3 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  16. एक बाँझ 50 एमएल ट्यूब पर एक 70 μm सेल छन्नी रखें। 5 एमएल प्रवाह बफर के साथ गोली को निलंबित करें, मिलाएं, और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सेल स्ट्रेनर के माध्यम से पारित करें।
  17. गोल तल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में प्रवाह बफर के साथ सेल एकाग्रता को 1 x 108 / एमएल तक समायोजित करें।
  18. निर्माता के निर्देश के अनुसार माउस हेमटोपोइएटिक सेल अलगाव किट का उपयोग करके लिन-कोशिकाओं का चयन करें।
  19. एक दाग रहित नियंत्रण के लिए 100 μL बफर में 1 x 104 कोशिकाओं की तीन ट्यूबों को अलग रखें और एपीसी-संयुग्मित एंटी-माउस CD117 (c-Kit) और PE-Cy7-संयुग्मित एंटी-माउस Ly-6A/E (Sca-1) के लिए दो एकल एंटीबॉडी-दाग वाले नियंत्रण। एकल एंटीबॉडी-दाग वाले नियंत्रणों में से प्रत्येक के लिए एंटीबॉडी के 1 μL (0.2 mg / mL स्टॉक से) का उपयोग करें।
  20. 400 μL में दोनों एंटीबॉडी (0.2 mg/mL स्टॉक से प्रत्येक का 4 μL) के साथ एक ट्यूब में शेष कोशिकाओं को दाग दें। 0.5-1 घंटे के लिए अंधेरे में बर्फ पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  21. धुंधला होने के बाद, 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 400 x g पर 1 एमएल फ्लो बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़कर कोशिकाओं को धो लें।
  22. बिना दाग वाले नियंत्रण के लिए कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया गया और 100 μL प्रवाह बफर में एकल एंटीबॉडी-दाग वाले नियंत्रण। छंटाई के लिए 1 एमएल प्रवाह बफर में डबल एंटीबॉडी-दाग वाली कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  23. हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) को सेल सॉर्टर का उपयोग करके एलएसके आबादी के रूप में सॉर्ट करें जैसा कि23,24 में वर्णित है।
  24. धुंधला करते समय, रेट्रोनेक्टिन के साथ एक बाँझ 6 सेमी डिश को निम्नानुसार कोट करें: पीबीएस में रेट्रोनेक्टिन का 100 μg / mL स्टॉक तैयार करें और 6 सेमी डिश में 0.9 एमएल पीबीएस और 0.1 एमएल रेट्रोनेक्टिन जोड़ें। डिश को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बाँझ हुड में कोट करें। फिर, रेट्रोनेक्टिन को हटा दें और 30 मिनट के लिए फ़िल्टर किए गए 2% बीएसए (पीबीएस में) के 0.5 एमएल के साथ डिश को ब्लॉक करें। पकवान को 5 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धोएं और पकवान पारगमन के लिए तैयार है।
  25. 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 400 x g पर क्रमबद्ध एचएससी या मिश्रित लिन-कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और एक रेट्रोनेक्टिन-लेपित डिश में 3 एमएल 2x (साइटोकिन्स) आईएमडीएम मीडिया और 3 एमएल वायरल सुपरनैटेंट (चरण 3.10 से उत्पन्न) में पुन: निलंबित करें। डिश को 6 या24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, लिन-कोशिकाओं को प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर या तो क्रमबद्ध या मिश्रित किया गया था।

5. सीरियल प्रत्यारोपण (चित्रा 1)

नोट: प्राथमिक प्राप्तकर्ता चूहे 8-10 सप्ताह के नर C57BL6 / J चूहे (CD45.2) थे। उन्हें प्रत्यारोपण से 3 दिन पहले से प्रत्यारोपण के 7 दिन बाद तक अवसरवादी पाचन संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं युक्त पानी और लिबिटम प्रदान किया गया था। प्राथमिक प्राप्तकर्ता चूहों को प्रत्यारोपण से25 घंटे पहले उप-घातक रूप से विकिरणित (4.75 GY) किया गया था। इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों पर आइसोफ्लुरेन लागू नहीं किया गया था।

