Summary
Detta dokument presenterar metoden för att erhålla och bedöma vaskulär förkalkning genom att isolera murina aortor följt av extraktion av förkalkade extracellulära vesiklar för att observera mineraliseringspotentialen.
Abstract
Kardiovaskulär sjukdom är den främsta dödsorsaken i världen, och vaskulär förkalkning är den viktigaste prediktorn för kardiovaskulära händelser; Det finns dock för närvarande ingen behandling eller terapeutiska alternativ för vaskulär förkalkning. Förkalkning börjar inom specialiserade extracellulära vesiklar (EV), som fungerar som kärnbildande foci genom att aggregera kalcium- och fosfatjoner. Detta protokoll beskriver metoder för att erhålla och bedöma förkalkning i murina aortor och analysera tillhörande extraherade EV. Först utförs grov dissektion av musen för att samla in relevanta organ, såsom njurar, lever och lungor. Därefter isoleras murina aorta och skärs ut från aortaroten till lårbensartären. Två till tre aortor slås sedan samman och inkuberas i en matsmältningslösning innan de genomgår ultracentrifugering för att isolera EV: erna av intresse. Därefter bestäms mineraliseringspotentialen hos EV: erna genom inkubation i en högfosfatlösning och mätning av ljusabsorbansen vid en våglängd av 340 nm. Slutligen används kollagenhydrogeler för att observera den förkalkade mineralbildningen och mognaden som produceras av EV: erna in vitro.
Introduction
Förkalkning är den mest signifikanta prediktorn för kardiovaskulär sjukdomsdödlighet och sjuklighet1. Förkalkning förändrar artärväggmekaniken på grund av uppbyggnaden av kalcium- och fosfatmineraler2. Vid åderförkalkning kan förkalkning förvärra lokal stress och resultera i plackbrott, vilket är den främsta orsaken till hjärtinfarkt. Medial förkalkning - ofta till följd av kronisk njursjukdom - är mer utbredd och leder till betydande arteriell förstyvning, dysfunktion och hjärtöverbelastning 2,3. För närvarande finns det inga terapeutiska alternativ för behandling eller förebyggande av vaskulär förkalkning.
Vaskulära glattmuskelceller (VSMC) antar en osteoblastliknande fenotyp och släpper ut förkalkande extracellulära vesiklar (EV) som kärnar begynnande mineraler, vilket driver förkalkning 4,5,6. Denna process liknar den fysiologiska mineraliseringen av osteoblaster i ben7. Även om slutpunkten för mineralisering är likartad i kärlväggen och benmatrisen, skiljer sig mekanismerna genom vilka de förkalkande EV: erna härstammar i de två vävnaderna8. Det finns många typer av modeller som används för att studera vaskulär förkalkning. In vitro efterliknar cellodlingsmodeller den osteogena övergången av VSMC och efterföljande mineralbildning med specialiserade medier.
När man studerar förkalkning in vivo beror den modell som används på vilken typ av förkalkning som studeras. Hyperlipidemiska musmodeller används ofta för att studera aterosklerotisk förkalkning, vilket verkar mer fokalt inom lipidrika plack9. Däremot är medial förkalkning mer utbredd i hela vaskulaturen och studeras ofta med hjälp av kroniska njursjukdomsmodeller som använder en adeninrik dietregim för att inducera njursvikt eller kirurgiska tekniker för att ta bort betydande delar av njurarna10,11. Aggressiva modeller av vaskulär förkalkning har använt en kombination av både hyperlipidemiska och kroniska njursjukdomsmodeller12. Detta protokoll tillhandahåller en metod för att bedöma vaskulär förkalkning i murina aortor för både medial och aterosklerotisk förkalkning, extrahera EV från aortaväggen och observera mineraliseringspotentialen i EV erhållna från in vitro-cellodlingsmodeller. Framtida studier kan använda dessa procedurer i mekanistiska analyser av vaskulär förkalkning och för att bedöma potentiella terapeutiska ingrepp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo-arbetet godkändes och övervakades av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Florida International University och överensstämde med gällande riktlinjer från National Institutes of Health (NIH). För detta protokoll skiljer sig proceduren inte beroende på musens belastning, vikt, ålder och kön. Den typ av förkalkning som studeras, dieter och behandlingar kan ändra studiens längd och vikten på musen som används och kan vara beroende av en specifik stam och kön hos musen som används i studien. För detta protokoll användes både manliga och kvinnliga C57BL / 6J-möss, och de matades med en förkalkningsdiet. Mössen offrades mellan 20 veckor och 24 veckors ålder.
