Summary
هنا ، يتم استخدام الحقن داخل الصفاق لخلايا سرطان الدم لإنشاء ونشر سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) في الفئران. هذه الطريقة الجديدة فعالة في الزرع التسلسلي لخلايا AML ويمكن أن تكون بمثابة بديل لأولئك الذين قد يواجهون صعوبات وتناقضات مع الحقن في الوريد في الفئران.
Abstract
هناك حاجة غير ملباة لعلاجات جديدة لعلاج ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) والانتكاس المرتبط به الذي يتضمن الخلايا الجذعية لسرطان الدم المستمر (LSCs). إن نموذج القوارض التجريبي ل AML لاختبار العلاجات القائمة على زرع هذه الخلايا بنجاح عن طريق الحقن المداري الخلفي في الفئران المتلقية محفوف بالتحديات. كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير طريقة سهلة وموثوقة ومتسقة لإنشاء نموذج فأر قوي من AML باستخدام طريق داخل الصفاق. في البروتوكول الحالي ، تم تحويل خلايا نخاع العظم مع فيروس قهقري يعبر عن البروتين الورمي الانصهاري البشري MLL-AF9. تم اختبار كفاءة مجموعات النسب السلبية (Lin-) و Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) كمانحين LSCs في تطوير AML الأولي ، وتم اعتماد الحقن داخل الصفاق كطريقة جديدة لتوليد AML. أجريت مقارنة بين الحقن داخل الصفاق والحقن خلف الحجاج في عمليات زرع متسلسلة لمقارنة وتباين الطريقتين. تم تحويل كل من خلايا Lin- و LSK مع فيروس MLL-AF9 البشري بشكل جيد في نخاع العظام والطحال من المتلقين ، مما أدى إلى ابيضاض الدم النقوي الحاد الكامل. أدى الحقن داخل الصفاق للخلايا المانحة إلى إنشاء AML في المتلقين عند الزرع التسلسلي ، وتم الكشف عن تسلل خلايا AML في الدم ونخاع العظام والطحال والكبد للمتلقين عن طريق قياس التدفق الخلوي و qPCR والتحليلات النسيجية. وبالتالي ، فإن الحقن داخل الصفاق هو وسيلة فعالة لتحريض AML باستخدام الزرع التسلسلي لخلايا اللوكيميا المانحة.
Introduction
ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) هو نوع من الأورام الخبيثة الدموية من مسببات متنوعة مع سوء التشخيص1. يضع جيل النماذج الحيوانية AML الأساس لفهم الاختلافات المعقدة والبيولوجيا المرضية في محاولة لاكتشاف علاجات جديدة2. يتضمن تكوين اللوكيم في الفئران زرع خلايا مانحة تعبر عن البروتينات السرطانية الانصهارية ، بما في ذلك عمليات الاندماج التي تنطوي على جين سرطان الدم المختلط (MLL) للحث بقوة على AML ، لتقليد المرض في البشر3. تم الإبلاغ عن أصول خلوية مختلفة للخلايا المانحة في زرعAML 4 المرتبط بجين MLL ، مع معرفة القليل جدا عن الخلايا المسؤولة عن أصل المرض.
تم تطوير طرق متعددة للزرع في الفئران. بدلا من الحقن داخل الفخذ ، الذي يدخل مباشرة خلايا مانحة متحولة في نخاع العظم5 ، تم استخدام الحقن الوريدي الذي يستخدم الضفيرة الجيبية الوريدية والوريد الذيل والوريد الوداجي على نطاق واسع لتوليد نماذج AML الفئران6،7،8،9. في حالة الحقن خلف المداري (r.o) ، كانت العديد من العيوب المتأصلة ، مثل الحد من الحجم ، والطلب التقني المرتفع ، وفرص قليلة للمحاولات المتكررة أو الخطأ ، وإصابات العين المحتملة ، عقبات رئيسية مع بدائل محدودة أو معدومة7. يمكن أن يكون لحقن الوريد الذيل مشاكل مماثلة إلى جانب الإصابات المحلية. لتسهيل الإجراء ، غالبا ما تحتاج الفئران إلى التسخين لتوسيع عروق الذيل10. من الصعب أيضا تحديد موقع الوريد الذيل بدون مصدر ضوء إضافي ، خاصة في سلالة الفئران C57BL / 6. بالنسبة لحقن الوريد الوداجي ، يحتاج موظفو البحث إلى تدريب كاف لتحديد موقع الوريد والحد من المضاعفات المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء كل من حقن الجيوب الأنفية الوريدية والوريد الوداجي تحت التخدير ، مما يضيف مستوى آخر من التعقيد. وبالتالي ، من المغري استكشاف طرق جديدة للزرع لتسهيل إنشاء نماذج الفئران AML.
يستخدم الحقن داخل الصفاق (i.p.) بشكل شائع لإدارة الأدوية والأصباغ والتخدير11،12،13،14،15 ؛ كما تم استخدامه لإدخال الخلايا المكونة للدم لتكوين الدم خارج الرحم16 وزرع الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم في نماذج الفئرانالمختلفة 17،18،19،20،21. ومع ذلك ، فقد تم استخدامه بشكل غير متكرر لإنشاء الأورام الخبيثة المكونة للدم في الفئران ، وخاصة لدراسة تطور مرض AML.
تصف الدراسة الحالية جدوى حقن i.p. في توليد نماذج الفئران AML ، بالإضافة إلى مقارنة كفاءة زرع السكان سلبي النسب (Lin-) و Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) كخلايا مانحة. توفر هذه النتائج طريقة بسيطة وفعالة لإنشاء نماذج تجريبية من ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) وسرطان الدم النخاعي ذي الصلة. مثل هذه الطريقة لديها القدرة على زيادة فهمنا لآليات المرض وكذلك توفير نموذج سهل نسبيا لاختبار العلاجات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة المسبقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في جامعة ولاية بنسلفانيا.
1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
- تحضير الأمبيسلين المكمل (AP) LB لوحات أجار (لوحات معقمة 10 سم). للقيام بذلك ، قم بإذابة 10 غرام من مرق LB مع أجار في 400 مل من الماء المقطر ، وحركه ، وارفع الحجم إلى 500 مل. قم بتعقيم المحلول عن طريق التعقيم ، ثم اترك المحلول يبرد ، وأضف 0.5 مل من الأمبيسلين (المخزون: 150 مجم / مل) في المحلول ، ثم رجه حتى يمتزج. أضف على الفور 18 مل من المحلول إلى طبق معقم مقاس 10 سم بالقرب من مصباح كحولي ، واتركه يتجمد في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخزين الألواح رأسا على عقب عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
- تحضير وسائط LB عن طريق إذابة 10 جم من LB بدون أجار في 500 مل من الماء المقطر. تعقيم الحل عن طريق التعقيم ، والسماح للحل لتبرد ، إضافة 0.5 مل من الأمبيسلين (المخزون: 150 ملغ / مل) في الحل ، ورجه لخلط.
