Summary
يقدم هذا البحث منهجية الحصول على تكلس الأوعية الدموية وتقييمه عن طريق عزل أورتا الفئران متبوعا باستخراج الحويصلات خارج الخلية المتكلسة لمراقبة إمكانات التمعدن.
Abstract
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم ، وتكلس الأوعية الدموية هو أهم مؤشر على أحداث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا أي علاج أو خيارات علاجية لتكلس الأوعية الدموية. يبدأ التكلس داخل الحويصلات المتخصصة خارج الخلية (EVs) ، والتي تعمل كبؤر نواة عن طريق تجميع أيونات الكالسيوم والفوسفات. يصف هذا البروتوكول طرق الحصول على التكلس وتقييمه في أورتا الفئران وتحليل المركبات الكهربائية المستخرجة المرتبطة بها. أولا ، يتم إجراء تشريح إجمالي للفأر لجمع أي أعضاء ذات صلة ، مثل الكلى والكبد والرئتين. بعد ذلك ، يتم عزل الشريان الأورطي للفأر واستئصاله من جذر الأبهر إلى الشريان الفخذي. ثم يتم تجميع اثنين إلى ثلاثة من الأورتا وتحضينها في محلول هضمي قبل الخضوع للطرد المركزي الفائق لعزل المركبات الكهربائية ذات الأهمية. بعد ذلك ، يتم تحديد إمكانات التمعدن للمركبات الكهربائية من خلال الحضانة في محلول عالي الفوسفات وقياس امتصاص الضوء بطول موجي يبلغ 340 نانومتر. أخيرا ، يتم استخدام الهلاميات المائية الكولاجين لمراقبة تكوين المعادن المتكلسة والنضج الناتج عن المركبات الكهربائية في المختبر.
Introduction
التكلس هو أهم مؤشر على الوفيات والمراضة الناجمة عن أمراض القلب والأوعية الدموية1. يغير التكلس ميكانيكا جدار الشرايين بسبب تراكم معادن الكالسيوم والفوسفات2. في تصلب الشرايين ، يمكن أن يؤدي التكلس إلى تفاقم الإجهاد المحلي ويؤدي إلى تمزق البلاك ، وهو السبب الرئيسي للنوبات القلبية. التكلس الإنسي - الناتج غالبا عن مرض الكلى المزمن - أكثر انتشارا ويؤدي إلى تصلب الشرايين بشكل كبير ، واختلال وظيفي ، والحمل الزائد للقلب 2,3. حاليا ، لا توجد خيارات علاجية لعلاج أو الوقاية من تكلس الأوعية الدموية.
تتبنى خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) نمطا ظاهريا يشبه بانيات العظم وتطلق حويصلات خارج الخلية متكلسة (EVs) تعمل على نواة المعادن الوليدة ، مما يؤدي إلى تكلس4،5،6. تشبه هذه العملية التمعدن الفسيولوجي لبانيات العظم في العظام7. على الرغم من أن نقطة نهاية التمعدن متشابهة في جدار الأوعية الدموية ومصفوفة العظام ، إلا أن الآليات التي تنشأ بها EVs المتكلسة تختلف في النسجين8. هناك العديد من أنواع النماذج التي تستخدم لدراسة تكلس الأوعية الدموية. في المختبر ، تحاكي نماذج زراعة الخلايا الانتقال العظمي ل VSMCs والتكوين المعدني اللاحق مع وسائط متخصصة.