  1. 6 या 24 घंटे के लिए पारगमन के बाद, कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को काटें और 3 मिनट के लिए 400 x g । यदि आवश्यक हो तो डिश तल से जुड़ी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ट्रिप्सिन का उपयोग करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और कोशिकाओं को पूर्वनिर्मित पीबीएस में पुन: निलंबित करें। प्राप्तकर्ताओं की संख्या के आधार पर पीबीएस की मात्रा निर्धारित करें (यानी, रेट्रो-ऑर्बिटल और इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन वाले प्राप्तकर्ताओं के लिए क्रमशः 0.1 एमएल / माउस और 0.5 एमएल / माउस)।
  2. उप-घातक रूप से विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों को एक आइसोफ्लुरेन कक्ष में रखें (ऑक्सीजन की प्रवाह दर 1.0 एल / मिनट के रूप में सेट की जाती है और आइसोफ्लुरेन का वेपोराइज़र 5% के रूप में सेट होता है)। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर गीला मरहम लागू करें। चूहे आगे की प्रक्रियाओं के लिए तैयार होते हैं जब दिल की धड़कन प्रति मिनट 60 बीट तक गिर जाती है।
  3. प्राथमिक प्राप्तकर्ता चूहों में कोशिकाओं को रेट्रो-ऑर्बिटल (0.1 एमएल / माउस) 7 या इंट्रा-पेरिटोनियल (0.5 एमएल / माउस) 26 में 27 जी 1/2 सुई के साथ इंजेक्ट करें। चूहों को लगातार देखें जब तक कि वे उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर लें। प्रत्यारोपण के बाद उनकी भलाई के लिए रोजाना चूहों की निगरानी करें।
  4. 1 महीने के बाद, नीचे वर्णित हेमवेट पर पूर्ण रक्त गणना (सीबीसी) का मूल्यांकन करके ल्यूकोसाइटोसिस की निगरानी के लिए रेट्रो-ऑर्बिटल रक्तस्राव द्वारा साप्ताहिक रक्त एकत्र करें।
    1. आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण के बाद माउस को पार्श्व रूप से रखें (ऑक्सीजन की प्रवाह दर 1.0 एल / मिनट के रूप में सेट की जाती है और आइसोफ्लुरेंस का वेपोराइज़र 5% के रूप में सेट किया जाता है)। चूहे आगे की प्रक्रियाओं के लिए तैयार होते हैं जब दिल की धड़कन प्रति मिनट 60 बीट तक गिर जाती है।
    2. अंगूठे और तर्जनी उंगली से आंख को प्रोपटोज करें। आंतरिक कैंथस के माध्यम से एस्टेराइल हेमक्रिट केशिका ट्यूब के साथ शिरापरक साइनस प्लेक्सस में प्रवेश करें।
    3. एक ईडीटीए रक्त संग्रह ट्यूब में 20-25 μL रक्त एकत्र करें और रक्तस्राव को रोकने के लिए पलकों को बंद करें। आंखों पर जेंटामाइसिन सल्फेट ऑप्थेल्मिक समाधान की एक बूंद लागू करें।
  5. समापन बिंदु पर, जब सफेद रक्त कोशिकाएं (डब्ल्यूबीसी) 4 x 104 कोशिकाओं / μL तक पहुंच जाती हैं, तो माउस कोCO2 कक्ष में इच्छामृत्यु करें और फीमर और टिबिया को प्रवाह बफर के साथ फ्लश करके अस्थि मज्जा कोशिकाओं को अलग करें, इसके बाद चरण 4 में उल्लिखित आरबीसी लाइसिस।
  6. समापन बिंदु पर, स्प्लेनोसाइट्स की कटाई करें जैसा कि नीचे उल्लेख किया गया है।
    1. एक सीओ2 कक्ष में माउस को इच्छामृत्यु करें। चूहों को स्टायरोफोम बोर्ड पर एक बाँझ सर्जिकल पैड पर रखें और माउस पंजे पैड के माध्यम से पैरों को पिन करें। 70% इथेनॉल के साथ चूहों के पूरे शरीर को निष्फल करें।
    2. तेज अंत बाँझ कैंची के साथ पेट की गुहा को उजागर करने के लिए मध्य रेखा पर त्वचा और मांसपेशियों को काटें। तिल्ली को तेज-अंत बाँझ कैंची के साथ अलग करें और इसे बाँझ 15 एमएल ट्यूब में प्रवाह बफर में रखें।
    3. 3 एमएल प्रवाह बफर के साथ 6 सेमी डिश में 70 μm बाँझ छन्नी के माध्यम से तिल्ली को जाल में डालें। डिश से कोशिकाओं को एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 400 एक्स जी पर एकल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और आरबीसी लाइसिस बफर के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ताकि आरबीसी को 3 मिनट के लिए लाइस किया जा सके। लाइसिस को रोकने के लिए 5 एमएल फ्लो बफर जोड़ें और सेल निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस और 3 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. एक बाँझ 50 एमएल ट्यूब पर एक 70 μm सेल छन्नी रखें। 5 एमएल प्रवाह बफर के साथ गोली को निलंबित करें, मिलाएं, और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सेल स्ट्रेनर के माध्यम से पारित करें।
  7. एफआईटीसी-संयुग्मित एंटी-माउस सीडी 45.1 एंटीबॉडी के साथ स्प्लेनोसाइट्स और अस्थि मज्जा कोशिकाओं को धुंधला करके और प्रवाह साइटोमीटर पर पता लगाकर प्राथमिक (1 °) एएमएल कोशिकाओं की पहचान करें। कोशिकाओं को पहले एफएससी-ए/एफएससी-एच और एफएससी-ए और एसएससी-ए पर गेट किया जाता है ताकि सिंगल्स प्राप्त किया जा सके। सीडी 45.1+ आबादी को बिना दाग वाली कोशिकाओं से तुलना करके एफएल 1 प्लॉट पर गेट किया जाता है।
  8. द्वितीयक (2°) प्रत्यारोपण के लिए, पीबीएस (0.1 एमएल /माउस) में 1 डिग्री आर.ओ. प्राप्तकर्ताओं से सीडी 45.1 एएमएल स्प्लेनिक कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और उन्हें सीडी 45.2 पुरुष सी 57बीएल 6 / जे चूहों में रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से इंजेक्ट करें। समानांतर रूप से, पीबीएस (0.5 एमएल / माउस) में 1 डिग्री यानी प्राप्तकर्ताओं से एएमएल स्प्लेनिक कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और उन्हें इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से 8-12 सप्ताह पुराने लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन (आरएफपी) में इंजेक्ट करें - एआई 14टीडीटोमेटो नर चूहों को व्यक्त करतेहैं।
  9. तृतीयक (3°) प्रत्यारोपण के लिए, एएमएल कोशिकाओं को अस्थि मज्जा या 2 डिग्री यानी प्राप्तकर्ताओं के पेरिटोनियल गुहा से अलग किया जाता है और उन्हें क्रमशः एआई 14टीडीटोमेटो (आरएफपी +) या सीडी 45.2 चूहों में इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्ट किया जाता है। एएमएल कोशिकाओं को 2 डिग्री आर.ओ. प्राप्तकर्ताओं के पेरिटोनियल गुहा से अलग किया जाता है और उन्हें एआई 14टीडीटोमेटो (आरएफपी +) चूहों में आरओ इंजेक्शन द्वारा प्रत्यारोपित किया जाता है।
    नोट: 2 ° प्रत्यारोपण के लिए, हमने परिधीय रक्त में सीबीसी की निगरानी करके 2 ° प्राप्तकर्ताओं में रोग की प्रगति की पहचान की। एएमएल की स्थापना की पुष्टि करने के लिए, हमने हृदय पंचर के साथ-साथ अस्थि मज्जा, प्लीहा और यकृत द्वारा पूरे परिधीय रक्त को एकत्र किया। इसके अलावा, हमने आईपी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए आई.पी. लैवेज का प्रदर्शन किया। एकल कोशिका निलंबन अस्थि मज्जा, प्लीहा और आईपी लैवेज से प्राप्त किए गए थे जैसा कि ऊपर वर्णित है। इन साइटों की कोशिकाओं का विश्लेषण आरबीसी लाइसिस के बाद एक प्रवाह साइटोमीटर पर किया गया था। एएमएल कोशिकाओं को आरएफपी नकारात्मक (आरएफपी-) कोशिकाओं के रूप में पहचाना गया था। 3 ° प्रत्यारोपण के लिए, हमने समापन बिंदु पर रक्त, अस्थि मज्जा, प्लीहा, यकृत और आईपी कोशिकाओं का नमूना लिया; आरएफपी- या सीडी 45.1 + कोशिकाओं को एएमएल कोशिकाओं के रूप में पहचाना गया और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जांच की गई। 2 ° और 3 ° प्राप्तकर्ता चूहों को कोई विकिरण या एंटीबायोटिक पानी नहीं दिया गया था।

