Summary
In diesem Artikel wird die Methodik zur Gewinnung und Bewertung der Gefäßverkalkung durch Isolierung von murinen Aorten und anschließender Extraktion verkalkter extrazellulärer Vesikel zur Beobachtung des Mineralisierungspotenzials vorgestellt.
Abstract
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache der Welt, und Gefäßverkalkung ist der wichtigste Prädiktor für kardiovaskuläre Ereignisse. Derzeit gibt es jedoch keine Behandlungs- oder Therapiemöglichkeiten für die Gefäßverkalkung. Die Verkalkung beginnt in spezialisierten extrazellulären Vesikeln (EVs), die durch die Aggregation von Calcium- und Phosphationen als Keimbildungsherde dienen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Gewinnung und Bewertung der Verkalkung in murinen Aorten und zur Analyse der zugehörigen extrahierten EVs. Zunächst wird eine grobe Dissektion der Maus durchgeführt, um relevante Organe wie Nieren, Leber und Lunge zu entnehmen. Dann wird die murine Aorta isoliert und von der Aortenwurzel bis zur Oberschenkelarterie herausgeschnitten. Zwei bis drei Aorten werden dann gepoolt und in einer Verdauungslösung inkubiert, bevor sie einer Ultrazentrifugation unterzogen werden, um die interessierenden EVs zu isolieren. Als nächstes wird das Mineralisierungspotenzial der EVs durch Inkubation in einer phosphatreichen Lösung und Messung der Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 340 nm bestimmt. Schließlich werden Kollagen-Hydrogele verwendet, um die Bildung und Reifung von verkalkten Mineralien zu beobachten, die von den EVs in vitro erzeugt werden.
Introduction
Die Verkalkung ist der wichtigste Prädiktor für die Mortalität und Morbidität von Herz-Kreislauf-Erkrankungen1. Die Verkalkung verändert die Mechanik der Arterienwände aufgrund der Ansammlung von Calcium- und Phosphatmineralien2. Bei Arteriosklerose kann die Verkalkung den lokalen Stress verschlimmern und zu einer Plaqueruptur führen, die die Hauptursache für Herzinfarkte ist. Die mediale Verkalkung, die häufig auf eine chronische Nierenerkrankung zurückzuführen ist, ist weiter verbreitet und führt zu einer erheblichen arteriellen Versteifung, Funktionsstörung und Herzüberlastung 2,3. Derzeit gibt es keine therapeutischen Möglichkeiten zur Behandlung oder Vorbeugung von Gefäßverkalkungen.
Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) nehmen einen Osteoblasten-ähnlichen Phänotyp an und setzen kalkifizierende extrazelluläre Vesikel (EVs) frei, die entstehende Mineralien keimen und so die Verkalkung vorantreiben 4,5,6. Dieser Prozess ähnelt der physiologischen Mineralisierung von Osteoblasten im Knochen7. Obwohl der Endpunkt der Mineralisierung in der Gefäßwand und der Knochenmatrix ähnlich ist, unterscheiden sich die Mechanismen, durch die die kalzifizierenden EVs entstehen, in den beiden Geweben8. Es gibt viele Arten von Modellen, die zur Untersuchung der Gefäßverkalkung verwendet werden. In vitro ahmen Zellkulturmodelle den osteogenen Übergang von VSMCs und die anschließende Mineralbildung mit spezialisierten Medien nach.
Bei der Untersuchung der In-vivo-Verkalkung hängt das verwendete Modell von der Art der zu untersuchenden Verkalkung ab. Hyperlipidämische Mausmodelle werden häufig verwendet, um atherosklerotische Verkalkungen zu untersuchen, die in lipidreichen Plaques fokaler erscheinen9. Im Gegensatz dazu ist die mediale Verkalkung im gesamten Gefäßsystem weiter verbreitet und wird häufig unter Verwendung von Modellen für chronische Nierenerkrankungen untersucht, die eine adeninreiche Diät verwenden, um Nierenversagen zu induzieren, oder chirurgische Techniken, um signifikante Teile der Nieren zu entfernen10,11. Aggressive Modelle der Gefäßverkalkung haben eine Kombination aus hyperlipidämischen und chronischen Nierenerkrankungsmodellen verwendet12. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Beurteilung der Gefäßverkalkung in murinen Aorten sowohl für die mediale als auch für die atherosklerotische Verkalkung, die Extraktion von EVs aus der Aortenwand und die Beobachtung des Mineralisierungspotenzials in den EVs, die aus In-vitro-Zellkulturmodellen gewonnen wurden. Zukünftige Studien können diese Verfahren in mechanistischen Analysen von Gefäßverkalkungen und zur Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen einsetzen.
