Summary
Este trabalho apresenta a metodologia para obtenção e avaliação da calcificação vascular pelo isolamento de aortas murinas seguidas da extração de vesículas extracelulares calcificadas para observação do potencial de mineralização.
Abstract
A doença cardiovascular é a principal causa de morte no mundo, e a calcificação vascular é o preditor mais significativo de eventos cardiovasculares; no entanto, atualmente não existem opções terapêuticas ou de tratamento para a calcificação vascular. A calcificação começa dentro de vesículas extracelulares especializadas (EVs), que servem como focos de nucleação pela agregação de íons cálcio e fosfato. Este protocolo descreve métodos para obtenção e avaliação da calcificação em aortas murinas e análise dos EVs extraídos associados. Primeiro, a dissecção macroscópica do rato é realizada para coletar quaisquer órgãos relevantes, como os rins, fígado e pulmões. Em seguida, a aorta murina é isolada e excisada da raiz aórtica para a artéria femoral. Duas a três aortas são então agrupadas e incubadas em uma solução digestiva antes de serem submetidas à ultracentrifugação para isolar os EVs de interesse. Em seguida, o potencial de mineralização dos EVs é determinado através da incubação em uma solução de alto teor de fosfato e medindo a absorvância da luz a um comprimento de onda de 340 nm. Finalmente, os hidrogéis de colágeno são usados para observar a formação mineral calcificada e a maturação produzida pelos EVs in vitro.
Introduction
A calcificação é o preditor mais significativo de mortalidade e morbidade por doenças cardiovasculares1. A calcificação altera a mecânica da parede arterial devido ao acúmulo de minerais cálcio e fosfato2. Na aterosclerose, a calcificação pode exacerbar o estresse local e resultar em ruptura da placa, que é a principal causa de ataques cardíacos. A calcificação medial, muitas vezes decorrente de doença renal crônica, é mais difundida e leva a enrijecimento arterial significativo, disfunção e sobrecarga cardíaca 2,3. Atualmente, não existem opções terapêuticas para o tratamento ou prevenção da calcificação vascular.
As células musculares lisas vasculares (CMVS) adotam um fenótipo semelhante ao osteoblasto e liberam vesículas extracelulares calcificantes (EVs) que nucleam minerais nascentes, impulsionando a calcificação 4,5,6. Esse processo se assemelha à mineralização fisiológica dos osteoblastos no osso7. Embora o desfecho da mineralização seja semelhante na parede vascular e na matriz óssea, os mecanismos pelos quais os EVs calcificantes se originam diferem nos dois tecidos8. Existem muitos tipos de modelos que são usados para estudar a calcificação vascular. In vitro, os modelos de cultura celular imitam a transição osteogênica dos VSMCs e a subsequente formação mineral com meios especializados.
Ao estudar a calcificação in vivo, o modelo utilizado depende do tipo de calcificação que está sendo estudada. Modelos hiperlipidêmicos de camundongos são frequentemente utilizados para estudar a calcificação aterosclerótica, que parece mais focal dentro de placas ricas em lipídios9. Em contraste, a calcificação medial é mais difundida em toda a vasculatura e é frequentemente estudada usando modelos de doença renal crônica que empregam um regime de dieta rica em adenina para induzir insuficiência renal ou técnicas cirúrgicas para remover porções significativas dos rins10,11. Modelos agressivos de calcificação vascular têm utilizado uma combinação de modelos de doença renal hiperlipidêmica e crônica12. Este protocolo fornece um método para avaliar a calcificação vascular em aortas murinas para calcificação medial e aterosclerótica, extrair EVs da parede aórtica e observar o potencial de mineralização nos EVs obtidos a partir de modelos de cultura celular in vitro. Estudos futuros podem utilizar esses procedimentos em análises mecanicistas de calcificação vascular e para avaliar potenciais intervenções terapêuticas.
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Protocol
O trabalho in vivo foi aprovado e supervisionado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Internacional da Flórida e em conformidade com as diretrizes atuais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Para este protocolo, o procedimento não difere dependendo da tensão, peso, idade e sexo do rato. O tipo de calcificação que está sendo estudada, dietas e tratamentos podem alterar a duração do estudo e o peso do camundongo usado e podem ser dependentes de uma cepa específica e do sexo do camundongo usado no estudo. Para este protocolo, foram utilizados camundongos C57BL/6J machos e fêmeas, que foram alimentados com uma dieta de calcificação. Os ratos foram sacrificados entre 20 semanas e 24 semanas de idade.