عند دراسة التكلس في الجسم الحي ، يعتمد النموذج المستخدم على نوع التكلس الذي تتم دراسته. غالبا ما تستخدم نماذج الفئران المفرطة شحميات الدم لدراسة تكلس تصلب الشرايين ، والذي يبدو أكثر تركيزا داخل اللويحات الغنية بالدهون9. في المقابل ، يكون التكلس الإنسي أكثر انتشارا في جميع أنحاء الأوعية الدموية وغالبا ما تتم دراسته باستخدام نماذج أمراض الكلى المزمنة التي تستخدم نظام غذائي غني بالأدينين للحث على الفشل الكلوي أو التقنيات الجراحية لإزالة أجزاء كبيرة من الكلى10,11. استخدمت النماذج العدوانية لتكلس الأوعية الدموية مزيجا من نماذج أمراض الكلى المفرطة في شحميات الدموالمزمنة 12. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتقييم تكلس الأوعية الدموية في أورتا الفئران لكل من التكلس الإنسي وتصلب الشرايين ، واستخراج EVs من جدار الأبهر ، ومراقبة إمكانات التمعدن في EVs التي تم الحصول عليها من نماذج زراعة الخلايا في المختبر. يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذه الإجراءات في التحليلات الميكانيكية لتكلس الأوعية الدموية وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على العمل في الجسم الحي والإشراف عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة فلوريدا الدولية ويتوافق مع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) الحالية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، لا يختلف الإجراء اعتمادا على سلالة الماوس ووزنه وعمره وجنسه. قد يغير نوع التكلس الذي تتم دراسته والوجبات الغذائية والعلاجات من طول الدراسة ووزن الفأر المستخدم وقد يعتمد على سلالة وجنس معين من الفأر المستخدم في الدراسة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام كل من ذكور وإناث الفئران C57BL / 6J ، وتم إطعامهم نظاما غذائيا للتكلس. تم التضحية بالفئران بين 20 أسبوعا و 24 أسبوعا من العمر.
1. عزل واستئصال الشريان الأورطي
- علامات الفلورسنت
- قبل ثمانية وأربعين ساعة من القتل الرحيم ، قم بحقن الفئران ب 20 ميكرومتر OsteoSense 680 ، وهو عامل تصوير فلوري ، بالجرعة الموصى بها البالغة 100 ميكرولتر لكل 25 جم عن طريق الحقن في الوريد.
- تحت غطاء الدخان ، ضع لوح الستايروفوم بأربعة دبابيس على شكل حرف T ، ودلو مبطن بمنشفة ورقية ، وأنبوب سعة 50 مل محشو بمنشفة ورقية ، وأنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وأدوات تشريح (انظر جدول المواد) ، والإيثانول في زجاجة رذاذ. ضع أكواب مع برنامج تلفزيوني على الجليد.
- سحب الدم
- أضف 2 مل من الأيزوفلوران في أنبوب مخروطي سعة 50 مل محشو بمنشفة ورقية. ضع الأنبوب في الدلو وأغلقه بغطاءه.
تنبيه: يجب التعامل مع الإيزوفلوران في مكان جيد التهوية مع عدم إعادة تدوير هواء العادم بسبب سمية التعرض على المدى القصير. - انقل ماوس واحد إلى الحاوية في كل مرة. بمجرد التخدير ، ضع الماوس على المنشفة الورقية في الوضع الظهري. أمسك الماوس براحة اليد غير المهيمنة ، ضع الأذنين للخلف باستخدام إصبع الإبهام والمؤشر.
- باستخدام ملاقط ، استئص إحدى العينين. أمسك الماوس فوق الأنبوب سعة 1.5 مل لبدء جمع الدم ، حيث يجب جمع 1 مل من الدم. بمجرد توقف الدم عن التصريف ، ضع الماوس مرة أخرى في الدلو لمزيد من التخدير.
- أضف 2 مل من الأيزوفلوران في أنبوب مخروطي سعة 50 مل محشو بمنشفة ورقية. ضع الأنبوب في الدلو وأغلقه بغطاءه.
- القتل الرحيم
- ضع منشفة ورقية على حصيرة التشريح. بمجرد تخدير الماوس ، ضع الماوس على السجادة في وضع ضعيف. ثبت الماوس في وضع الاستلقاء باستخدام دبوس على شكل حرف T للضغط باستمرار على كل طرف.
- رش أسفل بطن الماوس بالكحول. باستخدام الملقط ، ارفع الجلد في منطقة الصدر. باستخدام المقص ، قم بقطع الخط الإنسي في التجويف الصدري. بمجرد قطع القص من المركز ، قم بقطع الحجاب الحاجز على جانبي القفص الصدري.
- إذا لزم الأمر ، قم بقطع الجزء الأمامي من القفص الصدري لكشف القلب والرئتين.