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Protocol
Die In-vivo-Arbeit wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Florida International University genehmigt und beaufsichtigt und entsprach den aktuellen Richtlinien der National Institutes of Health (NIH). Bei diesem Protokoll unterscheidet sich das Verfahren nicht je nach Belastung, Gewicht, Alter und Geschlecht der Maus. Die Art der untersuchten Verkalkung, Diäten und Behandlungen können die Dauer der Studie und das Gewicht der verwendeten Maus verändern und können von einem bestimmten Stamm und Geschlecht der in der Studie verwendeten Maus abhängen. Für dieses Protokoll wurden sowohl männliche als auch weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die mit einer Verkalkungsdiät gefüttert wurden. Die Mäuse wurden im Alter zwischen 20 und 24 Wochen getötet.
1. Isolierung und Exzision der Aorta
- Fluoreszierende Marker
- Injizieren Sie den Mäusen achtundvierzig Stunden vor der Euthanasie 20 μM OsteoSense 680, ein fluoreszierendes Bildgebungsmittel, in der empfohlenen Dosis von 100 μl pro 25 g über eine intravenöse Injektion.
- Legen Sie unter den Abzug eine Styroporplatte mit vier T-Pins, einen mit einem Papiertuch ausgekleideten Eimer, ein mit einem Papiertuch gefülltes 50-ml-Röhrchen, ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, Dissektionswerkzeuge (siehe Materialtabelle) und Ethanol in eine Sprühflasche. Stellen Sie Becher mit PBS auf Eis.
- Blutabnahme
- Geben Sie 2 ml Isofluran in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das mit dem Papiertuch gefüllt ist. Legen Sie das Röhrchen in den Eimer und verschließen Sie es mit dem Deckel.
VORSICHT: Isofluran sollte in einem gut belüfteten Raum ohne Umluft aufgrund der Toxizität einer kurzfristigen Exposition gehandhabt werden. - Übertragen Sie jeweils eine Maus in den Eimer. Legen Sie die Maus nach der Sedierung in Rückenposition auf das Papiertuch. Halten Sie die Maus mit der Handfläche der nicht dominanten Hand und legen Sie die Ohren mit Daumen und Zeigefinger zurück.
- Entfernen Sie mit der Pinzette eines der Augen. Halten Sie die Maus über das 1,5-ml-Röhrchen, um mit der Blutentnahme zu beginnen, bei der 1 ml Blut entnommen werden sollte. Sobald das Blut nicht mehr abfließt, legen Sie die Maus zur weiteren Sedierung wieder in den Eimer.
- Geben Sie 2 ml Isofluran in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das mit dem Papiertuch gefüllt ist. Legen Sie das Röhrchen in den Eimer und verschließen Sie es mit dem Deckel.
- Euthanasie
- Legen Sie ein Papiertuch auf die Seziermatte. Sobald die Maus sediert ist, legen Sie die Maus in Rückenlage auf die Matte. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage mit einem T-Pin, um jedes Glied festzuhalten.
- Besprühen Sie den Bauch der Maus mit Alkohol. Heben Sie mit der Pinzette die Haut im Brustbereich an. Schneiden Sie mit der Schere die mediale Linie in die Brusthöhle ab. Sobald das Brustbein in der Mitte durchtrennt wurde, schneiden Sie das Zwerchfell auf beiden Seiten des Brustkorbs ab.
- Schneiden Sie bei Bedarf den vorderen Teil des Brustkorbs ab, um Herz und Lunge freizulegen.