1. Isolamento e excisão da aorta
- Marcadores fluorescentes
- Quarenta e oito horas antes da eutanásia, injetar os ratos com 20 μM OsteoSense 680, um agente de imagem fluorescente, na dose recomendada de 100 μL por 25 g através de uma injeção intravenosa.
- Sob o exaustor, coloque uma placa de isopor com quatro pinos-t, um balde forrado com uma toalha de papel, um tubo de 50 mL recheado com uma toalha de papel, um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, ferramentas de dissecação (consulte a Tabela de Materiais) e etanol em um frasco de spray. Coloque copos com PBS no gelo.
- Coleta de sangue
- Adicione 2 mL de isoflurano em um tubo cônico de 50 mL recheado com o papel toalha. Coloque o tubo no balde e feche-o com a tampa.
CUIDADO: O isoflurano deve ser manuseado em um espaço bem ventilado sem recirculação do ar de exaustão devido à toxicidade da exposição a curto prazo. - Transfira um mouse para o bucket de cada vez. Uma vez sedado, coloque o rato sobre o papel toalha na posição dorsal. Segurando o mouse com a palma da mão não dominante, coloque as orelhas para trás usando o polegar e o dedo indicador.
- Usando a pinça, extirpe um dos olhos. Segure o rato acima do tubo de 1,5 ml para iniciar a colheita de sangue, durante o qual 1 ml de sangue deve ser recolhido. Quando o sangue parar de escorrer, coloque o rato de volta no balde para uma sedação adicional.
- Adicione 2 mL de isoflurano em um tubo cônico de 50 mL recheado com o papel toalha. Coloque o tubo no balde e feche-o com a tampa.
- Eutanásia
- Coloque uma toalha de papel no tapete de dissecação. Uma vez que o rato esteja sedado, coloque-o no tapete em posição supina. Prenda o rato na posição supina usando um pino t para segurar cada membro.
- Pulverize o abdômen do rato com álcool. Usando a pinça, levante a pele na região do peito. Com a tesoura, corte a linha medial na cavidade torácica. Uma vez que o esterno tenha sido cortado no centro, corte o diafragma em ambos os lados da caixa torácica.
- Se necessário, corte a porção frontal da caixa torácica para expor o coração e os pulmões.
- Remoção de órgãos
- Usando pinças, levante a pele e faça uma incisão na linha média. Remova qualquer excesso de pele ou gordura. Remova os órgãos reprodutivos e a bexiga, bem como qualquer gordura fora da linha média.
- Mova os órgãos gastrointestinais (GI) para o lado direito e siga os intestinos na linha média. Uma vez encontrado, levante a linha média e excise o trato gastrointestinal até o estômago.
- Excise os rins, levantando-os para longe da linha média. Corte o mais próximo possível do rim.
- Em seguida, comece a remoção do fígado, levantando os lóbulos e cortando a linha média.
- Perfundir o coração e a aorta. Usando uma seringa de 10 mL, injete PBS frio no ventrículo direito. Espere os pulmões inflarem e ficarem brancos. Remova os pulmões, bem como qualquer excesso de diafragma ou caixa torácica.
- Remoção óssea
- Abra uma tesoura larga e coloque-a na região inferior do mouse acima da cauda. Corte para baixo e comece a levantar a coluna da pele. Remova a gordura dos lados da linha média. Uma vez que a pele é destacada, excise a coluna vertebral e os órgãos intactos, cortando logo acima do coração. Se estiver transportando para um estereoscópio, coloque a coluna vertebral e os órgãos intactos em um copo de PBS no balde de gelo.
- Mova a coluna vertebral e os órgãos para o prato de dissecação. Encha com PBS gelado. Prenda a coluna vertebral e a caixa torácica usando agulhas.
- Sob o microscópio de dissecção, use pinças para levantar o coração com cuidado e comece a cortar acima da coluna vertebral e abaixo da aorta. Continue até que o fundo da coluna vertebral seja atingido. Remova a coluna vertebral do prato dissecante e fixe o coração e qualquer gordura ou músculo estranho.
- Microdissecção
- A partir da área logo abaixo do coração, identifique as três estruturas tubulares: esôfago, veia cava e aorta. Remova o esôfago e a veia cava para ter um campo visual claro da aorta.
- Usando a pinça de microdissecção e a tesoura, comece a levantar o tecido adiposo e corte o mais próximo possível da aorta. Certifique-se de não cortar a aorta. Continue isso pela linha medial até que toda a aorta, bem como as artérias femorais estejam expostas.