Figure 1
चित्र 1: अस्थि मज्जा एचएससी और सीरियल प्रत्यारोपण (1 °, 2 °, और 3 °) में MLL-AF9 वायरल ट्रांसडक्शन का योजनाबद्ध। डॉटेड शेड बॉक्स में दिखाए गए सेल सॉर्टर का उपयोग करके एससीए -1 और सी-किट डबल पॉजिटिव आबादी की छंटाई वैकल्पिक मानी जाती है, अगर संसाधन अनुमति देते हैं। यह आंकड़ा बायोरेंडर (https://biorender.com/) का उपयोग करके बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. इंट्रा-पेरिटोनियल लैवेज

  1. 15 एमएल बाँझ ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पेरिटोनियल गुहा में 5 एमएल अपूर्ण आईएमडीएम मीडिया को दो बार इंजेक्ट करें। कमरे के तापमान पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और 3 मिनट के लिए 400 x g । 3°CD45.2 प्राप्तकर्ता चूहों (n = 3) में आईपी इंजेक्शन के माध्यम से 2 ° प्राप्तकर्ताओं की पेरिटोनियल गुहा से एएमएल कोशिकाओं (4 x 10 5 कोशिकाओं / माउस) का प्रत्यारोपण करें।

7. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण 28

  1. इच्छामृत्यु पर चूहों से तिल्ली, यकृत और फीमर को अलग करें। उन्हें 10% (v/v) बफर फॉर्मेलिन के 5 एमएल में ठीक करें। तुलना के लिए स्वस्थ समकक्षों से तिल्ली और यकृत का नमूना लें।
  2. पैराफिन में निश्चित ऊतकों को एम्बेड करें और उन्हें वर्गों में काट लें। हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) रंगों के साथ वर्गों को दाग दें।
  3. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक संगत सॉफ्टवेयर के साथ स्थापित 20x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत छवियों को प्राप्त करें।

8. अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का प्रदर्शन

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए अभिकर्मक में आरएनए तैयार करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए 0.5-1.0 μg आरएनए का उपयोग करें।
  3. QPCR किट का उपयोग कर QPCR करने के लिए cDNA का उपयोग करें और नमूने को QPCR सिस्टम में चलाएँ। निम्नलिखित पूर्व-मान्य टैकमैन जांच का उपयोग करें: KMT2A (MLL; रेफ सेक: NM_001197104 (2), आईडीटी) 29 और 18 एस राइबोसोमल आरएनए (Hs99999901_s1)।
  4. अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए केएमटी 2 ए और 18 एस एम्प्लिकॉन को 2% अगारोस जेल पर लोड करें। संगत सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम के साथ स्थापित इमेजर में छवियाँ प्राप्त करें।

9. डेटा प्रोसेसिंग

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण करें और परिणामों को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत करें।

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Representative Results

प्रत्यारोपण के आरओ और आईपी मार्गों का उपयोग करके मुराइन एएमएल कोशिकाओं की प्रत्यारोपण दक्षता की तुलना
इससे पहले, एमएलएल-एएफ 9-ट्रांसड्यूस्ड एलएसके कोशिकाओं के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ता चूहों में 1 ° एएमएल की स्थापना की सूचना दी गई थी, और सीरियल प्रत्यारोपण30 द्वारा 1 ° एएमएल कोशिकाओं की प्रत्यारोपण क्षमता का प्रदर्शन किया गया था। वर्तमान अध्ययन प्रत्यारोपण करने के लिए अस्थि मज्जा लिन-कोशिकाओं का उपयोग करने की संभावना का मूल्यांकन करने वाला पहला है। असामान्य ल्यूकोसाइटोसिस (चित्रा 2 ए) की उपस्थिति और अस्थि मज्जा और प्लीहा (चित्रा 2 बी) में ल्यूकेमिक कोशिकाओं (सीडी 45.1 +) की बढ़ती घुसपैठ 1 डिग्री एएमएल उत्पन्न करने के लिए अस्थि मज्जा लिन-कोशिकाओं का उपयोग करने की व्यवहार्यता का समर्थन करती है। रोग प्रेरण अवधि की तुलना करने के लिए, प्रति प्राप्तकर्ता दो दाता चूहों को एलएसके या लिन-कोशिकाओं को अलग करने के लिए इच्छामृत्यु दी गई थी। परिणामों से, एलएसके या लिन-कोशिकाओं (चित्रा 2 सी) के साथ प्रत्यारोपित 1 ° प्राप्तकर्ताओं में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया।