- إزالة الأعضاء
- باستخدام الملقط ، ارفع الجلد وقم بعمل شق أسفل خط الوسط. إزالة أي جلد أو دهون زائدة. إزالة الأعضاء التناسلية والمثانة ، وكذلك أي دهون خارج خط الوسط.
- انقل أعضاء الجهاز الهضمي (GI) إلى الجانب الأيمن ، واتبع الأمعاء في خط الوسط. بمجرد العثور عليها ، ارفع خط الوسط ، واستأصل الجهاز الهضمي حتى المعدة.
- استئصال الكلى عن طريق رفعها بعيدا عن خط الوسط. قطع بالقرب من الكلى قدر الإمكان.
- بعد ذلك ، ابدأ في إزالة الكبد عن طريق رفع الفصوص والقطع بعيدا عن خط الوسط.
- قم ببث القلب والشريان الأورطي. باستخدام حقنة سعة 10 مل ، قم بحقن برنامج تلفزيوني بارد في البطين الأيمن. انتظر حتى تنتفخ الرئتان وتتحول إلى اللون الأبيض. إزالة الرئتين ، وكذلك أي الحجاب الحاجز الزائد أو القفص الصدري.
- إزالة العظام
- افتح مقصا عريضا ، وضعه في المنطقة السفلية من الماوس فوق الذيل. قطع لأسفل ، والبدء في رفع العمود الفقري من الجلد. إزالة الدهون من جانبي خط الوسط. بمجرد فصل الجلد ، قم باستئصال العمود الفقري والأعضاء السليمة عن طريق القطع فوق القلب مباشرة. في حالة النقل إلى مجسمة ، ضع العمود الفقري والأعضاء السليمة في دورق من PBS في دلو الثلج.
- انقل العمود الفقري والأعضاء إلى طبق التشريح. ملء مع برنامج تلفزيوني بارد الجليد. تثبيت أسفل العمود الفقري والقفص الصدري باستخدام الإبر.
- تحت مجهر التشريح ، استخدم الملقط لرفع القلب بعناية ، وابدأ في القطع فوق العمود الفقري وتحت الشريان الأورطي. استمر في هذا حتى يتم الوصول إلى الجزء السفلي من العمود الفقري. قم بإزالة العمود الفقري من طبق التشريح ، وقم بتثبيت القلب وأي دهون أو عضلات غريبة.
- التشريح المجهري
- بدءا من المنطقة الواقعة أسفل القلب مباشرة، حدد التراكيب الأنبوبية الثلاثة: المريء والوريد الأجوف والشريان الأورطي. قم بإزالة المريء والوريد الأجوف للحصول على مجال بصري واضح للشريان الأورطي.
- باستخدام ملقط التشريح المجهري والمقص ، ابدأ في رفع الأنسجة الدهنية وقطعها بالقرب من الشريان الأورطي قدر الإمكان. تأكد من عدم قطع الشريان الأورطي. استمر في ذلك أسفل الخط الإنسي حتى يتم الكشف عن كل الشريان الأورطي وكذلك الشرايين الفخذية.
- في القلب ، قم بإزالة جميع الأنسجة الدهنية ، وفضح الفروع الثلاثة في قوس الأبهر. قم بإزالة جذر الأبهر من البطين الأيسر عن طريق إدخال مقص التشريح المجهري في البطين الأيسر وقطع العضلات المحيطة بالشريان الأورطي.
- بمجرد عزل الشريان الأورطي وتنظيفه ، قم بتصوير الشريان الأورطي باستخدام ماسح ضوئي قريب من الأشعة تحت الحمراء لتصور تكلس الأوعية الدموية.
- استخدم البرنامج النصي MATLAB المخصص (الملف التكميلي 1) لتحديد الإشارة الإجمالية لمقتفي الكالسيوم ، والتي يتم تطبيعها إلى إجمالي منطقة الشريان الأورطي الممسوحة ضوئيا. يعمل البرنامج النصي MATLAB باستخدام الوظيفة الإضافية لصندوق أدوات المعلوماتية الحيوية. يتم توجيه MATLAB أولا إلى موقع ملفات TIFF من المسح بالأشعة تحت الحمراء القريبة للشريان الأورطي ، ثم يتم فتح الملفات الفردية ، ويتم استخراج قيم كثافة البكسل من ملفات TIFF.