- No coração, remova todo o tecido adiposo, expondo os três ramos no arco aórtico. Remova a raiz aórtica do ventrículo esquerdo inserindo a tesoura de microdissecção no ventrículo esquerdo e cortando o músculo ao redor da aorta.
- Uma vez que a aorta é isolada e limpa, a imagem da aorta usando um scanner infravermelho próximo para visualizar a calcificação vascular.
- Use o script MATLAB personalizado (Arquivo Suplementar 1) para quantificar o sinal total do marcador de cálcio, que é normalizado para a área total da aorta digitalizada. O script MATLAB funciona usando o suplemento Bioinformática toolbox. O MATLAB é primeiro direcionado para o local dos arquivos TIFF a partir da varredura de infravermelho próximo dos aortas, os arquivos individuais são abertos e os valores de intensidade de pixel são extraídos dos arquivos TIFF.
- Uma vez que a imagem é apresentada ao usuário com um mapa de cores, selecione a aorta com a maior calcificação como a escala máxima.
- Quando o MATLAB perguntar "Quantos espécimes estão na imagem?" na janela de comando, insira o número de aortas na imagem atual e selecione cada aorta uma a uma. Uma vez que uma aorta é selecionada, o MATLAB criará uma imagem binária com uma máscara da área total da aorta e outra imagem binária com uma máscara da área calcificada da aorta. Os valores dessas imagens mascaradas são então usados para determinar a área total calcificada, a área total da aorta, a porcentagem de área positiva para calcificação e a intensidade média da área calcificada.
- Para selecionar uma aorta, faça uma caixa ao redor da aorta de interesse na figura mais recente na tela, selecionando quatro cantos com um clique esquerdo e criando uma caixa ao redor da imagem. Para fechar a caixa, clique duas vezes no primeiro canto.
NOTA: O limiar pode ser diferente dependendo do modelo de calcificação utilizado. Cabe ao usuário determinar qual valor determina um sinal positivo para a calcificação vascular. Uma vez que o limite é definido para um experimento, ele deve permanecer o mesmo durante toda a duração do experimento.
- Uma vez extraídos os dados quantitativos, realize-se uma ANOVA one-way com o teste post-hoc de Tukey para mostrar significância entre os grupos.
2. Isolar e extrair EVs das aortas
NOTA: Uma vez que as aortas tenham sido isoladas e removidas, os EVs podem ser extraídos do tecido. Usando uma solução digestiva e múltiplos ciclos de centrífuga, os EVs podem ser coletados e utilizados para muitas técnicas diferentes, incluindo ensaios de calcificação, eletroforese em gel e immunoblotting13. O protocolo para isolar e extrair EVs é o seguinte:
- Imediatamente após a varredura das aortas, agrupe duas a três aortas para produzir uma concentração suficiente de proteína.
- Preparar uma solução digestiva contendo 0,25 M de sacarose, 0,12 M de cloreto de sódio (NaCl), 0,01 M de cloreto de potássio (KCl), 0,02 M de cloridrato de Tris e 600 U/mL de colagenase13.
- Incubar duas a três aortas agrupadas em 1,5 mL de solução digestiva por 2 h a 37 °C. Colete a solução. Centrifugar a solução a 1.000 × g durante 15 minutos para remover os detritos celulares.
- Centrifugar o sobrenadante por mais 30 min a 33.000 × g para remover microvesículas. Recolher e avaliar o sobrenadante para o potencial de calcificação (ver secção 3).
NOTA: Siga os passos subsequentes se a eletroforese em gel e a imunoblotting proteica dos EVs devem ser realizadas. - Ultracentrífuga do sobrenadante a 100.000 × g por 1 h para isolar os EVs de interesse.
- Enquanto o sobrenadante estiver em fase de ultracentrifugação, prepare a lise do RIPA e o tampão de extração (consulte a Tabela de Materiais) adicionando o inibidor da protease e o vórtice até dissolver.
- Uma vez que a ultracentrifugação esteja completa, aspirar o sobrenadante, deixando o pellet, que contém os EVs. Suspender o pellet na mistura preparada de lise RIPA e inibidor de protease. As amostras estão prontas para eletroforese em gel e western blotting.