- قم بإعداد مخزن التدفق عن طريق إضافة 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين و 10 مل من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (hiFBS) إلى 485 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS).
ملاحظة: لتعطيل FBS عن طريق التسخين ، ضع زجاجات FBS المذابة في حمام مائي على حرارة 56 درجة مئوية. تأكد من أن الزجاجات لا تنقلب أو تغمرها في حمام مائي. درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية للتدهور الكامل. لضمان ذلك ، انتظر حتى تستقر درجة الحرارة عند 56 درجة مئوية بعد وضع الزجاجات في حمام مائي. قم بتدوير الزجاجات برفق كل 10 دقائق ثلاث مرات. لا تسمح للمصل بالاحتضان لأكثر من 30 دقيقة. - قم بإعداد وسائط الصيانة عن طريق إضافة 50 مل من hiFBS و 5 مل من L-glutamine و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين إلى 440 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). تحضير وسائط النقل عن طريق إضافة 50 مل من hiFBS و 5 مل من L-glutamine إلى 445 مل من وسائط DMEM.
- قم بإعداد محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) بإضافة 4.145 جم من NH4Cl و 0.504 جم من NaHCO3 و 16.81 مجم من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) إلى 500 مل من الماء المقطر. قم بإعداد وسائط Dulbecco المعدلة (IMDM) غير المكتملة من Iscove عن طريق إضافة 75 مل من hiFBS ، و 5 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، و 0.5 مل من 10 مجم / مل من الأنسولين ، و 2.5 مل من 4 مجم / مل هولو ترانسفيرين ، و 3.5 ميكرولتر من β-ميركابتوإيثانول ، و 5 مل من إل-جلوتامين ، و 0.5 مل من سيبروفلوكساسين إلى 416.5 مل من وسائط IMDM.
- تحضير 10 مل من وسائط 2x IMDM ، حيث يكون تركيز السيتوكينات ضعف الكمية في وسائط IMDM 1x ، عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 50 نانوغرام / ميكرولتر mr-SCF ، 20 ميكرولتر من 25 نانوغرام / ميكرولتر mr-Flt3L ، 20 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر mr-IL-6 ، 20 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر mr-IL-3 ، 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل من الأنسولين ، و 50 ميكرولتر من 4 ملغ / مل هولو ترانسفيرين إلى 9.87 مل من وسائط IMDM غير المكتملة.
ملاحظة: تأكد من تعقيم المخزن المؤقت للتدفق ، والمخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء ، ووسائط الصيانة ، ووسائط النقل ، ووسائط IMDM غير المكتملة قبل الاستخدام.
2. تحويل البلازميد
- قم بإذابة 20 ميكرولتر من الخلايا المختصة α-Select على الجليد. أضف 1 ميكرولتر (~ 2 نانوغرام) من MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 البلازميد22 لإذابة الخلايا المختصة واخلطها برفق عن طريق النقر على الأنبوب. احتضان رد الفعل على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- صدم الخليط حراريا عن طريق الحضانة لمدة 40 ثانية في كتلة تسخين 42 درجة مئوية. نقل الأنبوب على الفور على الجليد لمدة 2 دقيقة.
- أضف 1 مل من وسائط LB (بدون الأمبيسلين) إلى الأنبوب ورجه عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
- قم بطرد الأنبوب في درجة حرارة الغرفة عند 500 × جم لمدة 4 دقائق وتخلص من 0.9 مل من المادة الطافية. أعد تعليق الراسب في 0.1 mL المتبقية من وسائط LB.
- انشر الخلايا المختصة المحولة على ألواح أجار AP LB الدافئة مسبقا (37 درجة مئوية). احتضان اللوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
- اختر مستعمرة واحدة وأنفق الخلايا المحولة في 10 مل من وسائط AP LB طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
- أضف 5 مل من الخلايا المختصة المحولة المستهلكة إلى 500 مل من وسائط AP LB في دورق واحتضان القارورة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
- استخرج البلازميد باستخدام مجموعة استخراج البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وأعد تعليقه في 0.5 مل من الماء عالي النقاء المعقم. تحديد كمية البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
3. نقل خلايا فينيكس إيكوتروبيك (pECO)
- ثقافة 2 × 106 خلايا / لوحة pECO في وسائط الصيانة في ألواح 10 سم في حاضنة CO2 رطبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. تأكد من الحفاظ على خلايا pECO في مرحلة النمو الأسي والانقسام بنشاط قبل المرور.
- عندما تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، اغسل الأطباق ب 5 مل من DPBS مرتين ، وأضف 1 مل من التربسين إلى الطبق ، واحتضانها في حاضنة CO2 رطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. احصد الخلايا ب 5 مل من وسائط الصيانة في أنبوب معقم سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسائط الصيانة.
- امزج 10 ميكرولتر من معلق الخلية و 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق وقم بتحميل 10 ميكرولتر على مقياس الدم لعد الخلايا.
إجمالي الخلايا / مل = (إجمالي الخلايا المحسوبة × عامل التخفيف × 104 خلايا / مل) / عدد المربعات التي تم عدها)
بذرة 2 × 10 6 خلايا / طبق في أطباق6 سم باستخدام 5 مل من وسائط الصيانة لنقل وزراعة الخلايا في حاضنة CO2 رطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. - استبدل وسائط الصيانة ب 5 مل من وسائط النقل عندما تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 50٪ -60٪ بعد 18 ساعة من الثقافة.
- احتفظ بكاشف النقل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل النقل.
- أضف 5.5 ميكروغرام من MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 بلازميد22 إلى 0.5 مل من وسائط DMEM العادية في أنبوب معقم سعة 1.5 مل. امزجه برفق عن طريق النقر على الأنبوب واتركه لمدة 10 دقائق.
- أضف 14.6 ميكرولتر (3 أضعاف كمية البلازميد ؛ v / w) من كاشف النقل إلى الأنبوب واضغط برفق على الأنبوب كل 10 دقائق ثلاث مرات.