- بمجرد تقديم الصورة للمستخدم مع خريطة ملونة ، حدد الشريان الأورطي مع أكبر تكلس كأقصى مقياس.
- عندما يسأل MATLAB "كم عدد العينات الموجودة في الصورة؟" في نافذة الأوامر ، أدخل عدد الأبهر في الصورة الحالية ، وحدد كل شريان أورطي واحدا تلو الآخر. بمجرد اختيار الشريان الأورطي ، سيقوم MATLAB بإنشاء صورة ثنائية مع قناع للمساحة الكلية للشريان الأورطي وصورة ثنائية أخرى مع قناع للمنطقة المتكلسة من الشريان الأورطي. ثم يتم استخدام القيم من هذه الصور المقنعة لتحديد إجمالي المساحة المتكلسة ، والمساحة الكلية للشريان الأورطي ، والنسبة المئوية للمساحة الموجبة للتكلس ، ومتوسط شدة المنطقة المتكلسة.
- لتحديد الشريان الأورطي ، قم بعمل مربع حول الشريان الأورطي محل الاهتمام على أحدث شكل على الشاشة عن طريق تحديد أربع زوايا بنقرة واحدة يسارية وإنشاء مربع حول الصورة. لإغلاق المربع ، انقر نقرا مزدوجا فوق الزاوية الأولى.
ملاحظة: قد تختلف العتبة اعتمادا على نموذج التكلس المستخدم. الأمر متروك للمستخدم لتحديد القيمة التي تحدد إشارة إيجابية لتكلس الأوعية الدموية. بمجرد تعيين الحد الأدنى للتجربة ، يجب أن يظل كما هو طوال مدة التجربة.
- بمجرد استخراج البيانات الكمية ، قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام اختبار Tukey اللاحق لإظهار الأهمية بين المجموعات.
2. عزل واستخراج المركبات الكهربائية من الأورتاس
ملاحظة: بمجرد عزل الأبهر وإزالته ، يمكن استخراج EVs من الأنسجة. باستخدام محلول هضمي ودورات طرد مركزي متعددة ، يمكن جمع المركبات الكهربائية واستخدامها للعديد من التقنيات المختلفة ، بما في ذلك مقايسات التكلس ، والرحلان الكهربائي للهلام ، والنشاف المناعي13. بروتوكول عزل واستخراج المركبات الكهربائية هو كما يلي:
- مباشرة بعد مسح الشريان الأورطي ، قم بتجميع اثنين إلى ثلاثة من الأورتا لإنتاج تركيز كاف من البروتين.
- تحضير محلول هضمي يحتوي على 0.25 م سكروز ، 0.12 م كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 0.01 م كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 0.02 م تريس هيدروكلوريد ، و 600 وحدة / مل كولاجيناز13.
- احتضان اثنين إلى ثلاثة من الأورتا المجمعة في 1.5 مل من محلول الهضم لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. اجمع الحل. جهاز طرد مركزي الحل في 1000 × غرام لمدة 15 دقيقة لإزالة حطام الخلية.
- جهاز طرد مركزي للطافد لمدة 30 دقيقة إضافية عند 33000 × جم لإزالة الحويصلات الدقيقة. جمع وتقييم المادة الطافية لإمكانية التكلس (انظر القسم 3).
ملاحظة: اتبع الخطوات اللاحقة إذا كان سيتم إجراء الرحلان الكهربائي للهلام والنشاف المناعي للبروتين في المركبات الكهربائية. - أجهزة الطرد المركزي الفائقة الطافية عند 100000 × جم لمدة 1 ساعة لعزل المركبات الكهربائية ذات الأهمية.
- أثناء خضوع المادة الطافية للطرد المركزي الفائق ، قم بإعداد محلول RIPA والمخزن المؤقت للاستخراج (انظر جدول المواد) عن طريق إضافة مثبط الأنزيم البروتيني والدوامة حتى يذوب.
