Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

On-chip octanolassisteret liposomsamling til bioteknologi

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65032
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver octanol-assisteret liposomsamling (OLA), en mikrofluidisk teknik til generering af biokompatible liposomer. OLA producerer monodispergerede, mikron-størrelse liposomer med effektiv indkapsling, hvilket muliggør øjeblikkelig on-chip eksperimentering. Denne protokol forventes at være særlig velegnet til syntetisk biologi og syntetisk celleforskning.

Abstract

Microfluidics er et meget anvendt værktøj til at generere dråber og vesikler af forskellig art på en kontrolleret og høj gennemstrømningsmåde. Liposomer er forenklede cellulære efterligninger sammensat af et vandigt interiør omgivet af et lipiddobbeltlag; De er værdifulde til at designe syntetiske celler og forstå fundamentet for biologiske celler på en in vitro måde og er vigtige for anvendte videnskaber, såsom fragtlevering til terapeutiske anvendelser. Denne artikel beskriver en detaljeret arbejdsprotokol for en on-chip mikrofluidisk teknik, octanolassisteret liposomsamling (OLA), til fremstilling af monodispergerede, mikronstørrelse, biokompatible liposomer. OLA fungerer på samme måde som bobleblæsning, hvor en indre vandig (IA) fase og en omgivende lipidbærende 1-octanolfase klemmes af overfladeaktive ydre væskestrømme. Dette genererer let dobbeltemulsionsdråber med fremspringende oktanollommer. Når lipiddobbeltlaget samles ved dråbegrænsefladen, løsnes lommen spontant for at give anledning til et unilamellært liposom, der er klar til yderligere manipulation og eksperimentering. OLA giver flere fordele, såsom stabil liposomgenerering (>10 Hz), effektiv indkapsling af biomaterialer og monodispergerede liposompopulationer og kræver meget små prøvevolumener (~ 50 μL), hvilket kan være afgørende, når man arbejder med dyrebare biologiske. Undersøgelsen indeholder detaljer om mikrofabrikation, blød litografi og overfladepassivering, som er nødvendige for at etablere OLA-teknologi i laboratoriet. En proof-of-principle syntetisk biologi ansøgning er også vist ved at inducere dannelsen af biomolekylære kondensater inde i liposomerne via transmembran protonflux. Det forventes, at denne ledsagende videoprotokol vil gøre det lettere for læserne at etablere og fejlfinde OLA i deres laboratorier.

Introduction

Alle celler har en plasmamembran som deres fysiske grænse, og denne membran er i det væsentlige et stillads i form af et lipiddobbeltlag dannet ved selvmontering af amfifile lipidmolekyler. Liposomer er de minimale syntetiske modstykker af biologiske celler; De har et vandigt lumen omgivet af fosfolipider, som danner et lipiddobbeltlag med de hydrofile hovedgrupper, der vender mod den vandige fase og de hydrofobe haler begravet indad. Stabiliteten af liposomer styres af den hydrofobe effekt såvel som hydrofiliciteten mellem de polære grupper, van der Waals-kræfter mellem de hydrofobe kulstofhaler og hydrogenbindingen mellem vandmolekyler og de hydrofile hoveder 1,2. Afhængigt af antallet af lipiddobbeltlag kan liposomer klassificeres i to hovedkategorier, nemlig unilamellære vesikler bestående af et enkelt dobbeltlag og multilamellære vesikler konstrueret af flere dobbeltlag. Unilamellære vesikler klassificeres yderligere baseret på deres størrelser. Typisk sfæriske i form kan de produceres i forskellige størrelser, herunder små unilamellære vesikler (SUV, 30-100 nm diameter), store unilamellære vesikler (LUV, 100-1,000 nm diameter) og endelig kæmpe unilamellære vesikler (GUV, >1,000 nm diameter)3,4. Forskellige teknikker er blevet udviklet til fremstilling af liposomer, og disse kan kategoriseres bredt i bulkteknikker5 og mikrofluidiske teknikker6. Almindeligt praktiserede bulkteknikker omfatter lipidfilmrehydrering, elektrodannelse, inverteret emulsionsoverførsel og ekstrudering 7,8,9,10. Disse teknikker er relativt enkle og effektive, og disse er hovedårsagerne til deres udbredte anvendelse i syntetisk biologi samfund. Samtidig lider de imidlertid af store ulemper med hensyn til polydispersiteten i størrelse, manglen på kontrol over lamelenheden og lav indkapslingseffektivitet 7,11. Teknikker som kontinuerlig dråbegrænsefladekrydsning (cDICE)12 og dråbeoptagelse og størrelsesfiltrering (DSSF)13 overvinder til en vis grad disse begrænsninger.