- أضف الخليط بشكل موحد بالتنقيط إلى جميع مناطق الأطباق مع خلايا pECO في وسائط النقل. حرك الأطباق برفق للأمام والخلف 10 مرات وجانبية 10 مرات. احتضان الأطباق في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- قم بقياس كفاءة النقل عن طريق الفحص المجهري الفلوري وقياس التدفق الخلوي للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) كما هو موضح في22. يتم إدخال الخلايا أولا على FSC-A / FSC-H و FSC-A و SSC-A للحصول على مفردات. يتم بوابات GFP + على مخطط FL1 من خلال مقارنتها بالخلايا غير المنقولة.
- جمع وتصفية المواد الطافية من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر في أنبوب معقم 50 مل. استخدم المواد الطافية على الفور لنقلها أو قم بتجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: يجب خلط خلايا pECO بشكل صحيح وبذرها في أطباق بشكل موحد. اسمح للخلايا بالانتشار عن طريق تحريك الأطباق للأمام والخلف 10 مرات وجانبية 10 مرات أثناء البذر. قد يختلف رقم الخلية المراد بذرها اعتمادا على الاختلافات في العد. للعثور على رقم خلية البذر الأمثل الذي يمكن أن يحقق التقاء 50٪ -60٪ بعد 18 ساعة من الثقافة ، فإن خلايا البذر ذات التخفيفات التسلسلية مفيدة.
4. نقل العدس الفيروسي
- القتل الرحيم CD45.1 إناث الفئران C57BL6 / J البالغة من العمر 8-10 أسابيع (اثنان إلى ثلاثة فئران مانحة لكل فأر مستلم) في غرفة CO2 .
- تعقيم الجسم كله من الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول. ضع الفئران على وسادة جراحية معقمة على لوح الستايروفوم وقم بتثبيت الساقين من خلال وسادات مخلب الفأر.
- قطع الجلد فوق تجويف البطن عند خط الوسط وتوسيع المساحة تحت الجلد نحو الساقين الخلفيتين بمقص معقم حاد.
- قم بتمديد الشق من خط الوسط البطني وصولا إلى الكاحلين. قم بتوسيع المساحة تحت الجلد أسفل الأرجل الخلفية باستخدام شفرات المقص المعقم الحاد.
- قطع وتر العرقوب بمقص معقم حاد. امسك الوتر باستخدام ملقط مع الأسنان واقطع الطرف الآخر المتصل بعظم الفخذ لإزالة عضلة الساق.
- قطع وتر عضلات الفخذ تعلق على الركبة مع مقص معقم حاد. امسك الوتر باستخدام ملقط مع الأسنان واقطع رؤوس العضلات المتصلة بعظم الفخذ لإزالة عضلة الساق.
- قطع العضلات الأخرى المحيطة بعظم الفخذ في النهاية متصلة بالساق بمقص معقم حاد.
- قطع الكاحل بمقص معقم حاد النهاية ، وضمان بقاء الساق سليمة. امسك الطرف البعيد من عظم الفخذ باستخدام ملقط مع الأسنان وقطع مفصل الورك بمقص معقم حاد النهاية ، مع ضمان بقاء رأس الفخذ سليما.
- انقل القصبة وعظم الفخذ إلى مخزن مؤقت للتدفق في أنبوب معقم سعة 15 مل.
- افصل بين الساق وعظم الفخذ عن طريق كسر الركبة باليد. قم بإزالة الرضفة والغضاريف واللقمات الفخذية لكشف هضبة الظنبوب وعظم الفخذ البعيد باليد. قم بإزالة العضلات باستخدام شاش معقم ثم انقع العظام في محلول التدفق.
- قطع عنق الفخذ وغسل خلايا نخاع العظم مع عازلة التدفق من طرفي عظم الفخذ باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 23 غرام.
- قطع malleolus الظنبوب وغسل خلايا نخاع العظم مع عازلة التدفق من طرفي الظنبوب باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 23 غرام.
- قم بتفريق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة 18 جرام. جهاز طرد مركزي تعليق خلية واحدة عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء لتحلل كرات الدم الحمراء لمدة 3 دقائق.
- أضف 5 مل من محلول التدفق لإيقاف التحلل والطرد المركزي تعليق الخلية عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق.
- ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب معقم سعة 50 مل. الحبيبات ب 5 مل من محلول التدفق ، واخلطها ، وقم بتمريرها عبر مصفاة الخلية لجمع الخلايا.
- اضبط تركيز الخلية مع المخزن المؤقت للتدفق إلى 1 × 108 / مل في أنابيب البولي بروبلين ذات القاع المستدير.
- حدد خلايا Lin باستخدام مجموعة عزل الخلايا المكونة للدم بالماوس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- احتفظ جانبا بثلاثة أنابيب من 1 × 104 خلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعنصر تحكم واحد غير ملوث واثنين من عناصر التحكم الفردية الملطخة بالأجسام المضادة ل CD117 (c-Kit) و PE-Cy7 المترافق المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1). استخدم 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة (من مخزون 0.2 مجم / مل) لكل عنصر من عناصر التحكم الفردية الملطخة بالأجسام المضادة.
- قم بتلطيخ بقية الخلايا في أنبوب بكلا الجسمين المضادين (4 ميكرولتر من كل منهما من مخزون 0.2 مجم / مل) في 400 ميكرولتر. احتضان الأنابيب على الجليد في الظلام لمدة 0.5-1 ساعة.
- بعد التلوين ، اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من مخزن التدفق وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق.
- أعد تعليق الخلايا للتحكم غير الملوث وأدوات التحكم الفردية الملطخة بالأجسام المضادة في 100 ميكرولتر من مخزن التدفق. أعد تعليق الخلايا الملطخة بالأجسام المضادة المزدوجة في 1 مل من المخزن المؤقت للتدفق للفرز.
- فرز الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) كمجموعة LSK باستخدام فارز الخلايا كما هو موضح في23،24.
- أثناء التلوين ، قم بتغطية طبق معقم 6 سم بالريترونيكتين على النحو التالي: قم بإعداد 100 ميكروغرام / مل من مخزون الريترونيكتين في برنامج تلفزيوني وأضف 0.9 مل من برنامج تلفزيوني و 0.1 مل من الريترونيكتين إلى طبق 6 سم. معطف الطبق في غطاء معقم في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. ثم ، قم بإزالة retronectin وسد الطبق مع 0.5 مل من 2 ٪ BSA المصفاة (في PBS) لمدة 30 دقيقة. اغسل الطبق ب 5 مل من برنامج تلفزيوني مرتين ويكون الطبق جاهزا للنقل.