1. Isolering och excision av aorta
- Fluorescerande markörer
- Fyrtioåtta timmar före dödshjälp, injicera mössen med 20 μM OsteoSense 680, ett fluorescerande bildmedel, vid den rekommenderade dosen 100 μL per 25 g via en intravenös injektion.
- Under dragskåpet placerar du en frigolitskiva med fyra t-stift, en hink fodrad med en pappershandduk, ett 50 ml rör fyllt med en pappershandduk, ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, dissektionsverktyg (se materialförteckningen) och etanol i en sprayflaska. Placera bägare med PBS på is.
- Bloddragning
- Tillsätt 2 ml isofluran i ett 50 ml koniskt rör fyllt med pappershandduken. Placera röret i hinken och stäng det med locket.
VARNING: Isofluran ska hanteras i ett väl ventilerat utrymme utan återcirkulation av frånluft på grund av toxiciteten vid kortvarig exponering. - Överför en mus till skopan i taget. När du har sövt placerar du musen på pappershandduken i dorsalläge. Håll musen med handflatan på den icke-dominerande handen, placera öronen tillbaka med tummen och pekfingret.
- Använd pincetten, punktskatta ett av ögonen. Håll musen ovanför 1,5 ml röret för att påbörja bloduppsamlingen, under vilken 1 ml blod ska samlas in. När blodet slutar rinna ut, placera musen tillbaka i hinken för ytterligare sedering.
- Tillsätt 2 ml isofluran i ett 50 ml koniskt rör fyllt med pappershandduken. Placera röret i hinken och stäng det med locket.
- Dödshjälp
- Lägg en pappershandduk på dissektionsmattan. När musen är nedsövd, placera musen på mattan i ryggläge. Säkra musen i ryggläge med en t-stift för att hålla ner varje lem.
- Spraya ner musens buk med alkohol. Använd pincetten och lyft huden vid bröstregionen. Skär ner mediallinjen i brösthålan med saxen. När bröstbenet har skurits ner i mitten, skär membranet på vardera sidan av bröstkorgen.
- Om nödvändigt, skära bort den främre delen av bröstkorgen för att exponera hjärtat och lungorna.
- Avlägsnande av organ
- Använd pincett, lyft huden och gör ett snitt längs mittlinjen. Ta bort överflödig hud eller fett. Ta bort reproduktionsorganen och urinblåsan, liksom allt fett utanför mittlinjen.
- Flytta gastrointestinala (GI) organ till höger sida, och följ tarmarna i mittlinjen. När du hittat, lyft mittlinjen och punkta mag-tarmkanalen upp till magen.
- Punktskatta njurarna genom att lyfta dem bort från mittlinjen. Skär så nära njurarna som möjligt.
- Börja sedan avlägsnandet av levern genom att lyfta loberna och skära bort från mittlinjen.
- Perfusera hjärtat och aortan. Använd en 10 ml spruta, injicera kall PBS i höger kammare. Vänta tills lungorna blåses upp och blir vita. Ta bort lungorna, liksom eventuellt överskott av membran eller bröstkorg.
- Benborttagning
- Öppna en sax bred och placera dem i musens nedre region ovanför svansen. Skär nedåt och börja lyfta ryggraden från huden. Ta bort fettet från mittlinjens sidor. När huden är fristående, skära ryggraden och intakta organ genom att skära precis ovanför hjärtat. Om du transporterar till ett stereoskop, placera ryggraden och intakta organ i en bägare PBS i ishinken.
- Flytta ryggraden och organen i dissekeringsskålen. Fyll med iskall PBS. Fäst ner ryggraden och bröstkorgen med nålar.
- Under dissektionsmikroskopet, använd pincett för att lyfta hjärtat försiktigt och börja skära ovanför ryggraden och under aortan. Fortsätt detta tills botten av ryggraden nås. Ta bort ryggraden från dissekeringsskålen och kläm fast hjärtat och eventuellt främmande fett eller muskler.
- Mikrodissektion
- Börja från området precis under hjärtat, identifiera de tre rörformiga strukturerna: matstrupen, vena cava och aorta. Ta bort matstrupen och vena cava för att få ett tydligt synfält av aortan.
- Använd mikrodissektionstången och saxen och börja lyfta fettvävnaden och skära så nära aortan som möjligt. Var noga med att inte skära aortan. Fortsätt detta ner mediala linjen tills alla aorta samt lårbensartärerna exponeras.
- I hjärtat, ta bort all fettvävnad och exponera de tre grenarna vid aortabågen. Ta bort aortaroten från vänster kammare genom att sätta in mikrodissektionsaxen i vänster kammare och skära muskeln som omger aortan.
