Summary
В данной работе представлена методика получения и оценки кальцификации сосудов путем выделения мышиных аорт с последующим извлечением кальцинированных внеклеточных везикул для наблюдения за потенциалом минерализации.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти в мире, а кальцификация сосудов является наиболее значимым предиктором сердечно-сосудистых событий; Тем не менее, в настоящее время нет лечения или терапевтических вариантов кальцификации сосудов. Кальцификация начинается в специализированных внеклеточных везикулах (ВВ), которые служат очагами зарождения путем агрегации ионов кальция и фосфата. В этом протоколе описываются методы получения и оценки кальцификации в мышиных аортах и анализа связанных с ними извлеченных ВВ. Во-первых, грубое вскрытие мыши выполняется для сбора любых соответствующих органов, таких как почки, печень и легкие. Затем мышиная аорта изолируется и иссекается от корня аорты до бедренной артерии. Затем две-три аорты объединяют и инкубируют в пищеварительном растворе перед ультрацентрифугированием для выделения интересующих ВВ. Затем потенциал минерализации электромобилей определяют путем инкубации в растворе с высоким содержанием фосфатов и измерения поглощения света на длине волны 340 нм. Наконец, коллагеновые гидрогели используются для наблюдения за образованием и созреванием кальцинированных минералов, производимых EV in vitro.
Introduction
Кальцификация является наиболее значимым предиктором смертности и заболеваемости сердечно-сосудистыми заболеваниями1. Кальцификация изменяет механику артериальной стенки из-за накопления кальциевых и фосфатных минералов2. При атеросклерозе кальцификация может усугубить местный стресс и привести к разрыву бляшек, что является основной причиной сердечных приступов. Медиальная кальцификация, часто возникающая в результате хронического заболевания почек, более распространена и приводит к значительной артериальной жесткости, дисфункции и перегрузке сердца 2,3. В настоящее время не существует терапевтических вариантов лечения или профилактики кальцификации сосудов.
Сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC) принимают остеобластоподобный фенотип и высвобождают кальцифицирующие внеклеточные везикулы (EV), которые зарождают зарождающиеся минералы, тем самым вызывая кальцификацию 4,5,6. Этот процесс напоминает физиологическую минерализацию остеобластов в кости7. Хотя конечная точка минерализации одинакова в сосудистой стенке и костном матриксе, механизмы, с помощью которых возникают кальцифицирующие EV, различаются в двух тканях8. Существует множество типов моделей, которые используются для изучения кальцификации сосудов. Модели клеточных культур in vitro имитируют остеогенный переход VSMC и последующее образование минералов со специализированными средами.
При изучении кальцификации in vivo используемая модель зависит от типа изучаемой кальцификации. Модели гиперлипидемических мышей часто используются для изучения атеросклеротической кальцификации, которая проявляется более фокальной в богатых липидами бляшках9. Напротив, медиальная кальцификация более распространена по всей сосудистой сети и часто изучается с использованием моделей хронической болезни почек, в которых используется режим диеты, богатый аденином, чтобы вызвать почечную недостаточность, или хирургические методы удаления значительных частей почек10,11. Агрессивные модели кальцификации сосудов использовали комбинацию моделей как гиперлипидемической, так и хронической болезни почек12. Этот протокол предоставляет метод оценки кальцификации сосудов в мышиных аортах как для медиальной, так и для атеросклеротической кальцификации, извлечения EV из стенки аорты и наблюдения за потенциалом минерализации в EV, полученных из моделей клеточных культур in vitro. Будущие исследования могут использовать эти процедуры в механистическом анализе кальцификации сосудов и для оценки потенциальных терапевтических вмешательств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Работа in vivo была одобрена и контролировалась Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Международном университете Флориды и соответствовала текущим рекомендациям Национальных институтов здравоохранения (NIH). Для этого протокола процедура не отличается в зависимости от штамма, веса, возраста и пола мыши. Тип изучаемой кальцификации, диеты и методы лечения могут изменять продолжительность исследования и вес используемой мыши и могут зависеть от конкретного штамма и пола мыши, используемой в исследовании. Для этого протокола использовались как самцы, так и самки мышей C57BL / 6J, и их кормили кальцификационной диетой. Мыши были принесены в жертву в возрасте от 20 до 24 недель.
1. Изоляция и иссечение аорты
- Флуоресцентные маркеры
- За сорок восемь часов до эвтаназии введите мышам 20 мкМ OsteoSense 680, флуоресцентный агент визуализации, в рекомендуемой дозе 100 мкл на 25 г посредством внутривенной инъекции.