- أجهزة الطرد المركزي HSCs المصنفة أو خلايا Lin- غير المصنفة عند 4 °C و 400 × g لمدة 3 دقائق وإعادة التعليق في 3 مل من 2x (من السيتوكينات) وسائط IMDM و 3 مل من الطافات الفيروسية (المتولدة من الخطوة 3.10) في طبق مغلف بالارتجحام. احتضان الطبقفي حاضنة CO 2 رطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 6 أو 24 ساعة.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم فرز الخلايا الملينة أو فرزها اعتمادا على التصميم التجريبي.
5. الزرع التسلسلي (الشكل 1)
ملاحظة: كانت الفئران المتلقية الأولية ذكور الفئران C57BL6 / J البالغة من العمر 8-10 أسابيع (CD45.2). تم تزويدهم بالماء الذي يحتوي على مضادات حيوية لمنع التهابات الجهاز الهضمي الانتهازية ، من 3 أيام قبل الزرع إلى 7 أيام بعد الزرع. تم تشعيع الفئران المتلقية الأولية دون المميتة (4.75 غراي) قبل 3 ساعات من الزرع25. لم يتم تطبيق Isoflurane على الفئران مع الحقن داخل الصفاق.
- بعد النقل لمدة 6 أو 24 ساعة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة و 400 × جم لمدة 3 دقائق. استخدم التربسين لجمع الخلايا المتصلة بقاع الطبق إذا لزم الأمر. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا. حدد حجم PBS اعتمادا على عدد المتلقين (أي 0.1 مل / فأر و 0.5 مل / فأر للمستلمين الذين لديهم حقن خلف الحجاج وداخل الصفاق ، على التوالي).
- ضع الفئران المتلقية شبه المميتة في غرفة إيزوفلوران (يتم ضبط معدل تدفق الأكسجين على 1.0 لتر / دقيقة ويتم تعيين مبخر الأيزوفلوران على 5٪). ضع مرهما رطبا على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير. الفئران جاهزة لمزيد من الإجراءات عندما تنخفض نبضات القلب إلى 60 نبضة في الدقيقة.
- حقن الخلايا في الفئران المتلقية الأولية بأثر رجعي (0.1 مل / فأر)7 أو داخل الصفاق (0.5 مل / فأر)26 بإبرة 27 G1 / 2. راقب الفئران باستمرار حتى تكتسب وعيا كافيا للحفاظ على الاستلقاء القصي. راقب الفئران يوميا من أجل رفاهيتها بعد الزرع.
- بعد 1 شهر ، جمع الدم أسبوعيا عن طريق نزيف الحجاج الخلفي لمراقبة زيادة عدد الكريات البيضاء عن طريق تقييم تعداد الدم الكامل (CBC) على hemavet كما هو موضح أدناه.
- ضع الماوس بشكل جانبي بعد التخدير باستخدام الأيزوفلوران (يتم ضبط معدل تدفق الأكسجين على 1.0 لتر / دقيقة ويتم تعيين مبخر الأيزوفلورانس على 5٪). الفئران جاهزة لمزيد من الإجراءات عندما تنخفض نبضات القلب إلى 60 نبضة في الدقيقة.
- قم بتحريك العين بالإبهام والسبابة. اختراق الضفيرة الجيبية الوريدية مع أنبوب شعري هيماكريت نجمي من خلال canthus الداخلية.
- اجمع 20-25 ميكرولتر من الدم في أنبوب جمع الدم EDTA وأغلق الجفون لوقف النزيف. ضع قطرة واحدة من محلول جنتاميسين سلفات للعيون على العين.
- عند نقطة النهاية ، عندما تصل خلايا الدم البيضاء (WBCs) إلى 4 × 10 4 خلايا / ميكرولتر ، قم بالقتل الرحيم للفأر في غرفة CO2 وعزل خلايا نخاع العظم عن طريق شطف عظم الفخذ والساق بمحلول التدفق ، متبوعا بتحلل كرات الدم الحمراء كما هو مذكور في الخطوة4.
- عند نقطة النهاية ، احصد الخلايا الطحالية كما هو مذكور أدناه.
- القتل الرحيم للماوس في غرفة CO2 . ضع الفئران على وسادة جراحية معقمة على لوح الستايروفوم وقم بتثبيت الساقين من خلال وسادات مخلب الفأر. تعقيم الجسم كله من الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول.
- قطع الجلد والعضلات في خط الوسط لفضح تجويف البطن بمقص معقم حاد. عزل الطحال بمقص معقم حاد النهاية ووضعه في مخزن مؤقت للتدفق في أنبوب معقم سعة 15 مل.
- قم بربط الطحال من خلال مصفاة معقمة 70 ميكرومتر في طبق 6 سم مع 3 مل من محلول التدفق. نقل الخلايا من الطبق إلى أنبوب معقم 15 مل وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية واحدة عند 4 درجات مئوية و 400 × غرام لمدة 3 دقائق.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء لتحلل كرات الدم الحمراء لمدة 3 دقائق. أضف 5 مل من محلول التدفق لإيقاف التحلل والطرد المركزي تعليق الخلية عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق.
- ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب معقم سعة 50 مل. الحبيبات ب 5 مل من المخزن المؤقت للتدفق ، واخلطها ، ومررها عبر مصفاة الخلية لجمع الخلايا.
- حدد خلايا AML الأولية (1 درجة) عن طريق تلطيخ الخلايا الطحالية وخلايا نخاع العظم باستخدام الجسم المضاد CD45.1 المضاد للفأر المترافق FITC والكشف عن مقياس التدفق الخلوي. يتم إدخال الخلايا أولا على FSC-A / FSC-H و FSC-A و SSC-A للحصول على مفردات. يتم بوابات CD45.1 + على مخطط FL1 من خلال مقارنتها بالخلايا غير الملوثة.
- بالنسبة للزرع الثانوي (2 درجة) ، أعد تعليق خلايا الطحال CD45.1 AML من متلقي 1 درجة r.o. في PBS (0.1 مل / فأر) وحقنها بأثر رجعي في ذكور الفئران C57BL6 / J CD45.2. بالتوازي مع ذلك ، أعد تعليق خلايا الطحال AML من 1 درجة i.p. المتلقين في PBS (0.5 مل / فأر) وحقنها داخل الصفاق في بروتين مضان أحمر عمره 8-12 أسبوعا (RFP) يعبر عن Ai14TdTomato ذكور الفئران27.
- بالنسبة للزرع الثلاثي (3 درجات) ، أعد تعليق خلايا AML المعزولة من نخاع العظم أو التجويف البريتوني لمتلقي 2 درجة i.p. وحقنها داخل الصفاق في الفئران Ai14TdTomato (RFP +) أو CD45.2 ، على التوالي. إعادة تعليق خلايا AML المعزولة من التجويف البريتوني لمتلقي 2 درجة r.o. وزرعها عن طريق حقن r.o. في فئران Ai14TdTomato (RFP +).