- Organentnahme
- Heben Sie mit einer Pinzette die Haut an und machen Sie einen Einschnitt entlang der Mittellinie. Entfernen Sie überschüssige Haut oder Fett. Entfernen Sie die Fortpflanzungsorgane und die Blase sowie jegliches Fett außerhalb der Mittellinie.
- Bewegen Sie die gastrointestinalen (GI) Organe auf die rechte Seite und folgen Sie dem Darm in der Mittellinie. Sobald Sie es gefunden haben, heben Sie die Mittellinie an und schneiden Sie den Magen-Darm-Trakt bis zum Magen heraus.
- Schneiden Sie die Nieren aus, indem Sie sie von der Mittellinie wegheben. Schneiden Sie so nah wie möglich an der Niere.
- Beginnen Sie als nächstes mit der Entfernung der Leber, indem Sie die Lappen anheben und von der Mittellinie abschneiden.
- Herz und Aorta durchbluten. Injizieren Sie mit einer 10-ml-Spritze kaltes PBS in den rechten Ventrikel. Warten Sie, bis sich die Lunge aufgeblasen hat und weiß wird. Entfernen Sie die Lunge sowie überschüssiges Zwerchfell oder Brustkorb.
- Knochenabbau
- Öffnen Sie eine Schere weit und platzieren Sie sie im unteren Bereich der Maus über dem Schwanz. Schneiden Sie nach unten und beginnen Sie, die Wirbelsäule von der Haut zu heben. Entfernen Sie das Fett von den Seiten der Mittellinie. Sobald sich die Haut gelöst hat, entfernen Sie die Wirbelsäule und die intakten Organe, indem Sie direkt über dem Herzen schneiden. Wenn Sie zu einem Stereoskop transportieren, legen Sie die Wirbelsäule und die intakten Organe in ein Becherglas mit PBS im Eiskübel.
- Bewegen Sie die Wirbelsäule und die Organe in die Sezierschale. Mit eiskaltem PBS auffüllen. Befestigen Sie die Wirbelsäule und den Brustkorb mit Nadeln.
- Verwenden Sie unter dem Dissektionsmikroskop eine Pinzette, um das Herz vorsichtig anzuheben, und beginnen Sie, über der Wirbelsäule und unter der Aorta zu schneiden. Fahren Sie damit fort, bis die Unterseite der Wirbelsäule erreicht ist. Entfernen Sie die Wirbelsäule von der Sezierschale und stecken Sie das Herz und jegliches Fremdfett oder jeden Muskel fest.
- Microdissection
- Beginnen Sie mit dem Bereich direkt unter dem Herzen und identifizieren Sie die drei röhrenförmigen Strukturen: die Speiseröhre, die Hohlvene und die Aorta. Entfernen Sie die Speiseröhre und die Hohlvene, um ein klares Gesichtsfeld der Aorta zu haben.
- Beginnen Sie mit der Mikrodissektionszezange und der Schere, das Fettgewebe anzuheben und so nah wie möglich an der Aorta zu schneiden. Achten Sie darauf, die Aorta nicht zu schneiden. Setzen Sie dies entlang der medialen Linie fort, bis alle Aorta sowie die Oberschenkelarterien freigelegt sind.
- Entfernen Sie am Herzen das gesamte Fettgewebe und legen Sie die drei Äste am Aortenbogen frei. Entfernen Sie die Aortenwurzel aus dem linken Ventrikel, indem Sie die Mikrodissektionsschere in den linken Ventrikel einführen und den Muskel um die Aorta herum durchtrennen.
- Sobald die Aorta isoliert und gereinigt ist, bilden Sie die Aorta mit einem Nahinfrarotscanner ab, um die Gefäßverkalkung sichtbar zu machen.