Mikrofluidiske tilgange er steget til fremtrædende plads i løbet af det sidste årti. Mikrofluidisk teknologi giver et kontrollerbart miljø til manipulation af væskestrømme inden for brugerdefinerede mikrokanaler på grund af den karakteristiske laminære strømning og diffusionsdominerede masseoverførsel. De resulterende lab-on-a-chip-enheder giver unikke muligheder for spatiotemporal kontrol af molekyler med betydeligt reducerede prøvevolumener og multiplexeringskapacitet14. Talrige mikrofluidiske metoder til fremstilling af liposomer er blevet udviklet, herunder pulserende jetting15, dobbelt emulsionstemplating16, forbigående membranudstødning 17, dråbeemulsionsoverførsel 18 og hydrodynamisk fokusering 19. Disse teknikker producerer monodispergerede, unilamellære, cellestore liposomer med høj indkapslingseffektivitet og høj gennemstrømning.

Denne artikel beskriver proceduren for octanolassisteret liposomsamling (OLA), en on-chip mikrofluidisk metode baseret på den hydrodynamiske pinch-off og efterfølgende opløsningsmiddelaffugtningsmekanisme20 (figur 1). Man kan relatere OLA's arbejde til en bobleblæsningsproces. Et seksvejs kryds fokuserer den indre vandige (IA) fase, to lipidbærende organiske (LO) strømme og to overfladeaktive indeholdende ydre vandige (OA) strømme på et enkelt sted. Dette resulterer i vand-i-(lipider + octanol)-i-vand dobbeltemulsionsdråber. Da disse dråber strømmer nedstrøms, fører grænsefladeenergiminimering, ekstern forskydningsstrøm og interaktion med kanalvæggene til dannelsen af et lipiddobbeltlag ved grænsefladen, når opløsningsmiddellommen løsnes og danner unilamellære liposomer. Afhængigt af størrelsen på oktanollommen kan affugtningsprocessen tage titusinder af sekunder til et par minutter. I slutningen af udgangskanalen flyder de mindre tætte oktanoldråber til overfladen, mens de tungere liposomer (på grund af en tættere indkapslet opløsning) synker til bunden af visualiseringskammeret klar til eksperimentering. Som et repræsentativt eksperiment demonstreres processen med væske-væskefaseseparation (LLPS) inde i liposomer. Til det er de nødvendige komponenter indkapslet inde i liposomer ved en sur pH, der forhindrer LLPS. Ved eksternt at udløse en pH-ændring og således en transmembran protonflux dannes faseseparerede kondensatdråber inde i liposomerne. Dette fremhæver OLA-systemets effektive indkapslings- og manipulationsfunktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af masterskiven