ملاحظة: بالنسبة لزراعة 2 ° ، حددنا تطور المرض في متلقي 2 ° من خلال مراقبة CBC في الدم المحيطي. لمزيد من التأكيد على إنشاء AML ، قمنا بجمع الدم المحيطي الكامل عن طريق ثقب القلب وكذلك نخاع العظام والطحال والكبد. علاوة على ذلك ، قمنا بإجراء غسل i.p. لجمع خلايا i.p. تم الحصول على معلقات خلية واحدة من نخاع العظام والطحال وغسل i.p. كما هو موضح أعلاه. تم تحليل الخلايا من هذه المواقع على مقياس التدفق الخلوي بعد تحلل كرات الدم الحمراء. تم التعرف على خلايا AML كخلايا RFP سلبية (RFP-). بالنسبة لزرع 3 درجات ، قمنا بأخذ عينات من الدم ونخاع العظام والطحال والكبد وخلايا i.p. في نقطة النهاية. تم تحديد خلايا RFP أو CD45.1 + على أنها خلايا AML وفحصها بواسطة قياس التدفق الخلوي. لم يتم إعطاء أي ماء تشعيع أو مضاد حيوي للفئران المتلقية 2 درجة و 3 درجات.
الشكل 1: رسم تخطيطي للتحويل الفيروسي MLL-AF9 في HSCs نخاع العظم والزرع التسلسلي (1 درجة و 2 درجة و 3 درجات). يعتبر فرز السكان الموجبة المزدوجة Sca-1 و c-Kit باستخدام فارز الخلايا الموضح في مربع الظل المنقط اختياريا ، إذا سمحت الموارد بذلك. تم إنشاء الشكل باستخدام BioRender (https://biorender.com/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. غسل داخل الصفاق
- حقن 5 مل من وسائط IMDM غير المكتملة في التجويف البريتوني مرتين لجمع الخلايا في أنبوب معقم سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة و 400 × غرام لمدة 3 دقائق. زرع خلايا AML (4 × 105 خلايا / فأر) من التجويف البريتوني لمتلقي 2 درجة عن طريق حقن i.p. في الفئران المتلقية 3 ° CD45.2 (ن = 3).
7. التحليل النسيجي 28
- عزل الطحال والكبد وعظم الفخذ عن الفئران عند القتل الرحيم. قم بإصلاحها في 5 مل من 10٪ (v / v) من الفورمالين المخزن مؤقتا. أخذ عينات من الطحال والكبد من نظرائهم الأصحاء للمقارنة.
- قم بتضمين الأنسجة الثابتة في البارافين وقطعها إلى أقسام. تلطيخ المقاطع بأصباغ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E).
- احصل على الصور تحت المجهر عند تكبير 20x مثبتا مع برنامج متوافق للتحليل النسيجي.
8. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي (qPCR)
- تحضير الحمض النووي الريبي في كاشف الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- استخدم 0.5-1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتجميع cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- استخدم cDNA لإجراء qPCR باستخدام مجموعة qPCR وتشغيل العينات في نظام qPCR. استخدم مجسات TaqMan التالية التي تم التحقق من صحتها مسبقا: KMT2A (MLL; المرجع التسلسل: NM_001197104(2) ، IDT) 29 و 18S الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (Hs99999901_s1).
- قم بتحميل مضخمات KMT2A و 18S على هلام أغاروز 2٪ لتصور التعبير. احصل على صور في جهاز تصوير مثبت مع البرنامج المتوافق.
9. معالجة البيانات
- تحليل النتائج باستخدام برنامج التحليل الإحصائي وتقديم النتائج كمتوسط ± التسويق عبر محرك البحث. قم بإنشاء أرقام باستخدام أداة الرسام التجاري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مقارنة كفاءة زرع خلايا AML الفئران باستخدام طرق زرع r.o. و i.p.
في السابق ، تم الإبلاغ عن إنشاء 1 ° AML في الفئران المتلقية المزروعة بأثر رجعي مع خلايا LSK المنقولة MLL-AF9 ، وتم إثبات قابلية زرع خلايا AML 1 ° من خلال الزرع التسلسلي30. الدراسة الحالية هي الأولى التي تقيم إمكانية استخدام خلايا لين نخاع العظم لإجراء عملية الزرع. إن وجود زيادة عدد الكريات البيضاء الشاذة (الشكل 2 أ) وزيادة تسلل خلايا اللوكيميا (CD45.1+) في نخاع العظم والطحال (الشكل 2 ب) يدعم جدوى استخدام خلايا نخاع العظم Lin- لتوليد 1 ° AML. لمقارنة فترة تحريض المرض ، تم القتل الرحيم لاثنين من الفئران المانحة لكل متلقي لعزل إما LSK أو Lin- cells. من النتائج ، لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في المتلقين 1 درجة المزروعة بخلايا LSK أو Lin- (الشكل 2C).
أثناء فحص ورم خبيث من 1 ° AML ، تم اكتشاف أن خلايا AML تنتشر في تجويف البطن لمتلقي 1 درجة بواسطة خلايا Lin- المستحثة MLL-AF9 (الشكل التكميلي 1). ألهمت هذه النتيجة الاستكشاف لاختبار ما إذا كان يمكن اعتماد حقن i.p. في توليد AML الفئران ، والتي قد تكون بمثابة طريق جديد وأسهل للزرع. نظرا لنجاح استخدام نخاع العظم Lin- السكان كخلايا مانحة AML ، أكدت البيانات الحالية إنشاء 1 ° AML عن طريق حقن i.p. من خلايا نخاع العظم المحولة MLL-AF9 ، كما يظهر في شكل زيادة عدد الكريات البيضاء (الشكل 2D) ووجود خلايا AML (CD45.1+) في نخاع العظام والطحال من الفئران المتلقية (الشكل 2E). ومع ذلك ، استغرق الزرع عن طريق الحقن i.p. وقتا أطول لتطوير AML من حقن r.o. ، على الرغم من تلقي المتلقين عددا متساويا من الخلايا المانحة (الشكل 2F). إلى جانب ذلك ، يبدو أن الفئران المزروعة بأثر رجعي مع المزيد من الخلايا الملمرة (5.125 × 10 6 خلايا / فأر) في الشكل 2F قد طورت AML بشكل أسرع من تلك المزروعة بعدد أقل من الخلايا الملينة (3.69 × 106 خلايا / فأر) في الشكل 2C.