- بمجرد اكتمال الطرد المركزي الفائق ، قم بنضح المادة الطافية ، تاركا الحبيبات التي تحتوي على المركبات الكهربائية. الحبيبات في خليط تحلل RIPA المحضر ومثبط الأنزيم البروتيني. العينات جاهزة للهلام الكهربائي والنشاف الغربي.
3. تقييم إمكانات التكلس للحويصلات خارج الخلية مع امتصاص تشتت الضوء
ملاحظة: لقياس التكوين المعدني في الوقت الفعلي للمركبات الكهربائية ، استخدمنا مقايسة تم تطويرها في الأصل لدراسة تكوين المعادن من EVs الغضروفية للوحة النمو من زراعة الخلايا14. نظرا لأن ترسب فوسفات الكالسيوم هو السمة المميزة للتكلس ، فإن الزيادة في امتصاص تشتت الضوء نتيجة تكوين مركب فوسفات الكالسيوم تدل على إمكانية التكلس14. في المختبر نماذج VSMC ملائمة لقياس إمكانات التكلس للمركبات الكهربائية. في هذه التقنية ، يمكن لقارئ الألواح المزود بمرشح طول موجي قصير تحديد تكلس المركبات الكهربائية في المختبر . يتم تسجيل قراءة الامتصاص عند 340 نانومتر ، ويشير الامتصاص الأعلى إلى تكوين المزيد من فوسفات الكالسيوم المعدني. بروتوكول مقايسة امتصاص تشتت الضوء هو كما يلي:
- أجهزة الطرد المركزي الوسط المجمعة المشروطة من VSMCs عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة حطام الخلية14.
- قم بطرد المادة الطافية عند 33000 × جم لمدة 30 دقيقة ، واجمع المادة الطافية ، وانقلها إلى أنبوب جديد.
ملاحظة: يمكن تأكيد وجود EVs في المادة الطافية المجمعة من خلال تشتت الضوء الديناميكي (DLS) أو تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) - قم بإعداد محلول معقم أحادي القاعدة من فوسفات الصوديوم 300 مللي متر (NaH2PO4). قم بتصفية المحلول لضمان الظروف المعقمة إذا لزم الأمر.
- أضف 1٪ (v / v) من 300 mM NaH2PO4 إلى عينات EV ، وقم بامتصاص المحلول برفق لخلطه جيدا. انقل 200 ميكرولتر من محلول الخليط إلى صفيحة 96 بئرا. احتضان الصفيحة المكونة من 96 بئرا في قارئ الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
- اضبط قارئ اللوحة لتسجيل الامتصاص بطول موجي 340 نانومتر كل 1 دقيقة.
4. تقييم تكوين المعادن التكلس للحويصلات خارج الخلية مع الهلاميات المائية الكولاجين
ملاحظة: لوحظ تجميع EVs وتشكيل التكلسات الدقيقة من خلال الهلاميات المائية الكولاجين. تعمل هذه الهلاميات المائية كسقالة تحاكي كثافة الكولاجين التي لوحظت في الجسم الحي15. هذا يدل على تأثير الكولاجين على نمو التكلس. بروتوكول تقييم التكوين المعدني للمركبات الكهربائية في الهلاميات المائية هو كما يلي:
- اليوم 1
- تحضير محلول كولاجين 2.5 مجم / مل في DMEM. أضف ببطء 5 M هيدروكسيد الصوديوم إلى خليط الكولاجين / DMEM حتى يتغير اللون إلى اللون الأحمر. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول هو 7 تقريبا.
ملاحظة: إذا تحول الحل إلى اللون الأرجواني وأصبح أساسيا جدا، فأعد تشغيل العملية. - ماصة 300 ميكرولتر من محلول الكولاجين 2.5 مجم / مل مع درجة حموضة 7 في كل بئر من زجاج حجرة 8 آبار. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 الرطوبة التي تسيطر عليها لمدة 72 ساعة.
- تحضير محلول كولاجين 2.5 مجم / مل في DMEM. أضف ببطء 5 M هيدروكسيد الصوديوم إلى خليط الكولاجين / DMEM حتى يتغير اللون إلى اللون الأحمر. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول هو 7 تقريبا.
- اليوم 4
- أضف 300 ميكرولتر من DMEM كعنصر تحكم في الآبار.