1 ° AML के मेटास्टेसिस की जांच के दौरान, यह पाया गया कि AML कोशिकाएं MLL-AF9-ट्रांसड्यूस्ड लिन-कोशिकाओं (पूरक चित्रा 1) द्वारा 1 ° प्राप्तकर्ताओं के पेट की गुहा में फैली हुई हैं। इस खोज ने अन्वेषण को यह परीक्षण करने के लिए प्रेरित किया कि क्या आई.पी. इंजेक्शन को मुराइन एएमएल की पीढ़ी में अपनाया जा सकता है, जो प्रत्यारोपण के एक नए और आसान मार्ग के रूप में काम कर सकता है। एएमएल दाता कोशिकाओं के रूप में अस्थि मज्जा लिन-आबादी का उपयोग करने की सफलता के कारण, वर्तमान डेटा ने एमएलएल-एएफ 9-ट्रांसड्यूस्ड अस्थि मज्जा लिन-कोशिकाओं के आईपी इंजेक्शन के माध्यम से 1 डिग्री एएमएल की स्थापना की पुष्टि की, जैसा कि ल्यूकोसाइटोसिस (चित्रा 2 डी) और प्राप्तकर्ता चूहों के अस्थि मज्जा और प्लीहा में एएमएल कोशिकाओं (सीडी 45.1+) की उपस्थिति के रूप में देखा गया है (चित्रा 2 ई)। हालांकि, आई.पी. इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्यारोपण में आर.ओ. इंजेक्शन की तुलना में एएमएल विकसित करने में अधिक समय लगा, बावजूद इसके कि प्राप्तकर्ताओं को समान संख्या में दाता कोशिकाएं प्राप्त हुईं (चित्रा 2 एफ)। इसके अलावा, चित्रा 2 एफ में अधिक लिन-कोशिकाओं (5.125 x 106 कोशिकाओं / माउस) के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित चूहों ने चित्रा 2 सी में कम लिन-कोशिकाओं (3.69 x 106 कोशिकाओं / माउस) के साथ प्रत्यारोपित लोगों की तुलना में एएमएल तेजी से विकसित किया।

1 ° AML प्राप्तकर्ताओं (चित्रा 2F) में इनक्यूबेशन समय की अंतर्निहित असंगति के कारण, 2 ° प्राप्तकर्ताओं में आईपी प्रत्यारोपण का परीक्षण करने का प्रयास किया गया था। 2 ° प्रत्यारोपण के लिए, आईपी इंजेक्शन इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित 1 ° प्राप्तकर्ताओं से अलग 8 x 105 एएमएल कोशिकाओं के साथ किया गया था। 2 ° प्राप्तकर्ताओं ने प्रत्यारोपण के बाद 1 महीने से भी कम समय में ल्यूकोसाइटोसिस (चित्रा 2 जी) और महत्वपूर्ण हेपेटोस्प्लेनोमेगाली (चित्रा 2 एच) दिखाया, जो 1 डिग्री प्रत्यारोपण से स्पष्ट प्रगति थी। इस अवलोकन के अनुरूप, परिधीय रक्त, अस्थि मज्जा और प्लीहा (चित्रा 2 आई), साथ ही पेरिटोनियल गुहा (पूरक चित्रा 1) में एएमएल कोशिकाओं (आरएफपी-) का भी पता लगाया गया था। इसके अलावा, 2 ° प्राप्तकर्ताओं के रक्त, प्लीहा और यकृत में ऑन्कोजीन KMT2A की अभिव्यक्ति ने भी एएमएल (चित्रा 2 जे) की सफल पीढ़ी की पुष्टि की। इसके अलावा, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने इंट्रा-पेरिटोनियल ट्रांसप्लांट किए गए चूहों (चित्रा 2 के) के प्लीहा और यकृत में ल्यूकेमिक कोशिकाओं की घुसपैठ का प्रदर्शन किया। ये डेटा पुष्टि करते हैं कि आई.पी. इंजेक्शन-जनित 1 ° एएमएल कोशिकाएं 2 ° प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपण योग्य हैं। इसके अलावा, प्राप्तकर्ताओं में प्रति माउस 8 x 105 एएमएल कोशिकाओं के इंजेक्शन ने प्राप्तकर्ताओं में प्रति माउस 8 x 105 एएमएल कोशिकाओं के आर.ओ. इंजेक्शन के बराबर एनग्राफमेंट हासिल किया (चित्रा 2 एल)।

एलएससी की प्रमुख विशेषताओं में से एक सीरियल प्रत्यारोपण है; इस प्रकार, 2 ° प्राप्तकर्ताओं में एएमएल की स्थापना का पता लगाने के लिए, इस प्रोटोकॉल ने यह सत्यापित करने का प्रयास किया कि क्या 2 ° यानी प्रत्यारोपण से एएमएल कोशिकाएं क्रमिक रूप से प्रत्यारोपण योग्य बनी हुई हैं, साथ ही साथ 3 ° प्रत्यारोपण में आईपी इंजेक्शन द्वारा स्टेम सेल प्रत्यारोपण की व्यवहार्यता भी है। अस्थि मज्जा (पीबीएस के0.5 एमएल में 8 x 10 5 ल्यूकेमिक कोशिकाओं / माउस) या आईपी लैवेज (पीबीएस के0.5 एमएल में 4 x 10 5 ल्यूकेमिक कोशिकाओं / माउस) से अलग एएमएल कोशिकाओं को 3 डिग्री प्राप्तकर्ताओं में इंजेक्ट किया गया था। यद्यपि विभिन्न स्रोतों से उत्पन्न दाता कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया जा रहा है, 3 ° प्राप्तकर्ता चूहों ने तीव्र रूप से एएमएल संकेतों (अस्थि मज्जा कोशिकाओं और आईपी कोशिकाओं के लिए क्रमशः 3 और 4 सप्ताह के भीतर) का प्रदर्शन किया, जिसमें ल्यूकोसाइटोसिस (चित्रा 3 ए) और हेपेटोस्प्लेनोमेगाली (चित्रा 3 बी), रक्त, अस्थि मज्जा और प्लीहा में ल्यूकेमिक कोशिकाओं की उपस्थिति (चित्रा 3 सी), और केएमटी 2 ए की अभिव्यक्ति (चित्रा 3 डी) शामिल हैं। ). फीमर और प्लीहा के हिस्टोलॉजिकल अवलोकन ने ल्यूकेमिक कोशिकाओं की घुसपैठ का प्रदर्शन किया (चित्रा 3 ई)। तुलना के रूप में, 2 ° प्राप्तकर्ताओं से ल्यूकेमिक स्प्लेनोसाइट्स (4 x 105 कोशिकाओं) का आरओ इंजेक्शन भी 3 ° प्राप्तकर्ताओं में एएमएल को संलग्न करने और विकसित करने में समान रूप से सक्षम था, जो ल्यूकोसाइटोसिस (पूरक चित्रा 2 ए), हेपेटोस्प्लेनोमेगाली (पूरक चित्रा 2 बी), और रक्त, अस्थि मज्जा और प्लीहा में एएमएल कोशिकाओं की घुसपैठ (पूरक चित्रा 2 सी) की विशेषता है।