3. Avaliação do potencial de calcificação de vesículas extracelulares com absorbância de dispersão de luz
NOTA: Para medir a formação mineral em tempo real de EVs, utilizamos um ensaio originalmente desenvolvido para estudar a formação mineral a partir de EVs de cartilagem de placa de crescimento a partir de cultura celular14. Como a deposição de fosfato de cálcio é a marca registrada da calcificação, um aumento na absorvância de dispersão de luz como resultado da formação de compostos de fosfato de cálcio é indicativo do potencial de calcificação14. In vitro Os modelos VSMC são convenientes para medir o potencial de calcificação dos VEs. Nesta técnica, um leitor de placas com um filtro de comprimento de onda curto pode quantificar a calcificação in vitro de EVs. A leitura da absorvência é registrada a 340 nm, e uma maior absorvância é indicativa de mais formação mineral de fosfato de cálcio. O protocolo para o ensaio de absorbância de dispersão de luz é o seguinte:
- Centrifugar o meio condicionado coletado de VSMCs a 1.000 × g por 5 min para remover detritos celulares14.
- Centrifugar o sobrenadante a 33.000 × g por 30 min, coletar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo.
NOTA: A presença de EVs no sobrenadante coletado pode ser confirmada através de espalhamento dinâmico de luz (DLS) ou análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) - Preparar uma solução estéril de fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4) a 300 mM. Filtre a solução para garantir condições estéreis, se necessário.
- Adicione 1% (v/v) de 300 mM de NaH2PO4 às amostras de EV e pipete suavemente a solução para misturar bem. Transferir 200 μL da solução de mistura para uma placa de 96 poços. Incubar a placa de 96 poços no leitor de microplacas a 37 °C.
- Ajuste o leitor de placas para registrar a absorvância em um comprimento de onda de 340 nm a cada 1 min.
4. Avaliação da formação mineral de calcificação de vesículas extracelulares com hidrogéis de colágeno
NOTA: A agregação de EVs e a formação de microcalcificações são observadas através de hidrogéis de colágeno. Esses hidrogéis atuam como um andaime que imita a densidade de colágeno observada in vivo15. Isso demonstra o efeito do colágeno no crescimento da calcificação. O protocolo para avaliar a formação mineral de EVs em hidrogéis é o seguinte:
- Dia 1
- Preparar uma solução de colagénio de 2,5 mg/ml em DMEM. Adicione lentamente hidróxido de sódio 5 M à mistura de colagénio/DMEM até que a cor mude para vermelho. Verifique se o pH da solução é de aproximadamente 7.
Observação : se a solução ficar roxa e se tornar muito básica, reinicie o processo. - Pipetar 300 μL da solução de colagénio de 2,5 mg/ml com um pH de 7 para cada poço de um vidro de câmara de 8 poços. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 de humidade controlada durante 72 h.
- Preparar uma solução de colagénio de 2,5 mg/ml em DMEM. Adicione lentamente hidróxido de sódio 5 M à mistura de colagénio/DMEM até que a cor mude para vermelho. Verifique se o pH da solução é de aproximadamente 7.
- Dia 4
- Adicione 300 μL de DMEM como controle nos poços.
- Adicionar 300 μL das amostras médias EV coletadas previamente aos poços restantes.
- Incubar a 37 °C e 5% de CO2 de humidade controlada durante 6 dias.
- Dia 10
- Preparar 2,5 μL de Osteosense 680EX com 22,5 μL de DMEM.
- Pipeta de 2,5 μL da mistura de Osteosense e DMEM em cada poço. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 de humidade controlada durante 24 h.
- Dia 11
- Imagem dos hidrogéis com filtros apropriados para fluorescência Osteosense. Imagine-os através da parte inferior de uma câmara de vidro de cobertura usando um microscópio invertido ou do topo com uma objetiva de longa distância de trabalho.
- Avalie o número de calcificações e o tamanho da calcificação nas imagens coletadas usando as opções de Análise de Partículas disponíveis no ImageJ.
- Use a imagem | Ajustar | Comando de limiar para binariz as imagens de tal forma que apenas o sinal Osteosense apareça branco. Use o botão Analisar | Analise o comando de partículas para obter informações para cada calcificação na imagem. Certifique-se de usar os mesmos parâmetros de limite para cada imagem analisada quanto à consistência.
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Representative Results
Uma vez extraídas as aortas, a imagem por meio de um scanner óptico infravermelho próximo mostra uma representação visual da aorta, bem como da calcificação vascular (Figura 1). Os valores de intensidade de pixel dentro da imagem fluorescente digitalizada representam a distribuição da calcificação e são mostrados aqui usando um mapa de calor colorido. Os métodos de quantificação incluem identificar um limiar positivo e relatar a área percentual da aorta com valores maiores que esse valor limiar e/ou relatar a intensidade média de fluorescência dos pixels dentro da aorta. Como mostrado na Figura 2 e na Figura 3, células musculares lisas primárias da artéria coronária humana comercialmente disponíveis foram utilizadas para demonstrar as técnicas. Meios condicionados de VSMCs podem ser usados para medir o potencial de calcificação de EVs. A formação mineral ao longo do tempo é medida pela absorvância da luz a 480 nm usando um leitor de microplacas (Figura 2A,B). Uma regressão linear durante a fase rápida de mineralização revelou que o aumento da absorbância ocorreu 1,5 vezes mais rápido na amostra pró-calcificada em comparação com uma amostra controle. Dentro dos hidrogéis de colágeno, os depósitos de cálcio podem ser visualizados por imagem de fluorescência Osteosense (Figura 3A,B). Calcificações individuais aparecem como regiões positivas para Osteosenses dentro do hidrogel.