- Под вытяжной шкаф поместите доску из пенополистирола с четырьмя Т-образными штифтами, ведро, выстланное бумажным полотенцем, пробирку объемом 50 мл, набитую бумажным полотенцем, микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл, инструменты для вскрытия (см. Таблицу материалов) и этанол в пульверизаторе. Поставьте стаканы с PBS на лед.
- Забор крови
- Добавьте 2 мл изофлурана в коническую пробирку объемом 50 мл, набитую бумажным полотенцем. Поместите трубку в ведро и закройте ее крышкой.
ВНИМАНИЕ: Изофлуран следует обрабатывать в хорошо проветриваемом помещении без рециркуляции отработанного воздуха из-за токсичности кратковременного воздействия. - Переносите по одной мыши в ведро за раз. После успокоения положите мышь на бумажное полотенце в спинном положении. Удерживая мышь ладонью недоминантной руки, отведите уши назад с помощью большого и указательного пальцев.
- С помощью пинцета иссеките один из глазков. Держите мышь над пробиркой объемом 1,5 мл, чтобы начать сбор крови, во время которого следует собрать 1 мл крови. Как только кровь перестанет стекать, поместите мышь обратно в ведро для дальнейшего успокоения.
- Добавьте 2 мл изофлурана в коническую пробирку объемом 50 мл, набитую бумажным полотенцем. Поместите трубку в ведро и закройте ее крышкой.
- Эвтаназия
- Положите бумажное полотенце на коврик для рассечения. Как только мышь успокоится, положите мышь на коврик в положение лежа на спине. Закрепите мышь в положении лежа на спине с помощью Т-образного штифта, чтобы удерживать каждую конечность.
- Сбрызните живот мыши спиртом. С помощью пинцета поднимите кожу в области груди. Ножницами срежьте медиальную линию в грудную полость. После того, как грудина была срезана по центру, разрежьте диафрагму по обе стороны от грудной клетки.
- При необходимости отрежьте лобную часть грудной клетки, чтобы обнажить сердце и легкие.
- Удаление органа
- С помощью пинцета приподнимите кожу и сделайте надрез по средней линии. Удалите лишнюю кожу или жир. Удалите репродуктивные органы и мочевой пузырь, а также любой жир за пределами средней линии.
- Переместите органы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) на правую сторону и следуйте за кишечником по средней линии. После обнаружения поднимите среднюю линию и иссеките желудочно-кишечный тракт до живота.
- Иссекайте почки, отрывая их от средней линии. Разрежьте как можно ближе к почкам.
- Далее приступают к удалению печени, приподнимая доли и отрезая от средней линии.
- Перфузия сердца и аорты. Используя шприц объемом 10 мл, введите холодный PBS в правый желудочек. Подождите, пока легкие надуются и побелеют. Удалите легкие, а также любую лишнюю диафрагму или грудную клетку.
- Удаление кости
- Широко раскройте ножницы и поместите их в нижнюю часть мыши над хвостом. Срежьте вниз и начните отрывать позвоночник от кожи. Удалите жир с боков средней линии. Как только кожа отслоится, иссеките позвоночник и неповрежденные органы, разрезав прямо над сердцем. При транспортировке к стереоскопу поместите позвоночник и неповрежденные органы в стакан PBS в ведре со льдом.
- Переместите позвоночник и органы в рассекающую посуду. Залейте ледяным PBS. Придавите позвоночник и грудную клетку с помощью игл.
- Под микроскопом для вскрытия используйте пинцет, чтобы осторожно поднять сердце, и начните разрезать над позвоночником и под аортой. Продолжайте это до тех пор, пока не достигнете нижней части позвоночника. Удалите позвоночник из рассекающей чашки и прижмите сердце и любой посторонний жир или мышцу.
- Микродиссекция
- Начиная с области прямо под сердцем, определите три трубчатые структуры: пищевод, полую вену и аорту. Удалите пищевод и полую вену, чтобы иметь четкое поле зрения аорты.
- Используя щипцы и ножницы для микродиссекции, начните поднимать жировую ткань и резать как можно ближе к аорте. Следите за тем, чтобы не перерезать аорту. Продолжайте это вниз по медиальной линии, пока не обнажится вся аорта, а также бедренные артерии.
- В сердце удаляют всю жировую ткань, обнажая три ветви у дуги аорты. Удалите корень аорты из левого желудочка, вставив ножницы для микродиссекции в левый желудочек и разрезав мышцу, окружающую аорту.
- После того, как аорта изолирована и очищена, визуализируйте аорту с помощью сканера ближнего инфракрасного диапазона, чтобы визуализировать кальцификацию сосудов.