  1. Tag en ren siliciumskive med en diameter på 4 tommer (10 cm) (se materialetabel). Rengør det yderligere med trykluft for at fjerne støvpartikler.
  2. Monter waferen på en spincoater, og dispenser forsigtigt ~ 5 ml af en negativ fotoresist (se materialetabel) i midten af waferen. Prøv at undgå luftbobler, da de kan forstyrre waferens nedstrøms udskrivningsproces.
  3. For at opnå et 10 μm tykt fotoresistlag skal du dreje waferen ved 500 o / min i 30 s med en acceleration på 100 o / min / s til indledende spredning efterfulgt af en 60 s spin ved 3.000 o / min med en acceleration på 500 o / s / s. Hvis der ønskes en anden tykkelse, skal du ændre centrifugeringsparametrene i henhold til producentens anvisninger.
  4. Bag vaflen på en varmeplade i 2 min ved 65 °C og derefter i 5 min ved 95 °C.
  5. Når waferen er kølet af, skal du montere waferen i trykkammeret på den optiske litografimaskine med direkte skrivning (se materialetabellen) og indføre OLA-designet (figur 2A, supplerende kodningsfil 1) i softwaren.
    BEMÆRK: OLA-designet består i det væsentlige af to OA-kanaler, to LO-kanaler og en IA-kanal, der fusionerer for at danne et seksvejskryds, der fortsætter som en postproduktionskanal og ender i den eksperimentelle brønd (EW).
  6. Udskriv OLA-design(e) på den coatede wafer ved hjælp af en UV-laser (se materialetabellen) med en dosis på 300 mJ/cm2.
  7. Når designet er trykt, bages waferen ved 65 °C i 1 min, efterfulgt af 95 °C i 3 min.
  8. På dette tidspunkt skal du sikre dig, at omridset af den trykte enhed vises på waferen og er synlig for det blotte øje. For at vaske den uhærdede fotoresist af, dyppes skiven i et glasbægerglas, der indeholder udvikleropløsningen (se materialetabellen), indtil den uhærdede fotoresist er helt fjernet.
    BEMÆRK: Overdreven udviklerbehandling kan påvirke designopløsningen.
  9. Skiven vaskes med acetone, isopropanol og deioniseret (DI) vand i rækkefølge og til sidst med trykluft/N2 ved hjælp af en blæsepistol.
  10. Hårdbag skiven ved 150 °C i 30 minutter for at sikre, at det trykte design sidder godt fast på waferens overflade og ikke falder af i nedstrøms fremstillingsprocessen. Hovedskiven er derefter klar til videre brug (figur 2B).

2. Klargøring af den mikrofluidiske enhed

  1. Placer masterskiven på et firkantet stykke aluminium, og vikl aluminiumsfolien rundt om waferen og dann en vellignende struktur (figur 2C).
  2. 40 g polydimethylsiloxan (PDMS) og 4 g hærdningsmiddel (10:1, vægtforhold, se materialetabel) i et 50 ml centrifugeglas, og bland kraftigt med en spatel eller en pipettespids i 2-3 minutter.
  3. Den kraftige blanding af PDMS og hærdningsmiddel fælder luftbobler inde i blandingen. Drej røret ved 100 x g i 2-3 minutter for at fjerne størstedelen af store luftbobler.
  4. Der hældes ca. 15-20 g af blandingen fremstillet i trin 2.3 over hovedwaferen, og afgassen ved hjælp af en ekssikkator. Gem den overskydende blanding for at lave PDMS-belagte glasglas (trin 3).
  5. Enheden inkuberes i en ovn ved 70 °C i mindst 2 timer.
  6. Tag masterskiven ud af ovnen og lad den køle af. For at fjerne den størknede PDMS-blok skal du fjerne aluminiumsfolien og forsigtigt fjerne PDMS-blokken fra kanten af waferen.
    BEMÆRK: Waferen er skrøbelig og kan gå i stykker, så det er vigtigt at udføre denne proces omhyggeligt.
  7. Når PDMS-blokken er fjernet, skal du holde den mønstrede struktur opad og bruge et skarpt blad eller en skalpel til at skære individuelle PDMS-blokke, der hver indeholder en enkelt mikrofluidisk enhed.
  8. Placer PDMS-blokken på en mørk overflade, og juster lysretningen (en bordlampe er praktisk til dette), så de graverede kanaler er skinnende og som følge heraf synlige. Lav huller i indløb og udgangskanal ved hjælp af biopsistanser med henholdsvis 0,5 mm og 3 mm diameter (se materialetabel).
    BEMÆRK: Brug en skarp biopsistans for at undgå revner i PDMS, som kan forårsage lækage senere. Skub forsigtigt biopsistansen gennem PDMS-blokken, og sørg for, at den passerer helt igennem den. For at fjerne biopsistansen skal du forsigtigt trække den tilbage, mens du roterer den i alternative retninger. PDMS-blokken med det indgraverede OLA-design er nu klar til at binde til et PDMS-belagt glasglas.