نظرا لعدم الاتساق المتأصل في وقت الحضانة في متلقي 1 درجة من AML (الشكل 2F) ، جرت محاولة لاختبار i.p. زرع في 2 ° المتلقي. بالنسبة للزرع 2 درجة ، تم إجراء حقن i.p. مع 8 × 105 خلايا AML معزولة من متلقي 1 درجة مزروعة داخل الصفاق. أظهر المتلقون 2 ° زيادة عدد الكريات البيضاء (الشكل 2G) وتضخم الكبد والطحال الكبير (الشكل 2H) في أقل من شهر واحد بعد الزرع ، وهو تقدم واضح من زرع 1 درجة. تمشيا مع هذه الملاحظة ، تم اكتشاف خلايا AML (RFP-) أيضا في الدم المحيطي ونخاع العظام والطحال (الشكل 2I) ، وكذلك في التجويف البريتوني (الشكل التكميلي 1). إلى جانب ذلك ، أكد التعبير عن الجين الورمي KMT2A في الدم والطحال والكبد لمتلقي 2 درجة أيضا الجيل الناجح من AML (الشكل 2J). علاوة على ذلك ، أظهر التحليل النسيجي كذلك تسلل خلايا اللوكيميا في الطحال والكبد للفئران المزروعة داخل الصفاق (الشكل 2K). تؤكد هذه البيانات أن خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) الناتجة عن الحقن القابلة للزرع في متلقي 2 درجة. علاوة على ذلك ، فإن حقن 8 × 10 5 خلايا AML لكل فأر في المتلقين حقق تطعيما مشابها لحقن r.o. من 8 × 105 خلايا AML لكل فأر في المستلمين (الشكل 2L).
واحدة من السمات الرئيسية ل LSCs هي قابلية الزرع التسلسلي. وبالتالي ، لمزيد من التأكد من إنشاء AML في متلقي 2 ° ، حاول هذا البروتوكول التحقق مما إذا كانت خلايا AML من 2 ° i.p. زرع لا تزال قابلة للزرع بشكل متسلسل ، وكذلك جدوى زرع الخلايا الجذعية عن طريق حقن i.p. في زرع 3 درجات. تم حقن خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد المعزولة من نخاع العظم (8 × 10 5 خلايا اللوكيميا / الفأر في 0.5 مل من PBS) أو غسل i.p. (4 × 10 5 خلايا اللوكيميا / الفأر في0.5 مل من PBS) من متلقي 2 درجة في متلقي 3 درجات. على الرغم من زرعها بخلايا مانحة تم إنشاؤها من مصادر مختلفة ، إلا أن الفئران المتلقية 3 درجات أظهرت علامات ابيضاض الدم النقوي الحاد (في غضون 3 و 4 أسابيع لخلايا نخاع العظم وخلايا i.p. ، على التوالي) ، بما في ذلك زيادة عدد الكريات البيضاء (الشكل 3 أ) وتضخم الكبد والطحال (الشكل 3 ب) ، ووجود خلايا اللوكيميا في الدم ونخاع العظام والطحال (الشكل 3 ج) ، والتعبير عن KMT2A (الشكل 3 د) ). أظهرت الملاحظة النسيجية لعظم الفخذ والطحال تسلل خلايا اللوكيميا (الشكل 3E). على سبيل المقارنة ، كان حقن r.o. من خلايا الطحال اللوكيمية (4 × 105 خلايا) من متلقين 2 درجة قادرا أيضا على استيعاب وتطوير AML في متلقي 3 درجات ، يتميز بزيادة عدد الكريات البيضاء (الشكل التكميلي 2A) ، تضخم الكبد والطحال (الشكل التكميلي 2B) ، وتسلل خلايا AML في الدم ونخاع العظام والطحال (الشكل التكميلي 2C).
الزراعة داخل الصفاق فعالة حتى بالنسبة لزراعة خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) بمقدار 3 درجات
بالمقارنة مع عمليات الزرع 2 ° و 3 ° ، يمكن بسهولة التوصل إلى استنتاج مفاده أن زرع 3 درجات (الشكل 3F) تقدم بشكل أسرع بكثير من زرع 2 ° (الشكل 2L) لكل من i.p. و r.o. الحقن. والجدير بالذكر أن حقن 4 × 105 خلايا AML / فأر طور AML في وقت متأخر عن حقن r.o. لنفس العدد من خلايا AML لمدة 6 أيام (الشكل 3F) ، مما قد يشير إلى الوقت المستغرق في الهجرة من التجويف البريتوني إلى مكانة نخاع العظم. ومن المثير للاهتمام ، أن التردد العالي لخلايا اللوكيميا في التجويف البريتوني (الشكل التكميلي S2) في الفئران المزروعة ب 3 درجات يشير إلى أن التجويف البريتوني قد يوفر أيضا مكانا مناسبا للتوسع السريع لخلايا اللوكيميا. إلى جانب ذلك ، فإن وجود خلايا اللوكيميا في التجويف البريتوني لمتلقي 1 درجة و 3 درجات تم زرعهم بأثر رجعي يشير إلى الدوران المتبادل لخلايا اللوكيميا بين التجويف البريتوني ونظام الدم ، مما يبرر زرع i.p. بشكل جماعي ، تؤكد هذه النتائج صحة استخدام حقن i.p. في الزرع التسلسلي ل AML.