- Verwenden Sie das benutzerdefinierte MATLAB-Skript (Supplemental File 1), um das Gesamtsignal des Calcium-Tracers zu quantifizieren, das auf die gesamte gescannte Aortenfläche normalisiert wird. Das MATLAB-Skript funktioniert mit dem Toolbox-Add-In Bioinformatik. MATLAB wird zunächst aus dem Nahinfrarot-Scan der Aorten an den Speicherort der TIFF-Dateien geleitet, die einzelnen Dateien werden dann geöffnet und die Pixelintensitätswerte werden aus den TIFF-Dateien extrahiert.
- Sobald das Bild dem Benutzer mit einer Farbkarte angezeigt wird, wählen Sie die Aorta mit der größten Verkalkung als Skalenmaximum aus.
- Wenn MATLAB im Befehlsfenster fragt: "Wie viele Proben befinden sich im Bild?", geben Sie die Anzahl der Aorten im aktuellen Bild ein und wählen Sie jede Aorta einzeln aus. Sobald eine Aorta ausgewählt ist, erstellt MATLAB ein Binärbild mit einer Maske der Gesamtfläche der Aorta und ein weiteres Binärbild mit einer Maske des verkalkten Bereichs der Aorta. Die Werte aus diesen maskierten Bildern werden dann verwendet, um die gesamte verkalkte Fläche, die Gesamtfläche der Aorta, die prozentuale Fläche, die für die Verkalkung positiv ist, und die mittlere Intensität der verkalkten Fläche zu bestimmen.
- Um eine Aorta auszuwählen, erstellen Sie ein Kästchen um die interessierende Aorta auf der neuesten Abbildung auf dem Bildschirm, indem Sie mit einem Linksklick vier Ecken auswählen und ein Kästchen um das Bild erstellen. Um das Feld zu schließen, doppelklicken Sie auf die erste Ecke.
HINWEIS: Der Schwellenwert kann je nach verwendetem Verkalkungsmodell unterschiedlich sein. Es ist Sache des Benutzers, zu bestimmen, welcher Wert ein positives Signal für die Gefäßverkalkung bestimmt. Sobald der Schwellenwert für ein Experiment festgelegt ist, muss er während der gesamten Dauer des Experiments gleich bleiben.
- Sobald die quantitativen Daten extrahiert sind, führen Sie eine Einweg-ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey durch, um die Signifikanz zwischen den Gruppen zu zeigen.
2. Isolierung und Extraktion von EVs aus Aorten
HINWEIS: Sobald die Aorten isoliert und entfernt wurden, können EVs aus dem Gewebe extrahiert werden. Unter Verwendung einer Verdauungslösung und mehrerer Zentrifugenzyklen können EVs gesammelt und für viele verschiedene Techniken verwendet werden, einschließlich Verkalkungstests, Gelelektrophorese und Immunblotting13. Das Protokoll zum Isolieren und Extrahieren von Elektrofahrzeugen lautet wie folgt:
- Unmittelbar nach dem Scannen der Aorten werden zwei bis drei Aorten gepoolt, um eine ausreichende Proteinkonzentration zu erhalten.
- Bereiten Sie eine Verdauungslösung vor, die 0,25 M Saccharose, 0,12 M Natriumchlorid (NaCl), 0,01 M Kaliumchlorid (KCl), 0,02 M Trishydrochlorid und 600 U/ml Kollagenase13 enthält.
- Inkubieren Sie zwei bis drei gepoolte Aorten in 1,5 ml Verdauungslösung für 2 h bei 37 °C. Sammeln Sie die Lösung. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.000 × g für 15 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie den Überstand für weitere 30 Minuten bei 33.000 × g , um Mikrovesikel zu entfernen. Sammeln und bewerten Sie den Überstand auf das Verkalkungspotenzial (siehe Abschnitt 3).
HINWEIS: Befolgen Sie die folgenden Schritte, wenn eine Gelelektrophorese und ein Protein-Immunblotting der EVs durchgeführt werden sollen. - Ultrazentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 × g für 1 h, um die interessierenden EVs zu isolieren.
- Während der Überstand einer Ultrazentrifugation unterzogen wird, bereiten Sie die RIPA-Lyse und den Extraktionspuffer (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie den Proteasehemmer hinzufügen und wirbeln, bis er aufgelöst ist.