- Используйте пользовательский сценарий MATLAB (дополнительный файл 1) для количественной оценки общего сигнала кальциевого индикатора, который нормализуется к общей просканированной площади аорты. Сценарий MATLAB функционирует с помощью надстройки набора инструментов Bioinformatics. MATLAB сначала направляется к расположению файлов TIFF из ближнего инфракрасного сканирования аорты, затем открываются отдельные файлы, а значения интенсивности пикселей извлекаются из файлов TIFF.
- После того, как изображение будет представлено пользователю с помощью цветовой карты, выберите аорту с наибольшей кальцификацией в качестве максимума масштаба.
- Когда MATLAB спрашивает «Сколько образцов на изображении?» в командном окне, введите количество аорт на текущем изображении и выберите каждую аорту одну за другой. После выбора аорты MATLAB создаст двоичное изображение с маской общей площади аорты и еще одно двоичное изображение с маской кальцинированной области аорты. Значения из этих замаскированных изображений затем используются для определения общей кальцинированной площади, общей площади аорты, процентной площади, положительной для кальцификации, и средней интенсивности кальцинированной области.
- Чтобы выбрать аорту, сделайте рамку вокруг интересующей аорты на самом последнем рисунке на экране, выбрав четыре угла одним щелчком левой кнопки мыши и создав рамку вокруг изображения. Чтобы закрыть поле, дважды щелкните по первому углу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порог может отличаться в зависимости от используемой модели кальцификации. Пользователь сам определяет, какое значение определяет положительный сигнал для кальцификации сосудов. После того, как пороговое значение установлено для эксперимента, оно должно оставаться неизменным на протяжении всего эксперимента.
- После того, как количественные данные извлечены, выполните одностороннюю ANOVA с помощью постфактум-теста Тьюки, чтобы показать значимость между группами.
2. Выделение и извлечение ЭВ из аорты
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как аорты были изолированы и удалены, EV могут быть извлечены из ткани. Используя пищеварительный раствор и несколько циклов центрифуги, EV можно собирать и использовать для множества различных методов, включая анализы кальцификации, гель-электрофорез и иммуноблоттинг13. Протокол изоляции и извлечения электромобилей выглядит следующим образом:
- Сразу после сканирования аорты объедините две-три аорты, чтобы получить достаточную концентрацию белка.
- Приготовьте пищеварительный раствор, содержащий 0,25 М сахарозы, 0,12 М хлорида натрия (NaCl), 0,01 М хлорида калия (KCl), 0,02 М гидрохлорида триса и 600 Ед/мл коллагеназы13.
- Инкубируйте две-три объединенные аорты в 1,5 мл пищеварительного раствора в течение 2 ч при 37 ° C. Соберите раствор. Центрифугируют раствор при 1000 × г в течение 15 мин для удаления клеточного мусора.
- Центрифугируйте надосадочную жидкость в течение дополнительных 30 мин при 33 000 × г для удаления микровезикул. Соберите и оцените надосадочную жидкость на потенциал кальцификации (см. раздел 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги, если необходимо провести гель-электрофорез и белковый иммуноблоттинг ЭВ. - Ультрацентрифугируют надосадочную жидкость в дозе 100 000 × г в течение 1 ч, чтобы изолировать интересующие ВВ.
- В то время как надосадочная жидкость подвергается ультрацентрифугированию, приготовьте буфер для лизиса и экстракции RIPA (см. Таблицу материалов), добавив ингибитор протеазы и вихрь до растворения.
- После завершения ультрацентрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя гранулу, содержащую электромобили. Суспендируйте гранулу в подготовленной смеси ингибиторов лизиса и протеазы RIPA. Образцы готовы к гель-электрофорезу и вестерн-блоттингу.
3. Оценка потенциала кальцификации внеклеточных везикул с поглощением светорассеивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения минерального образования EV в режиме реального времени мы использовали анализ, первоначально разработанный для изучения образования минералов из EV хряща ростовой пластины из клеточной культуры14. Поскольку осаждение фосфата кальция является отличительной чертой кальцификации, увеличение поглощения светорассеяния в результате образования соединения фосфата кальция свидетельствует о потенциале кальцификации14. В пробирке Модели VSMC удобны для измерения потенциала кальцификации электромобилей. В этом методе считыватель пластин с коротковолновым фильтром может количественно оценить кальцификацию электромобилей in vitro . Показания абсорбционной способности регистрируются на длине волны 340 нм, а более высокое поглощение свидетельствует о большем образовании минералов фосфата кальция. Протокол анализа поглощения светорассеяния выглядит следующим образом:
- Центрифугируют кондиционированную собранную среду VSMCs при 1000 × г в течение 5 мин для удаления клеточного мусора14.