- När aortan är isolerad och rengjord, avbilda aortan med hjälp av en nära infraröd skanner för att visualisera vaskulär förkalkning.
- Använd det anpassade MATLAB-skriptet (kompletterande fil 1) för att kvantifiera den totala signalen för kalciumspåraren, som normaliseras till det totala skannade aortaområdet. MATLAB-skriptet fungerar med hjälp av tillägget Bioinformatics toolbox. MATLAB riktas först till platsen för TIFF-filerna från den nära infraröda skanningen av aortorna, de enskilda filerna öppnas sedan och pixelintensitetsvärdena extraheras från TIFF-filerna.
- När bilden presenteras för användaren med en färgkarta, välj aortan med störst förkalkning som skalans maximala.
- När MATLAB frågar "Hur många exemplar finns i bilden?" i kommandofönstret, mata in antalet aortor i den aktuella bilden och välj varje aorta en efter en. När en aorta har valts kommer MATLAB att skapa en binär bild med en mask av aortans totala yta och en annan binär bild med en mask av det förkalkade området av aortan. Värdena från dessa maskerade bilder används sedan för att bestämma den totala förkalkade ytan, den totala ytan av aortan, den procentuella arealen positiv för förkalkning och medelintensiteten för det förkalkade området.
- För att välja en aorta, gör en ruta runt aortan av intresse på den senaste figuren på skärmen genom att välja fyra hörn med ett vänsterklick och skapa en ruta runt bilden. För att stänga rutan, dubbelklicka på det första hörnet.
OBS: Tröskeln kan vara olika beroende på vilken förkalkningsmodell som används. Det är upp till användaren att bestämma vilket värde som bestämmer en positiv signal för vaskulär förkalkning. När tröskelvärdet har fastställts för ett experiment måste det förbli detsamma under hela experimentets varaktighet.
- När kvantitativa data har extraherats, utför en enkelriktad ANOVA med Tukeys post-hoc-test för att visa signifikans mellan grupperna.
2. Isolera och extrahera elfordon från aortor
OBS: När aortorna har isolerats och tagits bort kan EV extraheras från vävnaden. Med hjälp av en matsmältningslösning och flera centrifugcykler kan EV samlas in och användas för många olika tekniker, inklusive förkalkningsanalyser, gelelektrofores och immunoblot13. Protokollet för isolering och extraktion av elfordon är följande:
- Omedelbart efter skanning av aortorna, slå samman två till tre aortor för att ge en tillräcklig proteinkoncentration.
- Bered en matsmältningslösning innehållande 0,25 M sackaros, 0,12 M natriumklorid (NaCl), 0,01 M kaliumklorid (KCl), 0,02 M Trishydroklorid och 600 U / ml kollagenas13.
- Inkubera två till tre poolade aortor i 1,5 ml matsmältningslösning i 2 timmar vid 37 °C. Samla lösningen. Centrifugera lösningen vid 1 000 × g i 15 minuter för att avlägsna cellskräp.
- Centrifugera supernatanten i ytterligare 30 minuter vid 33 000 × g för att avlägsna mikrovesiklar. Samla in och bedöm supernatanten med avseende på förkalkningspotential (se avsnitt 3).
OBS: Följ de efterföljande stegen om gelelektrofores och proteinimmunoblot av EV ska utföras. - Ultracentrifugera supernatanten vid 100 000 × g i 1 timme för att isolera de intressanta elfordonen.
- Medan supernatanten genomgår ultracentrifugering, förbered RIPA-lyss och extraktionsbuffert (se materialtabellen) genom att tillsätta proteashämmaren och virvla tills den är upplöst.
- När ultracentrifugeringen är klar, aspirera supernatanten och lämna pelleten, som innehåller EV: erna. Suspendera pelleten i den beredda blandningen av RIPA-lys och proteashämmare. Proverna är klara för gelelektrofores och western blotting.
3. Bedömning av förkalkningspotentialen hos extracellulära vesiklar med ljusspridningsabsorbans
OBS: För att mäta mineralbildning i realtid av EV använde vi en analys som ursprungligen utvecklades för att studera mineralbildning från tillväxtplattbrosk EV från cellkultur14. Eftersom kalciumfosfatavsättning är kännetecknet för förkalkning, är en ökning av ljusspridningsabsorbansen som ett resultat av bildning av kalciumfosfatförening en indikation på förkalkningspotentialen14. In vitro VSMC-modeller är praktiska för att mäta förkalkningspotentialen hos elbilar. I denna teknik kan en plattläsare med ett kort våglängdsfilter kvantifiera in vitro-förkalkning av EV. Absorbansavläsningen registreras vid 340 nm, och en högre absorbans indikerar mer kalciumfosfatmineralbildning. Protokollet för ljusspridningsabsorbansanalysen är som följer:
- Centrifugera det konditionerade uppsamlade mediet av VSMC vid 1 000 × g i 5 minuter för att avlägsna cellskräp14.