3. Fremstilling af PDMS-belagt glas

  1. Tag en gennemsigtig glasdæksel, hæld ca. 0,5 ml PDMS (forberedt i overskud i trin 2.4) på midten af glasglasset, og spred den over dæksedlen ved forsigtigt at vippe glasglasset, hvilket sikrer total dækning af glasglasset med PDMS.
  2. Monter glasglideren på spincoateren, sørg for, at den er centralt placeret (så midten af glideren overlapper midten af trykakslen), og drej glasobjektglasset ved 500 o / min i 15 s (i et trin på 100 o / min / s) og derefter ved 1.000 o / min i 30 s (i et trin på 500 o / s / s).
  3. Placer PDMS-belagt glasglas (belagt side opad) på en hævet platform som en blok PDMS (1 cm x 1 cm) i et overdækket petrifad, og bag det ved 70 °C i 2 timer.

4. Limning af den mikrofluidiske enhed

  1. Rengør PDMS-blokken (forberedt i trin 2) ved at klæbe og fjerne kommercielt tilgængelig scotch tape (se materialetabellen) to gange. Sørg for at holde den rensede side opad indtil brug.
  2. Rengør den PDMS-belagte glasglide med trykluft/N2 med en blæsepistol, og hold den rene side opad.
  3. Placer PDMS-blokken (indgraverede kanaler opad) og PDMS-belagt glasglas (belagt side opad) i plasmarenserens vakuumkammer (se materialetabel).
  4. Tænd for vakuumet, og udsæt indholdet for luftplasma ved en radiofrekvens på 12 MHz (RF-tilstand høj) i 15 s for at aktivere overfladerne. Oxygenplasma kan ses i form af en lyserød nuance.
  5. Umiddelbart efter plasmabehandlingen placeres det PDMS-belagte glasglas på en ren overflade med PDMS-siden opad. Placer forsigtigt PDMS-blokken med det mikrofluidiske mønster, der nu vender mod PDMS-belagt glasglas, så de kan binde (figur 2D).
    BEMÆRK: Fjernelse af luften, der er fanget i enheden, er afgørende for at sikre grundig limning.
  6. Bag de bundne enheder ved 70 °C i 2 timer.

5. Overfladefunktionalisering af den mikrofluidiske enhed

BEMÆRK: Før overfladefunktionalisering er det vigtigt at kalibrere trykpumpen i henhold til producentens protokol (se materialetabellen) og samle slangen for at forbinde den til den mikrofluidiske enhed.