- Центрифугируют надосадочную жидкость при 33 000 × г в течение 30 мин, собирают надосадочную жидкость и переносят ее в новую пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие EV в собранном надосадочной жидкости может быть подтверждено с помощью динамического рассеяния света (DLS) или анализа отслеживания наночастиц (NTA) - Приготовьте стерильный раствор одноосновного фосфата натрия 300 мМ (2PO4). При необходимости отфильтруйте раствор, чтобы обеспечить стерильные условия.
- Добавьте 1% (об./об.) 300 мМ2PO4 к образцам EV и аккуратно пипеткой раствор для хорошего перемешивания. Перелейте 200 мкл раствора смеси на 96-луночную пластину. Инкубируйте 96-луночную пластину в считывателе микропланшетов при температуре 37 °C.
- Настройте считыватель пластин на запись поглощения на длине волны 340 нм каждые 1 минуту.
4. Оценка кальцификационного минерального образования внеклеточных везикул с помощью гидрогелей коллагена
ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегация EV и образование микрокальцификаций наблюдаются через гидрогели коллагена. Эти гидрогели действуют как каркас, имитирующий плотность коллагена, наблюдаемую in vivo15. Это демонстрирует влияние коллагена на рост кальцификации. Протокол оценки минерального образования ЭВ в гидрогелях выглядит следующим образом:
- День 1
- Приготовьте раствор коллагена 2,5 мг/мл в DMEM. Медленно добавляйте 5 М гидроксида натрия в смесь коллагена и ДМЭМ, пока цвет не изменится на красный. Убедитесь, что рН раствора составляет примерно 7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если решение становится фиолетовым и становится слишком простым, перезапустите процесс. - Пипетка 300 мкл раствора коллагена 2,5 мг/мл с рН 7 в каждую лунку 8-луночного камерного стакана. Инкубировать при 37 °C и контролируемой влажности 5% CO2 в течение 72 часов.
- Приготовьте раствор коллагена 2,5 мг/мл в DMEM. Медленно добавляйте 5 М гидроксида натрия в смесь коллагена и ДМЭМ, пока цвет не изменится на красный. Убедитесь, что рН раствора составляет примерно 7.
- День 4
- Добавьте 300 мкл DMEM в качестве контроля в лунки.
- Добавьте 300 мкл предварительно собранных образцов среды EV в оставшиеся лунки.
- Инкубировать при 37 ° C и контролируемой влажности 5% CO2 в течение 6 дней.
- День 10
- Приготовьте 2,5 мкл Osteosense 680EX с 22,5 мкл DMEM.
- Пипетка 2,5 мкл смеси Osteosense и DMEM в каждую лунку. Инкубировать при 37 °C и контролируемой влажности 5% CO2 в течение 24 часов.
- День 11
- Изображение гидрогелей с помощью фильтров, подходящих для флуоресценции Osteosense. Визуализируйте их через нижнюю часть камеры из покровного стекла с помощью перевернутого микроскопа или сверху с объективом с большим рабочим расстоянием.
- Оцените количество кальцификаций и размер кальцификации на собранных изображениях с помощью опций анализа частиц , доступных в ImageJ.
- Используйте изображение | Отрегулируйте | Команда threshold для бинаризации изображений таким образом, чтобы только сигнал Osteosense выглядел белым. Используйте функцию «Анализировать» | Анализировать частицы, чтобы получить информацию для каждой кальцификации на изображении. Обязательно используйте одни и те же пороговые параметры для каждого изображения, анализируемого для согласованности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После извлечения аорты визуализация с использованием оптического сканера ближнего инфракрасного диапазона показывает визуальное представление аорты, а также кальцификации сосудов (рис. 1). Значения интенсивности пикселей в отсканированном флуоресцентном изображении представляют собой распределение кальцификации и показаны здесь с использованием цветной тепловой карты. Методы количественной оценки включают идентификацию положительного порога и сообщение о процентной площади аорты со значениями, превышающими это пороговое значение, и/или сообщение о средней интенсивности флуоресценции пикселей в аорте. Как показано на рисунках 2 и 3, коммерчески доступные первичные клетки гладких мышц коронарной артерии человека использовались для демонстрации методов. Кондиционированные среды от VSMC могут использоваться для измерения потенциала кальцификации электромобилей. Образование минералов с течением времени измеряется по поглощению света на длине волны 480 нм с помощью считывателя микропланшетов (рис. 2A, B). Линейная регрессия во время быстрой фазы минерализации показала, что увеличение поглощения происходило в 1,5 раза быстрее в прокальцифицирующей пробе по сравнению с контрольной пробой. В коллагеновых гидрогелях отложения кальция можно визуализировать с помощью флуоресценции Osteosense (рис. 3A, B). Отдельные кальцификаты проявляются в виде остеосенз-положительных областей внутри гидрогеля.