- Centrifugera supernatanten vid 33 000 × g i 30 minuter, samla upp supernatanten och överför den till ett nytt rör.
OBS: Förekomsten av EV i den insamlade supernatanten kan bekräftas genom dynamisk ljusspridning (DLS) eller nanopartikelspårningsanalys (NTA) - Bered en 300 mM monobasisk natriumfosfatlösning (NaH2PO4). Filtrera lösningen för att säkerställa sterila förhållanden vid behov.
- Tillsätt 1% (v/v) av 300 mM NaH2PO4 till EV-proverna och pipettera försiktigt lösningen för att blanda väl. Överför 200 μl av blandningslösningen till en platta med 96 brunnar. Inkubera plattan med 96 brunnar i mikroplattläsaren vid 37 °C.
- Ställ in plattläsaren på att registrera absorbansen vid en våglängd på 340 nm var 1:e minut.
4. Bedömning av förkalkningsmineralbildning av extracellulära vesiklar med kollagenhydrogeler
OBS: Aggregeringen av EV och bildandet av mikroförkalkningar observeras genom kollagenhydrogeler. Dessa hydrogeler fungerar som en byggnadsställning som efterliknar kollagendensiteten observerad in vivo15. Detta visar effekten av kollagen på förkalkningstillväxt. Protokollet för bedömning av mineralbildning av EV i hydrogeler är följande:
- Dag 1
- Bered en 2,5 mg/ml kollagenlösning i DMEM. Tillsätt långsamt 5 M natriumhydroxid till kollagen/DMEM-blandningen tills färgen ändras till röd. Kontrollera att lösningens pH är ungefär 7.
Om lösningen blir lila och blir för grundläggande, starta om processen. - Pipettera 300 μL av 2,5 mg/ml kollagenlösning med pH 7 i varje brunn i ett kammarglas med 8 brunnar. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2-kontrollerad luftfuktighet i 72 timmar.
- Bered en 2,5 mg/ml kollagenlösning i DMEM. Tillsätt långsamt 5 M natriumhydroxid till kollagen/DMEM-blandningen tills färgen ändras till röd. Kontrollera att lösningens pH är ungefär 7.
- Dag 4
- Tillsätt 300 μL DMEM som kontroll i brunnarna.
- Tillsätt 300 μL av de EV-mediumprover som samlats in tidigare till de återstående brunnarna.
- Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2-kontrollerad luftfuktighet i 6 dagar.
- Dag 10
- Bered 2,5 μL Osteosense 680EX med 22,5 μL DMEM.
- Pipettera 2,5 μL av Osteosense- och DMEM-blandningen i varje brunn. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2-kontrollerad luftfuktighet i 24 timmar.
- Dag 11
- Avbilda hydrogelerna med filter som är lämpliga för Osteosense-fluorescens. Avbilda dem genom botten av en täckglaskammare med hjälp av ett inverterat mikroskop eller från toppen med ett långt arbetsavståndsmål.
- Bedöm antalet förkalkningar och förkalkningsstorleken i de insamlade bilderna med hjälp av alternativen för partikelanalys som finns i ImageJ.
- Använd bilden | Justera | Tröskelkommando för att binarisera bilderna så att endast Osteosense-signalen visas vit. Använd knappen Analysera | Kommandot Analysera partiklar för att få information för varje förkalkning i bilden. Se till att använda samma tröskelvärdesparametrar för varje bild som analyseras för konsekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När aortorna har extraherats visar avbildning med en nära infraröd optisk skanner en visuell representation av aortan såväl som vaskulär förkalkning (figur 1). Pixelintensitetsvärdena i den skannade fluorescerande bilden representerar fördelningen av förkalkning och visas här med en färgad värmekarta. Kvantifieringsmetoder innefattar identifiering av ett positivt tröskelvärde och rapportering av den procentuella arean av aortan med värden som är större än detta tröskelvärde och/eller rapportering av den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos pixlarna inom aortan. Som visas i figur 2 och figur 3 användes kommersiellt tillgängliga primära humana glattmuskelceller från humana kranskärl för att demonstrera teknikerna. Konditionerade medier från VSMC kan användas för att mäta förkalkningspotentialen hos elbilar. Mineralbildning över tid mäts med ljusabsorbansen vid 480 nm med hjälp av en mikroplattläsare (figur 2A,B). En linjär regression under den snabba fasen av mineraliseringen avslöjade att absorbansökningen inträffade 1,5 gånger snabbare i pro-kalkprovet jämfört med ett kontrollprov. Inom kollagenhydrogeler kan kalciumavlagringar visualiseras genom att avbilda Osteosense-fluorescens (figur 3A, B). Individuella förkalkningar framträder som osteosense-positiva regioner inom hydrogelen.