इंट्रा-पेरिटोनियल प्रत्यारोपण एएमएल कोशिकाओं के 3 ° प्रत्यारोपण के लिए भी प्रभावी है
2° और 3° प्रत्यारोपण की तुलना में, एक निष्कर्ष आसानी से निकाला जा सकता है कि 3° प्रत्यारोपण (चित्रा 3F) ने आईपी और आरओ इंजेक्शन दोनों के लिए 2 ° प्रत्यारोपण (चित्रा 2 एल) की तुलना में बहुत तेजी से प्रगति की। विशेष रूप से, 4 x 105 एएमएल कोशिकाओं / माउस के इंजेक्शन ने 6 दिनों के लिए समान संख्या में एएमएल कोशिकाओं के इंजेक्शन की तुलना में बाद में एएमएल विकसित किया (चित्रा 3 एफ), संभवतः पेरिटोनियल गुहा से अस्थि मज्जा आला में प्रवास पर बिताए गए समय को दर्शाता है। दिलचस्प बात यह है कि 3 ° प्रत्यारोपित चूहों में पेरिटोनियल गुहा (पूरक चित्रा एस 2) में ल्यूकेमिक कोशिकाओं की उच्च आवृत्ति ने सुझाव दिया कि पेरिटोनियल गुहा ल्यूकेमिक कोशिकाओं के तेजी से विस्तार के लिए जगह भी प्रदान कर सकती है। इसके अलावा, रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित 1 ° और 3 ° प्राप्तकर्ताओं के पेरिटोनियल गुहा में ल्यूकेमिक कोशिकाओं की उपस्थिति ने पेरिटोनियल गुहा और रक्त प्रणाली के बीच ल्यूकेमिक कोशिकाओं के पारस्परिक परिसंचरण का संकेत दिया, जो आईपी प्रत्यारोपण को सही ठहराता है। सामूहिक रूप से, ये निष्कर्ष एएमएल के सीरियल प्रत्यारोपण में आईपी इंजेक्शन के उपयोग को मान्य करते हैं।