- Sobald die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie den Überstand ab und lassen Sie das Pellet übrig, das die EVs enthält. Suspendieren Sie das Pellet in der vorbereiteten RIPA-Lyse- und Proteasehemmer-Mischung. Die Proben sind bereit für die Gelelektrophorese und das Western Blotting.
3. Beurteilung des Verkalkungspotentials extrazellulärer Vesikel mit lichtstreuender Absorption
HINWEIS: Um die Mineralbildung von EVs in Echtzeit zu messen, haben wir einen Assay verwendet, der ursprünglich entwickelt wurde, um die Mineralbildung aus Wachstumsplattenknorpel-EVs aus Zellkulturenzu untersuchen 14. Da die Calciumphosphatablagerung das Kennzeichen der Verkalkung ist, ist eine Erhöhung der Lichtstreuabsorption als Folge der Bildung von Calciumphosphatverbindungen ein Hinweis auf das Verkalkungspotenzial14. In vitro VSMC-Modelle eignen sich für die Messung des Verkalkungspotenzials von Elektrofahrzeugen. Bei dieser Technik kann ein Plattenleser mit einem kurzwelligen Filter die in vitro Verkalkung von EVs quantifizieren. Der Absorptionswert wird bei 340 nm aufgezeichnet, und eine höhere Absorption weist auf eine stärkere Bildung von Calciumphosphatmineralien hin. Das Protokoll für den Lichtstreuabsorptionstest lautet wie folgt:
- Zentrifugieren Sie das konditionierte gesammelte Medium von VSMCs bei 1.000 × g für 5 Minuten, um Zelltrümmer14 zu entfernen.
- Der Überstand wird 30 Minuten lang bei 33.000 × g zentrifugiert, der Überstand aufgefangen und in ein neues Röhrchen überführt.
HINWEIS: Das Vorhandensein von EVs im gesammelten Überstand kann durch dynamische Lichtstreuung (DLS) oder Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) bestätigt werden - Bereiten Sie eine 300 mM Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4) sterile Lösung vor. Filtern Sie die Lösung, um bei Bedarf sterile Bedingungen zu gewährleisten.
- Fügen Sie 1% (v/v) von 300 mM NaH2PO4 zu den EV-Proben hinzu und pipettieren Sie die Lösung vorsichtig, um sie gut zu mischen. 200 μl der Mischungslösung werden auf eine 96-Well-Platte übertragen. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte im Mikroplatten-Reader bei 37 °C.
- Stellen Sie den Plattenleser so ein, dass er alle 1 Minute die Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm aufzeichnet.
4. Beurteilung der Verkalkungsmineralbildung von extrazellulären Vesikeln mit Kollagen-Hydrogelen
HINWEIS: Die Aggregation von EVs und die Bildung von Mikroverkalkungen werden durch Kollagenhydrogele beobachtet. Diese Hydrogele wirken wie ein Gerüst, das die in vivo15 beobachtete Kollagendichte nachahmt. Dies zeigt die Wirkung von Kollagen auf das Verkalkungswachstum. Das Protokoll zur Beurteilung der Mineralbildung von EVs in Hydrogelen lautet wie folgt:
- Tag 1
- Bereiten Sie eine 2,5 mg/ml Kollagenlösung in DMEM vor. Fügen Sie dem Kollagen/DMEM-Gemisch langsam 5 M Natriumhydroxid hinzu, bis die Farbe rot wird. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert der Lösung ungefähr 7 beträgt.
HINWEIS: Wenn die Lösung lila wird und zu einfach wird, starten Sie den Vorgang neu. - Pipettieren Sie 300 μl der 2,5 mg/ml Kollagenlösung mit einem pH-Wert von 7 in jede Vertiefung eines 8-Well-Kammerglases. Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 72 h.
- Bereiten Sie eine 2,5 mg/ml Kollagenlösung in DMEM vor. Fügen Sie dem Kollagen/DMEM-Gemisch langsam 5 M Natriumhydroxid hinzu, bis die Farbe rot wird. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert der Lösung ungefähr 7 beträgt.