- أضف 300 ميكرولتر من عينات وسط المركبات الكهربائية التي تم جمعها مسبقا إلى الآبار المتبقية.
- احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 تسيطر عليها الرطوبة لمدة 6 أيام.
- اليوم 10
- تحضير 2.5 ميكرولتر من Osteosense 680EX مع 22.5 ميكرولتر من DMEM.
- ماصة 2.5 ميكرولتر من خليط Osteosense و DMEM في كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 الرطوبة التي تسيطر عليها لمدة 24 ساعة.
- اليوم 11
- تخيل الهلاميات المائية مع المرشحات المناسبة لمضان Osteosense. صورها من خلال الجزء السفلي من غرفة الغطاء الزجاجي باستخدام مجهر مقلوب أو من الأعلى بهدف مسافة عمل طويلة.
- قم بتقييم عدد التكلسات وحجم التكلس في الصور المجمعة باستخدام خيارات تحليل الجسيمات المتوفرة في ImageJ.
- استخدم الصورة | ضبط | أمر العتبة لإضفاء الطابع البيني على الصور بحيث تظهر إشارة Osteosense فقط باللون الأبيض. استخدم التحليل | أمر تحليل الجسيمات للحصول على معلومات لكل تكلس في الصورة. تأكد من استخدام نفس معلمات العتبة لكل صورة تم تحليلها من أجل التناسق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بمجرد استخراج الأبهر ، يظهر التصوير باستخدام ماسح ضوئي قريب من الأشعة تحت الحمراء تمثيلا مرئيا للشريان الأورطي بالإضافة إلى تكلس الأوعية الدموية (الشكل 1). تمثل قيم كثافة البكسل داخل الصورة الفلورية الممسوحة ضوئيا توزيع التكلس وتظهر هنا باستخدام خريطة حرارية ملونة. تتضمن طرق القياس الكمي تحديد عتبة موجبة والإبلاغ عن النسبة المئوية لمساحة الشريان الأورطي بقيم أكبر من قيمة العتبة هذه و / أو الإبلاغ عن متوسط شدة مضان البكسل داخل الشريان الأورطي. كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3 ، تم استخدام خلايا العضلات الملساء للشريان التاجي البشري الأولي المتاحة تجاريا لتوضيح التقنيات. يمكن استخدام الوسائط المكيفة من VSMCs لقياس إمكانات التكلس للمركبات الكهربائية. يتم قياس تكوين المعادن بمرور الوقت من خلال امتصاص الضوء عند 480 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة (الشكل 2 أ ، ب). كشف الانحدار الخطي خلال المرحلة السريعة من التمعدن أن زيادة الامتصاص حدثت أسرع بمقدار 1.5 مرة في العينة المؤيدة للتكلس مقارنة بعينة التحكم. داخل الهلاميات المائية الكولاجين ، يمكن تصور رواسب الكالسيوم عن طريق تصوير مضان Osteosense (الشكل 3A ، B). تظهر التكلسات الفردية كمناطق إيجابية لإحساس العظام داخل الهيدروجيل.