Figure 2
चित्र 2: 1° और 2° प्रत्यारोपण में मुराइन एएमएल मॉडल का उत्पादन। (A) पूर्ण रक्त गणना (CBC; 1 x 103 कोशिकाएं/μL रक्त), WBC, न्यूट्रोफिल (NE), लिम्फोसाइट (LY), मोनोसाइट (MO), ईोसिनोफिल (EO), और बेसोफिल (BA) प्रोफाइल 1° प्राप्तकर्ता चूहों की प्रोफ़ाइल को MLL-AF9-ट्रांसड्यूस्ड अस्थि मज्जा लिन-कोशिकाओं (5.125 x 106 कोशिकाओं/माउस) के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित किया गया। (बी) 1 ° सीडी 45.2 प्राप्तकर्ता चूहों के अस्थि मज्जा और प्लीहा में एएमएल कोशिकाओं (सीडी 45.1 +) की आवृत्ति का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण एमएलएल-एएफ 9-ट्रांसड्यूस्ड अस्थि मज्जा लिन- (5.125 x 106 कोशिकाओं / माउस) कोशिकाओं (एन = 3) के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित किया गया। (ग) एमएलएल-एएफ9-ट्रांसड्यूस्ड अस्थि मज्जा एलएसके कोशिकाओं (दो दाताओं से पृथक 3.16 x 105 कोशिकाएं/माउस) या लिन-कोशिकाओं (दो दाताओं से पृथक 3.69 x 106 कोशिकाएं/माउस) के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं में 1° एएमएल की इनक्यूबेशन अवधि, एन = 3)। प्रत्येक प्राप्तकर्ता को दो दाताओं से अलग कोशिकाएं मिलीं। (डी) हेमवेट (एन = 4) द्वारा एमएलएल-एएफ 9-ट्रांसड्यूस्ड अस्थि मज्जा लिन-कोशिकाओं (5.125 x 106 कोशिकाओं / माउस) के साथ इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित 1 ° प्राप्तकर्ता चूहों का सीबीसी विश्लेषण। (ई) 1° CD45.2 प्राप्तकर्ता चूहों के अस्थि मज्जा और प्लीहा में AML कोशिकाओं (CD45.1+) की आवृत्ति का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण MLL-AF9-ट्रांसड्यूस्ड अस्थि मज्जा लिन-कोशिकाओं (5.125 x 106 कोशिकाओं / माउस, n = 3) के साथ इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित किया गया। (एफ) एमएलएल-एएफ 9-ट्रांसड्यूस्ड अस्थि मज्जा लिन-कोशिकाओं के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल (एन = 3) या इंट्रा-पेरिटोनियल (एन = 3) प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं में 1 डिग्री एएमएल की इनक्यूबेशन अवधि। प्रत्येक प्राप्तकर्ता को दाता कोशिकाओं (5.125 x 106 कोशिकाओं / माउस) की समान मात्रा प्राप्त हुई। (छ) 2° प्राप्तकर्ताओं का सीबीसी विश्लेषण 1° की तिल्ली से पृथक एएमएल कोशिकाओं (8 x 105 कोशिकाओं/माउस) के साथ इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित किया जाता है। (एच) 2 ° प्राप्तकर्ता चूहों के प्लीहा और यकृत के वजन (मिलीग्राम) को एएमएल कोशिकाओं (8 x 105 कोशिकाओं / माउस) के साथ इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित किया गया। छायांकित क्षेत्र प्लीहा और यकृत की सामान्य वजन सीमाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। 2 ° प्राप्तकर्ता चूहों और स्वस्थ समकक्षों से तिल्ली और यकृत की प्रतिनिधि छवि। (I) 2° RFP+ प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त, अस्थि मज्जा और प्लीहा में AML कोशिकाओं (RFP-) की आवृत्ति का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण 1° प्रतिरोपित प्राप्तकर्ताओं (n = 3) की तिल्ली से पृथक AML कोशिकाओं (8 x 105 कोशिकाओं / माउस) के साथ इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित किया गया। (जे) केएमटी 2 ए और 18 एस की जीन अभिव्यक्ति को डीएनए बैंड के रूप में प्रस्तुत किया गया। आरएनए को 2 डिग्री प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त, अस्थि मज्जा, प्लीहा और यकृत से अलग किया गया था, जिन्हें 1 डिग्री के प्लीहा से अलग एएमएल कोशिकाओं (8 x 105 कोशिकाओं / माउस) के साथ इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। (के) 2° प्राप्तकर्ताओं के प्लीहा (बाएं पैनल) और यकृत (दाएं पैनल) में हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों की प्रतिनिधि छवियों को 1 ° प्रतिरोपित प्राप्तकर्ताओं और स्वस्थ समकक्षों की तिल्ली से पृथक एएमएल कोशिकाओं (8 x 105 कोशिकाओं / माउस) के साथ इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित किया गया। (एल) प्राप्तकर्ताओं में 2 ° AML की इनक्यूबेशन अवधि क्रमशः रेट्रो-ऑर्बिटल (4 x 105/माउस, n = 9) या इंट्रा-पेरिटोनियल (8 x 105/माउस, n = 4) प्रतिरोपित की जाती है, जिसमें क्रमशः 1° r.o. और यानी प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं से पृथक AML कोशिकाएं होती हैं। परिणाम SEM ± मतलब है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आई.पी. प्रत्यारोपण के माध्यम से एएमएल कोशिकाओं का 3 ° प्रत्यारोपण। (ए-ई) 3 ° आरएफपी + या सीडी 45.2 प्राप्तकर्ता चूहे। बाएं: 2 ° प्राप्तकर्ताओं के अस्थि मज्जा से एएमएल कोशिकाओं (8 x 105 कोशिकाओं / माउस) का इंजेक्शन। दाएं: 2 ° प्राप्तकर्ताओं (एन = 3) के पेरिटोनियल गुहा (यानी) से एएमएल कोशिकाओं (4 x 105 कोशिकाओं / माउस) का इंजेक्शन। (ए) हेमवेट द्वारा 3 ° प्राप्तकर्ता चूहों का सीबीसी विश्लेषण। (बी) 3 ° प्राप्तकर्ता चूहों के प्लीहा और यकृत का वजन (मिलीग्राम)। छायांकित क्षेत्र प्लीहा और यकृत की सामान्य वजन सीमाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) 3 ° प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त, अस्थि मज्जा और प्लीहा में एएमएल कोशिकाओं (बाएं: आरएफपी-; दाएं: सीडी 45.1 +) की आवृत्ति का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण। (डी) केएमटी 2 ए और 18 एस की जीन अभिव्यक्ति को डीएनए बैंड के रूप में प्रस्तुत किया गया। आरएनए को 3 ° प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त, अस्थि मज्जा, प्लीहा और यकृत से अलग किया गया था। (ई) 3 ° प्राप्तकर्ता चूहों के तिल्ली (बाएं पैनल) और फीमर (दाएं पैनल) में हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों की प्रतिनिधि छवियां। (एफ) प्राप्तकर्ताओं में 3° एएमएल की इनक्यूबेशन अवधि क्रमशः रेट्रो-ऑर्बिटल (4 x 105 सेल / माउस, एन = 3) या इंट्रा-पेरिटोनियल (4 x 105 सेल / माउस, एन = 3) को 2 डिग्री आरओ और आईपी प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं से अलग एएमएल कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है। परिणाम SEM ± मतलब है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: पेरिटोनियल गुहा में एएमएल सेल घुसपैठ का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। 1° प्राप्तकर्ताओं के पेरिटोनियल लैवेज में एएमएल कोशिकाओं की आवृत्ति रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित की जाती है (1 ° RO, n = 2), 2 ° प्राप्तकर्ताओं को इंट्रा-पेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित किया जाता है (2 ° IP, n = 2), और 3 ° प्राप्तकर्ताओं को अस्थि मज्जा AML कोशिकाओं (3 ° BM-IP, n = 3) और यानी AML कोशिकाओं (3 ° IP-IP, n = 3) के साथ i.p. इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्यारोपित किया जाता है। एन = 3)। परिणाम SEM ± मतलब है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: आर.ओ. इंजेक्शन के माध्यम से एएमएल स्प्लेनोसाइट्स का 3 ° प्रत्यारोपण। (ए) 2 डिग्री प्राप्तकर्ता चूहों की तिल्ली से एएमएल कोशिकाओं (4 x 105 कोशिकाओं / माउस) के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित 3 ° प्राप्तकर्ता चूहों का सीबीसी विश्लेषण। (बी) 3 ° रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ता चूहों के प्लीहा और यकृत का वजन (मिलीग्राम)। छायांकित क्षेत्र प्लीहा और यकृत की सामान्य वजन सीमाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) रक्त, अस्थि मज्जा और प्लीहा में 3 ° रेट्रो-कक्षीय रूप से प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ता चूहों (एन = 3) में एएमएल कोशिकाओं (आरएफपी-) की आवृत्ति। परिणाम SEM ± मतलब है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ये उपर्युक्त वर्णित अध्ययन सहायक सबूत प्रदान करते हैं कि लिन-कोशिकाओं का प्रत्यारोपण 1 ° मुराइन एएमएल की पीढ़ी में एलएसके कोशिकाओं के बराबर है। इसके अलावा, वर्तमान डेटा से यह भी पता चलता है कि अंतःशिरा (या आर.ओ.) इंजेक्शन की तुलना में मुराइन एएमएल स्थापित करने के लिए आईपी इंजेक्शन एक कुशल और सुविधाजनक तरीका है।