  1. Tilslutning af den mikrofluidiske enhed til trykpumperne
    1. Tilslut den trykdrevne flowregulator til en ekstern trykkilde (op til 6 bar). Der kræves mindst fire uafhængige lufttrykskanaler: tre individuelle moduler på 0-2 bar og et modul på -0,9-4 bar.
    2. Kalibrer trykpumpen i henhold til producentens protokol (se materialetabellen).
    3. Skær slangen (1/16 i OD x 0,02 i ID) i fire lige store stykker, der er ca. 20 cm lange.
    4. Indsæt 23 G 90° bøjede konnektorer i rustfrit stål (se materialetabellen) i den ene ende af hvert stykke. Denne ende indsættes senere i de tre indløb (OA, LO og IA) i den mikrofluidiske enhed, og den fjerde bruges til at fjerne overskydende opløsning (trin 5.2.5).
    5. Indsæt den anden ende af slangen i det mikrofluidiske reservoirstativ, og forsegl det ved hjælp af mikrofluidiske fittings, og sørg for, at slangen er lang nok til at røre bunden af reservoiret (1,5 ml rør, se materialetabel). Dette forhindrer uønskede luftbobler i at komme ind i den mikrofluidiske enhed under PVA-behandlingen / liposomproduktionen.
  2. PVA-behandling af udgangskanalen
    BEMÆRK: Før liposomgenerering er det afgørende at gøre enheden delvist hydrofil nedstrøms for produktionskrydset. Dette gøres ved at behandle disse kanaler med 5% (w / v) polyvinylalkohol (PVA) opløsning. PVA-opløsningen fremstilles ved at opløse PVA-pulveret (se materialetabellen) i vand ved 80 °C i 3 timer under konstant omrøring ved hjælp af en magnetisk omrører. Filtrer opløsningen, inden du bruger den til overfladebehandling. Umiddelbart efter bindingen af enheden er de mikrofluidiske kanaler hydrofile på grund af den plasmainducerede overfladeaktivering, og de bliver gradvist hydrofobe igen. Det anbefales at vente i 2 timer efter bagningen (trin 4.6), før PVA-behandlingen påbegyndes.
    1. Fordel 200 μL 5% w / v PVA-opløsning i et 1,5 ml rør, og tilslut det til det mikrofluidiske reservoirstativ. Indsæt slangen (den, der er nævnt i trin 5.1.3), således at den ene ende er nedsænket i PVA-opløsningen, og den anden ende er forbundet med indløbet til OA-kanalen på den mikrofluidiske enhed.
      BEMÆRK: En lavere PVA-koncentration kan føre til overfladefunktionalisering under standard.
    2. Gentag ovenstående trin uden PVA (tomt 1,5 ml rør), og tilslut det til LO- og IA-kanalerne.
    3. Forøg trykket i OA-fasen til 100 mbar for at strømme PVA-opløsningen i OA-kanalerne. Forøg trykket i IA- og LO-faserne til 120 mbar for at forhindre tilbagestrømning af PVA-opløsning inde i disse kanaler (figur 2E).
      BEMÆRK: Juster om nødvendigt trykket på de enkelte kanaler for at holde menisken stabil ved produktionskrydset.
    4. Flow PVA-opløsningen på denne måde i ca. 5 minutter, hvilket sikrer fuldstændig funktionalisering af udgangskanalen.
    5. For at fjerne PVA-opløsningen skal du fjerne slangen fra OA-indløbet og straks øge trykket i LO- og IA-kanalerne til 2 bar. Brug samtidig en slange, der er tilsluttet en undertrykskanal (-900 mbar), fjern overskydende PVA først fra udgangskanalen og derefter fra OA-indløbet (figur 2F).
    6. Bag apparatet ved 120 °C i 15 min, og lad det køle af inden brug. Enheden kan opbevares under omgivende forhold i mindst 1 måned.
      BEMÆRK: Det anbefales at vente i 1 dag (ved stuetemperatur), før du fortsætter med OLA for at sikre, at det ubehandlede PDMS genvinder sin hydrofobicitet efter plasmabehandlingen.