الشكل 1: الأبهر المصور بعد التشريح. بعد المسح ، يمكن تصور التكلس داخل أورتا الفئران C57BL / 6J. لوحظت إشارة Osteosense أعلى في جميع أنحاء الشريان الأورطي للفأر المصاب بمرض الكلى المزمن (أقصى اليسار) مقارنة باثنين من الأبهر من الفئران الضابطة (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: امتصاص المعادن لقياس إمكانات تكلس EV. (أ، ب) يظهر تشتت الضوء عند 340 نانومتر امتصاصا أعلى في الوسط المكيف الذي تم الحصول عليه من VSMCs المستزرعة في وسط مؤيد للتكلس (الخط الداكن) مقارنة بوسط التحكم العادي (الخط الرمادي الفاتح). (ج) يظهر الانحدار الخطي لأول 20 دقيقة من الفحص تكوينا أسرع للمعادن في العينة المؤيدة للتكلس. الاختصارات: EV = حويصلة خارج الخلية. VSMCs = خلايا العضلات الملساء الوعائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تكوين المعادن من الوسائط المكيفة في الهلاميات المائية الكولاجينية. تم وضع الوسائط المكيفة من الخلايا الضابطة (A) والخلايا (B) المزروعة لمدة 21 يوما في وسط مؤيد للتكلس في الهلاميات المائية الكولاجينية. يظهر تصوير مضان Osteosense شديد الاحمرار (أ) إشارة ضئيلة في عينة التحكم و (ب) وجود معادن تشكلت من الوسط المكيف للخلايا المزروعة في ظروف مؤيدة للتكلس. مقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: برنامج نصي MATLAB مخصص لتحديد الإشارة الإجمالية لمقتفي الكالسيوم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عند تنفيذ البروتوكول ، من المهم ملاحظة الخطوات الحاسمة للحصول على نتائج ناجحة. أثناء عزل الشريان الأورطي للفأر ، من الضروري إجراء التروية بشكل صحيح. عند حقن برنامج تلفزيوني ، يجب الحرص على عدم ثقب البطين الأيمن. هذا من شأنه أن يتسبب في تسرب السائل مباشرة من البطين ويفشل في الدوران عبر الرئتين ، تاركا الدم داخل الشريان الأورطي. بمجرد إجراء التروية بشكل صحيح وبدء التشريح المجهري ، يجب إزالة جميع الأنسجة الدهنية والدهنية من الشريان الأورطي قبل الانتهاء والمسح. ستؤدي الدهون المتبقية إلى ظهور الشريان الأورطي بشكل أكبر عند تطبيع البيانات إلى الحجم الكلي للأنسجة.
نظرا للحجم المحدود لشريان الأورطي للفأر أثناء التشريح ، فمن الشائع اختراق الشريان الأورطي أو قطعه إلى النصف. في حالة حدوث ذلك ، يوصى بمواصلة التشريح كالمعتاد. يمكن وضع قطع الشريان الأورطي بالقرب من بعضها البعض للتصوير. يمكن أيضا وضع الشريان الأورطي في محلول الهضم على شكل قطع لعزل EV. عند بدء عزل المركبات الكهربائية ، هناك حاجة إلى العديد من الأبهر لإنتاج بروتين كاف. هذا القيد يعني أنه يجب تشريح المزيد من الفئران لجمع الكمية المناسبة من الأنسجة لتحقيق نتائج موثوقة.
في الطريقة الموضحة ، نوضح كيفية قياس إمكانات التمعدن مباشرة من المركبات الكهربائية في الوسائط المكيفة من VSMCs في الثقافة. بروتوكول تشتت الضوء هو طريقة بسيطة تستخدم لقياس التكوين المعدني للمركبات الكهربائية في الوقت الفعلي14. يوفر هذا نظرة ثاقبة للفترة التي يحدث فيها التكلس داخل المركبات الكهربائية. توفر الهلاميات المائية الكولاجين منصة لتوجيه تجميع وتكلس المركبات الكهربائية للتحليل ثلاثي الأبعاد للتمعدن15. حتى الآن ، أجرينا هذه التحليلات فقط مع المركبات الكهربائية من الدراسات المختبرية . ومع ذلك ، في الدراسات المستقبلية ، سنسعى إلى تكييف هذه الأساليب لتحليل إمكانات التمعدن للمركبات الكهربائية المعزولة من الشريان الأورطي للفئران.
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم ، مع كون التكلس أهم مؤشر على المراضة والوفيات. من خلال تحديد الآليات التي تؤدي من خلالها المركبات الكهربائية إلى التكلس ، يمكن إجراء دراسات مستقبلية تركز على التحكم في نمو المعادن كاستراتيجية علاجية عن طريق تثبيط المسارات التي تؤدي إلى إطلاق المركبات الكهربائية المتكلسة ، وكذلك من خلال التفاعل المباشر مع عملية التمعدن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) (1R01HL160740 و 5 T32GM132054-04) ومؤسسة فلوريدا لأبحاث القلب. نود أن نشكر كاساندرا غوميز على مساعدتها في تصنيع وتصوير الهلاميات المائية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
- Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
- Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
- Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
- Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
- New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
- Aikawa, E., Hutcheson, J. D. Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).
- Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
- Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
- El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
- Veseli, B. E., et al.
- Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
- Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).