- Tag 4
- Geben Sie 300 μl DMEM als Kontrolle in die Vertiefungen.
- Fügen Sie 300 μl der zuvor entnommenen EV-Mediumproben zu den verbleibenden Bohrlöchern hinzu.
- Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 6 Tage.
- Tag 10
- Bereiten Sie 2,5 μl Osteosense 680EX mit 22,5 μl DMEM vor.
- Pipettieren Sie 2,5 μl der Mischung aus Osteosense und DMEM in jede Vertiefung. Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 h.
- Tag 11
- Stellen Sie die Hydrogele mit Filtern dar, die für die Osteosense-Fluoreszenz geeignet sind. Stellen Sie sie mit einem inversen Mikroskop durch den Boden einer Deckglaskammer oder von oben mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand ab.
- Beurteilen Sie die Anzahl der Verkalkungen und die Verkalkungsgröße in den gesammelten Bildern mithilfe der in ImageJ verfügbaren Partikelanalyseoptionen.
- Verwenden Sie das Bild | Anpassen | Schwellenwertbefehl , um die Bilder so zu binarisieren, dass nur das Osteosense-Signal weiß erscheint. Verwenden Sie die Option Analysieren | Befehl Partikel analysieren , um Informationen für jede Verkalkung im Bild zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass Sie für jedes Bild, das auf Konsistenz analysiert wird, dieselben Schwellenwertparameter verwenden.
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Representative Results
Sobald die Aorten extrahiert sind, zeigt die Bildgebung mit einem optischen Nahinfrarot-Scanner eine visuelle Darstellung der Aorta sowie der Gefäßverkalkung (Abbildung 1). Die Pixelintensitätswerte innerhalb des gescannten Fluoreszenzbildes stellen die Verteilung der Verkalkung dar und werden hier mit einer farbigen Heatmap dargestellt. Zu den Quantifizierungsmethoden gehören die Identifizierung eines positiven Schwellenwerts und die Angabe der prozentualen Fläche der Aorta mit Werten, die über diesem Schwellenwert liegen, und/oder die Angabe der mittleren Fluoreszenzintensität der Pixel innerhalb der Aorta. Wie in Abbildung 2 und Abbildung 3 gezeigt, wurden kommerziell erhältliche primäre glatte Muskelzellen der menschlichen Koronararterien verwendet, um die Techniken zu demonstrieren. Konditionierte Medien von VSMCs können verwendet werden, um das Verkalkungspotenzial von Elektrofahrzeugen zu messen. Die Mineralbildung im Laufe der Zeit wird durch die Lichtabsorption bei 480 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Readers gemessen (Abbildung 2A, B). Eine lineare Regression während der schnellen Phase der Mineralisierung zeigte, dass der Absorptionsanstieg in der prokalzifizierenden Probe im Vergleich zu einer Kontrollprobe 1,5-fach schneller erfolgte. In Kollagen-Hydrogelen können Kalziumablagerungen durch Bildgebung der Osteosense-Fluoreszenz sichtbar gemacht werden (Abbildung 3A, B). Einzelne Verkalkungen erscheinen als Osteosense-positive Regionen innerhalb des Hydrogels.