الشكل 2: توليد نموذج AML الفئران في زرع 1 درجة و 2 درجة. (أ) تعداد الدم الكامل (CBC ؛ 1 × 10 3 خلايا / ميكرولتر دم) ، WBC ، العدلات (NE) ، الخلايا الليمفاوية (LY) ، وحيدات (MO) ، الحمضات (EO) ، وملف تعريف القاعدية (BA) للفئران المتلقية 1 درجة المزروعة بأثر رجعي مع خلايا لين نخاع العظم المحول MLL-AF9 (5.125 × 106 خلايا / فأر) بواسطة hemavet (ن =3). (ب) تحليل التدفق الخلوي لتردد خلايا AML (CD45.1+) في نخاع العظم والطحال للفئران المتلقية 1 درجة CD45.2 المزروعة بأثر رجعي مع نخاع العظم المحول MLL-AF9 Lin- (5.125 × 106 خلايا / فأر) (ن = 3). (ج) مدة حضانة 1 درجة AML في المتلقين المزروعين بأثر رجعي باستخدام خلايا نخاع العظم المحول MLL-AF9 LSK (3.16 × 105 خلايا / فأر معزولة من متبرعين ، ن = 4) أو خلايا لين (3.69 × 106 خلايا / فأر معزولة من متبرعين ، ن = 3). تلقى كل متلقي خلايا معزولة من متبرعين. (د) تحليل CBC للفئران المتلقية 1 درجة المزروعة داخل الصفاق مع خلايا لين نخاع العظم المحول MLL-AF9 (5.125 × 106 خلايا / فأر) بواسطة hemavet (ن = 4). (ه) تحليل التدفق الخلوي لتردد خلايا AML (CD45.1+) في نخاع العظم والطحال للفئران المتلقية 1 درجة CD45.2 المزروعة داخل الصفاق مع خلايا Lin- نخاع العظم المحول MLL-AF9 (5.125 × 106 خلايا / فأر ، ن = 3). (F) مدة حضانة 1 درجة AML في المتلقين المزروعين بأثر رجعي (ن = 3) أو داخل الصفاق (ن = 3) مع خلايا نخاع العظم المتحولة MLL-AF9. تلقى كل متلقي نفس الكمية من خلايا المتبرع (5.125 × 106 خلايا / فأر). (ز) تحليل CBC لمتلقين 2 درجة مزروعة داخل الصفاق بخلايا AML (8 × 105 خلايا / فأر) معزولة من طحال 1 ° i.p. المتلقين المزروعين بواسطة hemavet (ن = 3). (H) أوزان (ملغ) الطحال والكبد للفئران المتلقية 2 درجة المزروعة داخل الصفاق مع خلايا AML (8 × 105 خلايا / فأر) معزولة من الطحال من 1 ° i.p. المتلقين المزروعين. تمثل المناطق المظللة نطاقات الوزن الطبيعي للطحال والكبد. صورة تمثيلية للطحال والكبد من الفئران المتلقية 2 درجة ونظرائهم الأصحاء. (I) تحليل التدفق الخلوي لتردد خلايا AML (RFP-) في الدم ونخاع العظام والطحال للفئران المتلقية 2 درجة RFP + المزروعة داخل الصفاق مع خلايا AML (8 × 105 خلايا / فأر) معزولة من طحال 1 ° i.p. المتلقين المزروعين (ن = 3). (ي) التعبير الجيني ل KMT2A و 18S المقدم كشريط DNA. تم عزل الحمض النووي الريبي من الدم ونخاع العظام والطحال والكبد للفئران المتلقية 2 درجة المزروعة داخل الصفاق مع خلايا AML (8 × 105 خلايا / فأر) معزولة من طحال 1 ° i.p. المتلقين المزروعين. (K) صور تمثيلية للتغيرات النسيجية في الطحال (اللوحة اليسرى) والكبد (اللوحة اليمنى) لمتلقين 2 درجة مزروعة داخل الصفاق بخلايا AML (8 × 105 خلايا / فأر) معزولة من الطحال من 1 ° i.p. المتلقين المزروعين ونظرائهم الأصحاء. (L) مدة حضانة 2 درجة AML في المتلقين المزروعين بأثر رجعي (4 × 10 5 / فأر ، ن = 9) أو داخل الصفاق (8 × 105 / فأر ، ن = 4) مع خلايا AML معزولة من 1 درجة r.o. و i.p. المتلقين المزروعين ، على التوالي. النتائج تعني ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: زرع خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) بمقدار 3 درجات عن طريق زرع i.p. (A-E) 3 ° RFP + أو CD45.2 الفئران المستلمة. اليسار: حقن خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (8 × 105 خلايا / فأر) من نخاع العظم لمتلقي 2 درجة. اليمين: حقن خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (4 × 105 خلايا / فأر) من التجويف البريتوني (أي المخزون) لمتلقي 2 درجة (ن = 3). (أ) تحليل CBC للفئران المتلقية 3 درجات بواسطة hemavet. (ب) أوزان (ملغ) الطحال والكبد للفئران المتلقية 3 درجات. تمثل المناطق المظللة نطاقات الوزن الطبيعي للطحال والكبد. (ج) تحليل التدفق الخلوي لتردد خلايا AML (يسار: RFP- ؛ يمين: CD45.1+) في الدم ونخاع العظام والطحال للفئران المتلقية 3 درجات. د: التعبير الجيني ل KMT2A و18S المقدمين في صورة شريط DNA (DNA). تم عزل الحمض النووي الريبي من الدم ونخاع العظام والطحال والكبد من الفئران المتلقية 3 درجات. (ه) صور تمثيلية للتغيرات النسيجية في الطحال (اللوحة اليسرى) وعظم الفخذ (اللوحة اليمنى) للفئران المتلقية 3 درجات. (F) مدة حضانة 3 درجات ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) في المتلقين المزروعين بأثر رجعي (4 × 10 5 خلايا / فأر ، ن = 3) أو داخل الصفاق (4 × 105 خلايا / فأر ، ن = 3) مع خلايا AML معزولة من 2 درجة r.o. و i.p. المتلقين المزروعين ، على التوالي. النتائج تعني ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: تحليل التدفق الخلوي لتسلل خلايا AML في التجويف البريتوني. تواتر خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) في الغسل البريتوني لمتلقي 1 درجة تم زرعهم بأثر رجعي (1 ° RO ، n = 2) ، متلقين 2 ° تم زرعهم داخل الصفاق (2 ° IP ، n = 2) ، و 3 ° متلقين تم زرعهم عن طريق حقن i.p. مع خلايا نخاع العظم AML (3 ° BM-IP ، n = 3) وخلايا i.p. AML (3 ° IP-IP ، n = 3) ، بالإضافة إلى 3 ° متلقين تم زرعهم عن طريق حقن طحال AML (3 ° SP-RO ، ن = 3). النتائج تعني ± SEM. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: زرع 3 درجات من خلايا الطحال AML عن طريق حقن r.o. (أ) تحليل CBC للفئران المتلقية 3 درجات المزروعة بأثر رجعي مع خلايا AML (4 × 105 خلايا / فأر) من طحال الفئران المتلقية 2 درجة. (ب) أوزان (ملغ) الطحال والكبد للفئران المتلقية المزروعة بالحجاج 3 درجات. تمثل المناطق المظللة نطاقات الوزن الطبيعي للطحال والكبد. (ج) تواتر خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (RFP-) في الدم ونخاع العظم والطحال للفئران المتلقية المزروعة بالحجاج 3 درجات (ن = 3). النتائج تعني ± SEM. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه الدراسات الموصوفة أعلاه أدلة داعمة على أن زرع الخلايا اللينية يمكن مقارنته بخلايا LSK في توليد 1 درجة من AML الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر البيانات الحالية أيضا أن حقن i.p. هو وسيلة فعالة ومريحة لإنشاء AML الفئران مقارنة بالحقن في الوريد (أو r.o).