एलएसके कोशिकाओं के अलावा, ग्रैनुलोसाइट-मोनोसाइट पूर्वज (जीएमपी), सामान्य लिम्फोइड पूर्वज (सीएलपी), और सामान्य माइलॉयड पूर्वज (सीएमपी) जैसी अन्य आबादी को विभिन्न इनक्यूबेशन अवधि31,32 के साथ 1 डिग्री एमएलएल-एएफ 9-प्रेरित एएमएल की पीढ़ी में दाता कोशिकाओं के रूप में प्रतिस्थापित किया गया है, हालांकि इष्टतम विकल्प का सुझाव देने के लिए मात्रात्मक तुलना की कमी है। वर्तमान अध्ययन में, एक ही दाता चूहों से अलग लिन- और एलएसके में 1 ° एमएलएल-एएफ 9-प्रेरित एएमएल की पीढ़ी में कोई स्पष्ट अंतर नहीं था, यह देखते हुए कि ट्रांसड्यूस्ड माइलॉयड पूर्वज कोशिकाएं (एससीए -1-) एएमएल33 शुरू करने में सक्षम थीं। एलएसके आबादी के प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित छंटाई के लिए आवश्यक व्यय और समय को ध्यान में रखते हुए, ये अध्ययन 1 ° प्रत्यारोपण के लिए दाता कोशिकाओं के रूप में लिन-आबादी के उपयोग का समर्थन करते हैं। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में 4.19 से 4.23 तक के चरण आवश्यक नहीं हैं, लेकिन वैकल्पिक हैं, और अंतिम परिणाम को प्रभावित नहीं करते हैं।

1 ° प्रत्यारोपण में दाता चूहों की मात्रा के संदर्भ में, एक दाता ~ 1.0 से 1.5 x10 5 एलएसके कोशिकाओं को प्रदान करने में सक्षम था, और एलएसके कोशिकाओं की इस मात्रा के साथ प्रत्यारोपित एक प्राप्तकर्ता ने लगभग 4 महीनों में 1 डिग्री एएमएल विकसित किया। हालांकि, प्रति प्राप्तकर्ता ~ 3 x 105 कोशिकाओं तक एलएसके कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए दाताओं की संख्या बढ़ाने से इनक्यूबेशन अवधि ~ 70 दिनों तक कम हो सकती है। इस प्रकार, दो दाताओं को तेजी से 1 ° AML उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। यह सिद्धांत लिन-कोशिकाओं पर भी लागू होता है, जिसमें ~ 1.0 से 2.5 x 106 लिन-कोशिकाओं को प्रत्येक दाता माउस से अलग किया जा सकता है। हालांकि, जब दाता सेल घनत्व में वृद्धि हुई थी, तो ल्यूकेमोजेनेसिस का टर्नअराउंड समय काफी कम था। चरण 4.1 में दाता चूहों की संख्या तय करते समय इन आंकड़ों को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

आर.ओ. इंजेक्शन की तुलना में, आईपी इंजेक्शन को पूर्ण विकसित 1 डिग्री एएमएल विकसित करने में लगभग ~ 20 दिन लगे, हालांकि आईपी इंजेक्शन के लिए दाता कोशिकाओं को बढ़ाकर इस सीमा को दूर किया गया था। इस तरह के एक स्पष्ट अंतर के बावजूद, दोनों विधियों ने समापन बिंदु पर अस्थि मज्जा और प्लीहा में समान एनग्राफमेंट दर (>80%) दिखाई, जो एएमएल में 1 डिग्री प्रत्यारोपण में आईपी इंजेक्शन की सामान्य प्रयोज्यता को दर्शाता है। 1 ° प्रत्यारोपण के लिए अपेक्षाकृत लंबी इनक्यूबेशन अवधि, साथ ही प्राप्तकर्ता चूहों में विलंबता की असंगति के संदर्भ में इसकी अप्रत्याशित रोग प्रगति, नियंत्रित प्रयोगों के लिए एक प्रमुख सीमा है, जैसे औषधीय हस्तक्षेप और यांत्रिक अध्ययन। इस प्रकार, बाद के सीरियल प्रत्यारोपण में प्रत्यारोपण के लिए 1 ° ल्यूकेमिक कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, आमतौर पर 2 ° प्रत्यारोपण (चित्रा 1)। चूंकि प्लीहा में 3 x 108 ल्यूकेमिक कोशिकाएं (और अस्थि मज्जा में 6 x 107 कोशिकाएं) समापन बिंदु पर प्रत्येक 1 ° प्राप्तकर्ता से उत्पन्न की जा सकती हैं, जो 300 से अधिक चूहों पर 2 ° प्रत्यारोपण करने के लिए पर्याप्त होगी, इसलिए विलंबता को कम करने और 1 ° प्रत्यारोपण की एनग्राफमेंट दर को बढ़ाने के लिए कम प्राप्तकर्ताओं को यथासंभव अधिक से अधिक कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने का सुझाव दिया जाता है। जो चरण 4.1 और चरण 5.2 के लिए महत्वपूर्ण है।