Abbildung 1: Abgebildete Aorten nach der Dissektion. Nach dem Scannen kann die Verkalkung in den Aorten von C57BL/6J-Mäusen sichtbar gemacht werden. Ein höheres Osteosense-Signal wird in der gesamten Aorta einer Maus mit chronischer Nierenerkrankung (ganz links) im Vergleich zu den beiden Aorten von Kontrollmäusen (rechts) beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mineralische Absorption zur Messung des EV-Verkalkungspotentials. (A,B) Die Lichtstreuung bei 340 nm zeigt eine höhere Absorption im konditionierten Medium, das von VSMCs erhalten wird, die in kalkhaltigem Medium kultiviert wurden (dunkle Linie) im Vergleich zum normalen Kontrollmedium (hellgraue Linie). (C) Eine lineare Regression der ersten 20 Minuten des Assays zeigt eine schnellere Mineralbildung in der prokalzifikanten Probe. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; VSMCs = vaskuläre glatte Muskelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Mineralbildung aus konditionierten Medien in Kollagen-Hydrogelen. Konditionierte Medien von (A) Kontrollzellen und (B)-Zellen, die 21 Tage lang in einem prokalzifizierenden Medium kultiviert wurden, wurden in Kollagenhydrogele gegeben. Die Bildgebung der dunkelroten Osteosense-Fluoreszenz zeigt (A) ein minimales Signal in der Kontrollprobe und (B) das Vorhandensein von Mineralien, die sich aus dem konditionierten Medium von Zellen gebildet haben, die unter prokalzifizierenden Bedingungen kultiviert wurden. Maßstab = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Datei 1: Ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript zur Quantifizierung des Gesamtsignals des Calcium-Tracers. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Bei der Durchführung des Protokolls ist es wichtig, die kritischen Schritte zu beachten, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Während der Isolierung der murinen Aorta ist es wichtig, dass die Perfusion richtig durchgeführt wird. Bei der Injektion des PBS muss darauf geachtet werden, dass der rechte Ventrikel nicht punktiert wird. Dies würde dazu führen, dass die Flüssigkeit direkt aus dem Ventrikel austritt und nicht durch die Lunge zirkuliert, wodurch Blut in der Aorta zurückbleibt. Sobald die Perfusion ordnungsgemäß durchgeführt wurde und die Mikrodissektion begonnen hat, muss das gesamte Fett- und Fettgewebe vor Abschluss und Scan aus der Aorta entfernt werden. Verbleibendes Fett führt dazu, dass die Aorta größer erscheint, wenn die Daten auf die Gesamtgewebegröße normalisiert werden.
Aufgrund der begrenzten Größe der Mausaorta während der Dissektion ist es üblich, die Aorta zu durchstechen oder in zwei Hälften zu schneiden. In diesem Fall wird empfohlen, die Dissektion wie gewohnt fortzusetzen. Die Aortenstücke können für die Bildgebung dicht beieinander platziert werden. Die Aorta kann auch in Stücken zur EV-Isolierung in die Verdauungslösung gegeben werden. Zu Beginn der Isolierung der EVs werden mehrere Aorten benötigt, um ausreichend Protein zu liefern. Diese Einschränkung bedeutet, dass mehr Mäuse seziert werden müssen, um die entsprechende Menge an Gewebe zu sammeln, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.
In der demonstrierten Methode zeigen wir, wie das Mineralisierungspotenzial direkt von EVs in konditionierten Medien von VSMCs in Kultur gemessen werden kann. Das Lichtstreuprotokoll ist eine einfache Methode, mit der die Mineralbildung von EVs in Echtzeit gemessenwerden kann 14. Dies gibt Aufschluss über den Zeitraum, in dem Verkalkung in Elektrofahrzeugen auftritt. Die Kollagen-Hydrogele bieten eine Plattform, um die Aggregation und Verkalkung von EVs für die dreidimensionale Analyse der Mineralisierung15 zu steuern. Bisher haben wir diese Analysen nur mit EVs aus In-vitro-Studien durchgeführt; In zukünftigen Studien werden wir jedoch versuchen, diese Methoden anzupassen, um das Mineralisierungspotenzial von EVs zu analysieren, die aus Mausaorten isoliert wurden.
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache der Welt, wobei die Verkalkung der wichtigste Prädiktor für Morbidität und Mortalität ist. Durch die Identifizierung der Mechanismen, durch die EVs zur Verkalkung führen, können zukünftige Studien durchgeführt werden, die sich auf die Kontrolle des Mineralwachstums als therapeutische Strategie konzentrieren, indem die Wege gehemmt werden, die zur Freisetzung von verkalkten EVs führen, sowie durch direkte Interaktion mit dem Mineralisierungsprozess.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Heart, Lung and Blood Institute der National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 und 5 T32GM132054-04) und der Florida Heart Research Foundation unterstützt. Wir danken Kassandra Gomez für ihre Hilfe bei der Synthese und Bildgebung der Hydrogele.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
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