Figur 1: Avbildade aortor efter dissektion. Efter skanning kan förkalkning visualiseras inom aortorna hos C57BL / 6J-möss. En högre Osteosense-signal observeras i hela aortan hos en mus med kronisk njursjukdom (längst till vänster) jämfört med de två aortorna från kontrollmöss (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mineralabsorbans för att mäta EV-förkalkningspotentialen. (A,B) Ljusspridning vid 340 nm visar en högre absorbans i det konditionerade mediet erhållet från VSMCs odlade i pro-calcific medium (mörk linje) jämfört med det normala kontrollmediet (ljusgrå linje). (C) En linjär regression av de första 20 minuterna av analysen visar snabbare mineralbildning i pro-kalkprovet. Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; VSMCs = vaskulära glattmuskelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mineralbildning från konditionerade medier i kollagenhydrogeler. Konditionerade medier från (A) kontrollceller och (B) celler odlade i 21 dagar i ett pro-kalkmedium placerades i kollagenhydrogeler. Avbildningen av den långröda Osteosense-fluorescensen visar (A) en minimal signal i kontrollprovet och (B) närvaron av mineraler som bildades från det konditionerade mediet av celler odlade under pro-kalkförhållanden. Skala = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Ett anpassat MATLAB-skript för att kvantifiera kalciumspårarens totala signal. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När du utför protokollet är det viktigt att notera de kritiska stegen för att få framgångsrika resultat. Under isoleringen av murin aorta är det viktigt att perfusionen utförs korrekt. Vid injektion av PBS måste man vara försiktig så att man inte punkterar höger kammare. Detta skulle leda till att vätskan läcker direkt ut ur ventrikeln och misslyckas med att cirkulera genom lungorna och lämnar blod i aortan. När perfusionen har utförts ordentligt och mikrodissektion har börjat, måste all fett- och fettvävnad avlägsnas från aortan innan den är klar och skannad. Återstående fett kommer att få aortan att se större ut när data normaliseras till den totala vävnadsstorleken.
På grund av den begränsade storleken på musaortan under dissektion är det vanligt att genomborra eller skära aortan i hälften. Om detta inträffar rekommenderas att dissektionen fortsätter som vanligt. Aortabitarna kan placeras nära varandra för avbildning. Aortan kan också placeras i matsmältningslösningen i bitar för EV-isolering. När man börjar isolera elfordonen behövs flera aortor för att ge tillräckligt med protein. Denna begränsning innebär att fler möss måste dissekeras för att samla in lämplig mängd vävnad för att ge tillförlitliga resultat.
I den demonstrerade metoden visar vi hur man mäter mineraliseringspotentialen direkt från EVs i konditionerade medier från VSMCs i kultur. Ljusspridningsprotokollet är en enkel metod som används för att mäta mineralbildningen hos elbilar i realtid14. Detta ger insikt i den period då förkalkning sker inom elbilar. Kollagenhydrogelerna ger en plattform för att styra aggregering och förkalkning av EV för den tredimensionella analysen av mineralisering15. Hittills har vi bara utfört dessa analyser med EV från in vitro-studier ; I framtida studier kommer vi dock att försöka anpassa dessa metoder för att analysera mineraliseringspotentialen hos elbilar isolerade från musaortor.
Kardiovaskulär sjukdom är den ledande dödsorsaken i världen, med förkalkning som den viktigaste prediktorn för sjuklighet och dödlighet. Genom att identifiera de mekanismer genom vilka EV leder till förkalkning kan framtida studier genomföras med fokus på att kontrollera mineraltillväxt som en terapeutisk strategi genom att hämma de vägar som leder till frisättning av förkalkade EV, samt genom att direkt interagera med mineraliseringsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 och 5 T32GM132054-04) och Florida Heart Research Foundation. Vi vill tacka Kassandra Gomez för hennes hjälp med att syntetisera och avbilda hydrogelerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
- Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
- Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
- Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
- Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
- New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
- Aikawa, E., Hutcheson, J. D. Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).
- Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
- Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
- El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
- Veseli, B. E., et al.
- Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
- Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).