Figura 1: Aortas fotografadas após dissecção. Após a varredura, a calcificação pode ser visualizada dentro das aortas de camundongos C57BL/6J. Um sinal Osteosense mais alto é observado em toda a aorta de um rato com doença renal crônica (extrema esquerda) em comparação com as duas aortas de camundongos controle (direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Absorvância mineral para medir o potencial de calcificação do EV. (A,B) O espalhamento de luz a 340 nm mostra uma maior absorvância no meio condicionado obtido a partir de VSMCs cultivados em meio pró-calcífico (linha escura) em comparação com o meio controle normal (linha cinza claro). (C) Uma regressão linear dos primeiros 20 min do ensaio mostra uma formação mineral mais rápida na amostra pró-calcífica. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; VSMCs = células musculares lisas vasculares. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Formação mineral a partir de meios condicionados em hidrogéis de colágeno. Meios condicionados de células controle (A) e (B) células cultivadas por 21 dias em meio pró-calcífico foram colocados em hidrogéis de colágeno. A imagem da fluorescência do Osteosense vermelho-distante mostra (A) um sinal mínimo na amostra controle e (B) a presença de minerais que se formaram a partir do meio condicionado de células cultivadas em condições pró-calcificas. Escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Um script MATLAB personalizado para quantificar o sinal total do marcador de cálcio. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Ao executar o protocolo, é importante observar as etapas críticas para a obtenção de resultados bem-sucedidos. Durante o isolamento da aorta murina, é vital que a perfusão seja realizada adequadamente. Ao injetar o PBS, deve-se tomar cuidado para não perfurar o ventrículo direito. Isso faria com que o líquido vazasse diretamente para fora do ventrículo e não circulasse pelos pulmões, deixando sangue dentro da aorta. Uma vez que a perfusão tenha sido conduzida adequadamente e a microdissecção tenha começado, todo o tecido adiposo e adiposo deve ser removido da aorta antes da conclusão e digitalização. A gordura restante fará com que a aorta pareça maior ao normalizar os dados para o tamanho total do tecido.
Devido ao tamanho limitado da aorta do rato durante a dissecção, é comum perfurar ou cortar a aorta ao meio. Se isso ocorrer, recomenda-se continuar a dissecção normalmente. As peças da aorta podem ser colocadas juntas para imagem. A aorta também pode ser colocada na solução digestiva em pedaços para isolamento EV. Ao iniciar o isolamento dos EVs, múltiplas aortas são necessárias para produzir proteína suficiente. Essa limitação significa que mais camundongos devem ser dissecados para coletar a quantidade apropriada de tecido para produzir resultados confiáveis.
No método demonstrado, mostramos como medir o potencial de mineralização diretamente de EVs em meios condicionados de VSMCs em cultura. O protocolo de espalhamento de luz é um método simples utilizado para medir a formação mineral de EVs em tempo real14. Isso fornece informações sobre o período em que a calcificação ocorre dentro dos VEs. Os hidrogéis de colágeno fornecem uma plataforma para direcionar a agregação e calcificação de EVs para a análise tridimensional da mineralização15. Até agora, só realizamos essas análises com EVs de estudos in vitro ; no entanto, em estudos futuros, buscaremos adaptar esses métodos para analisar o potencial de mineralização de EVs isolados de aortas de camundongos.
A doença cardiovascular é a principal causa de morte no mundo, sendo a calcificação o preditor mais significativo de morbidade e mortalidade. Ao identificar os mecanismos pelos quais os VEs levam à calcificação, estudos futuros podem ser realizados com foco no controle do crescimento mineral como estratégia terapêutica, inibindo as vias que levam à liberação de EVs calcificados, bem como interagindo diretamente com o processo de mineralização.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (1R01HL160740 e 5 T32GM132054-04) e da Fundação de Pesquisa do Coração da Flórida. Gostaríamos de agradecer a Kassandra Gomez por sua ajuda na síntese e imagem dos hidrogéis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
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