Рисунок 1: Визуализированная аорта после расслоения. После сканирования кальцификация может быть визуализирована в аортах мышей C57BL / 6J. Более высокий сигнал Osteosense наблюдается по всей аорте мыши с хроническим заболеванием почек (крайний слева) по сравнению с двумя аортами контрольных мышей (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Поглощение минералов для измерения потенциала кальцификации EV. (А,Б) Рассеяние света на длине волны 340 нм показывает более высокую поглощающую способность в кондиционированной среде, полученной из VSMC, культивируемых в прокальцифицирующей среде (темная линия), по сравнению с нормальной контрольной средой (светло-серая линия). (C) Линейная регрессия первых 20 минут анализа показывает более быстрое образование минералов в прокальцифицирующем образце. Сокращения: EV = внеклеточный везикула; VSMCs = сосудистые гладкомышечные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Образование минералов из кондиционированных сред в коллагеновых гидрогелях. Кондиционированные среды из (А) контрольных клеток и (В) клеток, культивируемых в течение 21 дня в прокальцифицирующей среде, помещали в коллагеновые гидрогели. Визуализация дальней красной флуоресценции Osteosense показывает (А) минимальный сигнал в контрольном образце и (Б) присутствие минералов, которые образовались из кондиционированной среды клеток, культивируемых в прокальцифицирующих условиях. Масштаб = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Пользовательский сценарий MATLAB для количественной оценки общего сигнала кальциевого индикатора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При выполнении протокола важно отметить критические шаги для получения успешных результатов. Во время изоляции мышиной аорты жизненно важно, чтобы перфузия выполнялась должным образом. При введении PBS необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проколоть правый желудочек. Это приведет к тому, что жидкость будет вытекать непосредственно из желудочка и не сможет циркулировать через легкие, оставляя кровь в аорте. После того, как перфузия была проведена должным образом и началась микродиссекция, вся жировая и жировая ткань должна быть удалена из аорты перед завершением и сканированием. Оставшийся жир приведет к тому, что аорта будет казаться больше при нормализации данных к общему размеру ткани.
Из-за ограниченного размера аорты мыши во время расслоения обычно прокалывают или разрезают аорту пополам. Если это произошло, рекомендуется продолжить вскрытие в обычном режиме. Части аорты могут быть размещены близко друг к другу для визуализации. Аорта также может быть помещена в пищеварительный раствор по частям для изоляции EV. В начале выделения ВВ необходимо несколько аорт для получения достаточного количества белка. Это ограничение означает, что необходимо препарировать больше мышей, чтобы собрать соответствующее количество ткани для получения надежных результатов.
В продемонстрированном методе показано, как измерить потенциал минерализации непосредственно из EV в кондиционированных средах из VSMC в культуре. Протокол рассеяния света — это простой метод, используемый для измерения минералообразования электромобилей в режиме реального времени14. Это дает представление о периоде, в течение которого кальцификация происходит в электромобилях. Коллагеновые гидрогели обеспечивают платформу для направления агрегации и кальцификации EV для трехмерного анализа минерализации15. До сих пор мы проводили эти анализы только с EV из исследований in vitro ; однако в будущих исследованиях мы будем стремиться адаптировать эти методы для анализа потенциала минерализации электромобилей, выделенных из аорты мыши.
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти в мире, при этом кальцификация является наиболее значимым предиктором заболеваемости и смертности. Определив механизмы, с помощью которых EV приводят к кальцификации, будущие исследования могут быть проведены с упором на контроль роста минералов в качестве терапевтической стратегии путем ингибирования путей, которые приводят к высвобождению кальцинированных EV, а также путем прямого взаимодействия с процессом минерализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального института сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения (NIH) (1R01HL160740 и 5 T32GM132054-04) и Фонда исследований сердца Флориды. Мы хотели бы поблагодарить Кассандру Гомес за ее помощь в синтезе и визуализации гидрогелей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
- Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
- Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
- Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
- Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
- New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
- Aikawa, E., Hutcheson, J. D. Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).
- Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
- Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
- El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
- Veseli, B. E., et al.
- Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
- Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).