بالإضافة إلى خلايا LSK ، تم الإبلاغ عن مجموعات سكانية أخرى مثل السلف المحبب وحيد الخلايا (GMP) ، والسلف اللمفاوي المشترك (CLP) ، والسلف النخاعي المشترك (CMP) كخلايا مانحة في توليد 1 ° MLL-AF9 الناجم عن AML مع فترات حضانة مختلفة31,32 ، على الرغم من عدم وجود مقارنة كمية لاقتراح الخيار الأمثل. في الدراسة الحالية ، لم يكن لدى Lin- و LSK المعزولين من نفس الفئران المانحة أي فرق واضح في توليد 1 ° MLL-AF9 الناجم عن AML ، بالنظر إلى أن الخلايا السلفية النخاعية المحولة (Sca-1-) كانت قادرة على بدء AML33. بالنظر إلى النفقات والوقت اللازمين للفرز القائم على قياس التدفق الخلوي لسكان LSK ، تدعم هذه الدراسات استخدام مجموعة Lin- كخلايا مانحة لزرع 1 درجة. وبالتالي ، فإن الخطوات من 4.19 إلى 4.23 في هذا البروتوكول ليست ضرورية ولكنها اختيارية ، ولا تؤثر على النتيجة النهائية.
من حيث كمية الفئران المانحة في عملية زرع 1 ° ، تمكن متبرع واحد من توفير ~ 1.0 إلى 1.5 × 105 خلايا LSK ، وقام متلقي واحد تم زرعه بهذه الكمية من خلايا LSK بتطوير 1 ° AML في حوالي 4 أشهر. ومع ذلك ، فإن زيادة عدد المتبرعين لبناء خلايا LSK حتى ~ 3 × 105 خلايا لكل مستلم يمكن أن تقصر مدة الحضانة إلى ~ 70 يوما. وبالتالي ، يجب أن يكون المانحان كافيين لتوليد 1 درجة AML بسرعة. ينطبق هذا المبدأ أيضا على الخلايا المتحولة ، حيث ~ 1.0 إلى 2.5 × 106 خلايا لين يمكن عزلها عن كل فأر متبرع. ومع ذلك ، عندما زادت كثافة خلايا المتبرع ، كان وقت استجابة تكوين الكريات البيض أقصر بكثير. يجب أن تؤخذ هذه البيانات في الاعتبار عند تحديد عدد الفئران المانحة في الخطوة 4.1.
بالمقارنة مع حقن r.o. ، استغرق حقن i.p. حوالي ~ 20 يوما إضافيا لتطوير AML الكامل 1 ° ، ولكن تم التغلب على هذا القيد عن طريق زيادة الخلايا المانحة لحقن i.p. على الرغم من هذا الاختلاف الواضح ، أظهرت كلتا الطريقتين معدل تطعيم مماثل (>80٪) في نخاع العظم والطحال عند نقطة النهاية ، مما يشير إلى التطبيق العام لحقن i.p. في زرع 1 درجة في AML. تعد فترة الحضانة الطويلة نسبيا لزراعة 1 درجة ، بالإضافة إلى تطور المرض الذي لا يمكن التنبؤ به من حيث عدم تناسق الكمون في الفئران المتلقية ، قيدا رئيسيا على التجارب الخاضعة للرقابة ، مثل التدخلات الدوائية والدراسات الآلية. وبالتالي ، يوصى باستخدام خلايا اللوكيميا 1 درجة للزرع في عمليات الزرع التسلسلية اللاحقة ، عادة زرع 2 درجة (الشكل 1). نظرا لأنه يمكن إنشاء ما يصل إلى 3 × 108 خلايا لوكيميا في الطحال (و 6 × 107 خلايا في نخاع العظام) من كل مستلم 1 درجة في نقطة النهاية ، وهو ما سيكون كافيا لإجراء زرع 2 ° على أكثر من 300 فأر ، يقترح زرع أكبر عدد ممكن من الخلايا لعدد أقل من المتلقين لتقصير زمن الوصول وزيادة معدل التطعيم لزرع 1 درجة ، وهو أمر مهم للخطوة 4.1 والخطوة 5.2.
نظرا لزمن الوصول المتسق والقصير ، يمكن استخدام زرع 2 درجة في تطبيقات متعددة ، بما في ذلك التجارب في الجسم الحي المذكورة أعلاه. علاوة على ذلك ، i.p. يسهل الحقن أيضا إجراء عملية زرع وفيرة للفنيين عديمي الخبرة. بالمقارنة مع مسار حقن r.o. ، الذي يولد عموما AML في 3 أسابيع ، أي طريقة الحقن استغرق وقتا أطول قليلا (~ 4 أسابيع) مع نفس العدد من الخلايا المانحة لإنشاء AML كامل. على الرغم من أنه أسهل نسبيا وأكثر ملاءمة ، إلا أن زيادة عدد الخلايا المزروعة أو إجراء عملية زرع ثلاثية يمكن أن تسرع أيضا من تطور AML عن طريق الحقن i.p.
باختصار ، فإن القيد الرئيسي لهذه التقنية هو وقت الحضانة الأطول من الحقن في الوريد بنفس الكمية من الخلايا المانحة في كل من عمليات الزرع 1 درجة و 2 درجة. ومع ذلك ، يمكن التغلب عليها بسهولة عن طريق زيادة عدد الخلايا المراد زرعها. بصرف النظر عن المزايا الواضحة ، فإن هذه التقنية لها أيضا بعض التطبيقات الأخرى. على سبيل المثال ، قد تعمل القدرة على استخدام طرق زرع i.p. أيضا على زراعة هذه الخلايا بشكل روتيني دون الحاجة إلى وسائط زراعة باهظة الثمن في المختبر . لتوسيع نطاق تطبيق هذه التقنية في الأورام الخبيثة الدموية الأخرى ، مثل سرطان الدم الليمفاوي وسرطان الدم النخاعي المزمن ، والطعوم الخارجية المشتقة من المريض ، يجب إجراء مزيد من الدراسات في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي التابع لمعهد هاك والمرفق الأساسي لعلم الأنسجة المرضي لمختبر تشخيص الحيوانات ، قسم العلوم البيطرية والطبية الحيوية ، جامعة ولاية بنسلفانيا ، على تقديم الدعم الفني في الوقت المناسب. تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الأمريكي لأبحاث السرطان (KSP) ، وكلية ولاية بنسلفانيا للعلوم الزراعية ، ومعهد ولاية بنسلفانيا للسرطان ، ومشروع USDA-NIFA 4771 ، ورقم الانضمام 00000005 إلى K.S.P. و R.F.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