इसकी सुसंगत और छोटी विलंबता को देखते हुए, 2 ° प्रत्यारोपण का उपयोग कई अनुप्रयोगों में किया जा सकता है, जिसमें ऊपर उल्लिखित विवो प्रयोग भी शामिल हैं। इसके अलावा, आईपी इंजेक्शन अनुभवहीन तकनीशियनों के लिए प्रचुर मात्रा में प्रत्यारोपण की प्रक्रिया की सुविधा भी प्रदान करता है। आर.ओ. इंजेक्शन मार्ग की तुलना में, जो आम तौर पर 3 सप्ताह में एएमएल उत्पन्न करता है, आईपी इंजेक्शन विधि ने पूर्ण विकसित एएमएल स्थापित करने के लिए दाता कोशिकाओं की समान संख्या के साथ थोड़ा लंबा (~ 4 सप्ताह) समय लिया। भले ही यह अपेक्षाकृत आसान और अधिक सुविधाजनक है, प्रत्यारोपित सेल संख्या में वृद्धि या तृतीयक प्रत्यारोपण करने से आई.पी. इंजेक्शन द्वारा एएमएल की प्रगति में तेजी आ सकती है।

सारांश में, इस तकनीक की प्रमुख सीमा 1 ° और 2 ° प्रत्यारोपण दोनों में दाता कोशिकाओं की समान मात्रा के साथ अंतःशिरा इंजेक्शन की तुलना में लंबा इनक्यूबेशन समय है। हालांकि, ट्रांसप्लांट किए जाने वाले सेल नंबर को बढ़ाकर इसे आसानी से दूर किया जा सकता है। स्पष्ट लाभों के अलावा, इस तकनीक के कुछ अन्य अनुप्रयोग भी हैं। उदाहरण के लिए, आईपी प्रत्यारोपण विधियों का उपयोग करने की क्षमता भी महंगे इन विट्रो कल्चर मीडिया की आवश्यकता के बिना इन कोशिकाओं को नियमित रूप से संस्कृति करने के लिए काम कर सकती है। अन्य हेमेटोलॉजिकल विकृतियों, जैसे लिम्फोइड ल्यूकेमिया और क्रोनिक माइलॉयड ल्यूकेमिया, और रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स में इस तकनीक के आवेदन का विस्तार करने के लिए, भविष्य में आगे के अध्ययन किए जाने की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखकों ने समय पर तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए हक इंस्टीट्यूट की फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा और पशु नैदानिक प्रयोगशाला, पशु चिकित्सा और जैव चिकित्सा विज्ञान विभाग, पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी की हिस्टोपैथोलॉजी कोर सुविधा को धन्यवाद दिया। इस काम को अमेरिकन इंस्टीट्यूट फॉर कैंसर रिसर्च (केएसपी), पेन स्टेट कॉलेज ऑफ एग्रीकल्चरल साइंसेज, पेन स्टेट कैंसर इंस्टीट्यूट, यूएसडीए-निफा प्रोजेक्ट 4771, केएसपी और आरएफपी के लिए परिग्रहण संख्या 00000005 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a-Select competent cells  Bioline BIO-85027
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma Aldrich Cat# A-9434
Ampicillin Sigma Aldrich Cat# A0797
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade Gemini bio-products Cat# 700-102P
Ciprofloxacin HCl GoldBio.com Cat# C-861-100
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco Cat# 11960-044
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning Cat# 21-031-CV
EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade Calbiochem Cat# 324503
Fetal Bovine Serum - Premium Select Atlanta Biologicals Cat# S11550
Holo-transferrin, bovine Sigma Aldrich Cat# T1283
Insulin solution human Sigma Cat# I-9278
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco Cat# 12440-053
L-glutamine 200 mM (100×) solution HyClone, Gelifesciences Cat# SH30034.01
LB broth, Lennox NEOGEN Cat #: 7290A
LB Broth with agar (Miller) Sigma Aldrich Cat# L-3147
Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) Miltenyi Biotec Cat# 130-124-211
Mouse Interleukin-3 (IL-3) Gemini bio-products Cat# 300-324P
Mouse Interleukin-6 (IL-6) Gemini bio-products Cat# 300-327P
Mouse Stem Cell Factor (SCF) Gemini bio-products Cat# 300-348P
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Corning Cat# 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO) cells ATCC CRL-3214
Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular JT. Baker Cat# 2940-01
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) BioLegend  Cat # 105812
Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) BD Pharmingen Cat# 558162
Recombinant Murine Flt3-Ligand Pepro Tech, INC. Cat# 250-31L
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment TaKaRa Cat# T100A
TransIT-293 Reagent MirusBio Cat# MIR 2705
TRI Reagent Sigma Aldrich Cat# T9424
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco Cat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco Cat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich Cat# M3148
Commercial Assays 
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit  StemCell technologies Cat# 19856A
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher  Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMix Quanta Bio Cat# 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25) Qiagen Cat#:12163
Animals
Ai14TdTomato mice Jackson Laboratory Strain # 007914
CD45.1 C57BL6/J mice  Jackson Laboratory Strain # 002014
CD45.2 C57BL6/J mice  Jackson Laboratory Strain # 000664
Instruments and Softwares
Adobe illustrator  Version 25.2.3
BD accuri C6 flow cytometer BD Biosciences
FlowJo 10.8.0 BD
GeneSys software program  Version 1.5.7.0
GraphPad Prism version 6  GraphPad
Hemavet 950FS  Drew Scientific
7300 Real time PCR system Applied Biosystems
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging G:Box Chemi

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References

  1. Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
  3. Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
  4. Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
  5. Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
  6. Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
  7. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  8. Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
  9. Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
  10. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
  11. Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
  12. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  13. Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
  14. Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
  15. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  16. Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
  17. Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
  18. Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
  19. Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
  20. Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
  21. Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
  22. Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
  23. Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
  24. Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
  25. Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
  26. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  27. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  28. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  29. Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
  30. Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
  31. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  32. Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
  33. Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).

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कैंसर अनुसंधान अंक 191
चूहों में तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया उत्पन्न करने के लिए इंट्रा-पेरिटोनियल प्रत्यारोपण
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Qian, F., Arner, B. E., Nettleford,… More

Qian, F., Arner, B. E., Nettleford, S. K., Paulson, R. F., Prabhu, K. S. Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice. J. Vis. Exp. (191), e64834, doi:10.3791/64834 (2023).

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