6. Octanol-assisteret liposomsamling (OLA)

  1. Forberedelse af lipidbestanden
    BEMÆRK: Her anvendes en blanding af 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(lissamin rhodamin B sulfonyl) (Liss Rhod PE) lipider (se materialetabel) som et eksempel; Brugere bør forberede den lipidsammensætning, de har brug for på en lignende måde.
    1. 76 μL DOPC (25 mg/ml) og 16,6 μL Liss Rhod PE (1 mg/ml) hældes i en rundbundet kolbe med separate glassprøjter.
    2. Hold den rundbundede kolbe lodret, og brug en komprimeretN2-blæsepistol til at give en blid nitrogenstrøm til at fordampe chloroformen og danne en tørret lipidfilm i bunden af kolben.
    3. Kolben anbringes i ekssikkatoren i mindst 2 timer under kontinuerligt vakuum for at fjerne eventuel resterende chloroform.
    4. Der tilsættes 100 μL ethanol i den rundbundede kolbe, efterfulgt af forsigtig pipettering eller omrystning for at sikre, at lipiderne opløses til dannelse af en 10% (w/v) lipidstamme.
      BEMÆRK: Hvis en bestemt lipidsammensætning ikke er fuldstændigt opløselig i ethanol, skal du bruge en ethanol / chloroformblanding, idet volumenet af chloroform holdes så lille som muligt.
    5. Opløsningen pipetteres i et hætteglas af mørkt glas. Skyl forsigtigt hætteglasset med nitrogen ved hjælp af en blæsepistol for at erstatte luften med en inaktiv atmosfære. Låget forsegles med paraffinfilm, og opbevares ved -20 °C.
      BEMÆRK: Stamopløsningen kan bruges i op til et par måneder. Hver gang hætteglasset åbnes, skal luften forsigtigt udskiftes med nitrogen og forsegles igen med låg med paraffinfilm.
  2. Forberedelse af OLA-løsningerne
    1. Lav lagerløsninger af de uundværlige komponenter: 20 mM dextran (Mw 6.000); 60% (v/v) glycerol; en buffer af valg. I dette tilfælde blev der fremstillet 5x fosfatbufret saltvand (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mMNa2HPO 4, 9 mM KH2PO 4; pH 7,4) (se materialetabel).
      BEMÆRK: Da ren glycerol er meget tyktflydende, anbefales det at skære et lille stykke ud for enden af pipettespidsen på en skrå måde for effektiv pipettering.
    2. Der fremstilles 100 μL IA-, OA- og udgangsopløsningsprøver (ES, den ønskede opløsning til påfyldning af EW). For at lette visualiseringen blev gult fluorescerende protein (YFP) tilsat til IA-opløsningen i dette særlige tilfælde. Kontroller den osmotiske balance mellem IA og OA ved at beregne osmolariteten af de indkapslede komponenter og tilsæt en passende mængde sukker eller salt i OA, hvis det er nødvendigt. Dette gøres for at forhindre sprængning eller krympning af liposomerne under produktionen.
      BEMÆRK: De endelige sammensætninger af de tre faser er som følger:
      IA: 15% glycerol, 5 mM dextran (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glycerol, 5% F68 overfladeaktivt stof, 1x PBS
      ES: 15% glycerol, 1x PBS
      En lavere koncentration af F68 overfladeaktivt stof påvirker dannelsen af dobbeltemulsioner negativt.
    3. Forbered 80 μL af LO-fasen ved pipettering af 4 μL stamlipid til 76 μL 1-octanol (se materialetabel). Den endelige koncentration af DOPC er 5 mg/ml.
    4. Prøverne centrifugeres ved 700 x g i 60 s for at fjerne eventuelle store aggregater, inden de mikrofluidiske forsøg fortsættes. Dette forhindrer åbenlyse tilstopningsfaktorer i at komme ind i den mikrofluidiske chip.
  3. Liposom produktion
    1. Dispenser opløsningerne (IA, LO, OA) i tre 1,5 ml rør, saml dem (som nævnt i trin 5.1), og tilslut dem til den PVA-behandlede mikrofluidiske chip (trin 5.2.6).
    2. Anvend et positivt tryk på de tre kanaler: ~ 100 mbar på IA- og LO-kanalerne og ~ 200 mbar på OA-kanalen.
      BEMÆRK: Da OA-trykket er højere end de andre, vil OA-opløsningen være den første, der ankommer til EW; Dette anbefales stærkt.
    3. Når OA-opløsningen når EW, sænkes OA-trykket til 100 mbar, og LO øges til 200 mbar.  LO-løsningen, der ankommer til produktionskrydset, vil sandsynligvis resultere i luftbobler på grund af luft, der fortrænges fra LO-kanalerne. Når luftboblerne er dispenseret ind i EW, justeres LO-trykket til 100 mbar. Til sidst skal du øge IA-trykket til 200 mbar og vente, indtil al luften i IA-kanalen er fjernet. Den ideelle rækkefølge af ankomst til krydset mellem de tre faser er således OA, LO og IA.
    4. Når luften er fjernet fra de tre kanaler, justeres alle kanaltryk til 50 mbar, og der pipetteres 10 μL ES ind i udgangskammeret. Efter pipettering af ES skal du sætte et dæksel på udgangshullet for at undgå fordampning. Hvis LO skubbes tilbage, øges LO-trykket gradvist i trin på 1 mbar, indtil det begynder at strømme til krydset.
    5. Når alle tre faser begynder at flyde sammen ved krydset, skal du sikre dig, at dobbeltemulsionsproduktionen begynder, og justeres i henhold til dens kvalitet (figur 3A-C). Skift trykket gradvist (trin på 0,1-1 mbar) snarere end brat, medmindre trykket ændres for at fjerne en uønsket tilstopning i kanalen.
      BEMÆRK: De kanaler, der skal justeres, afhænger af, hvad der sker i krydset. For eksempel skal IA reduceres, hvis emulsionerne er for store; OA skal øges, hvis der dannes dobbeltemulsioner, men brister i stedet for at blive klemt af; og LO skal reduceres, hvis oktanollommen er for stor.
    6. Kontroller, at dobbeltemulsionsdråberne strømmer nedstrøms til EW. Når de flyder, bliver oktanollommer mere og mere fremtrædende og bliver til sidst klemt af og danner liposomer (figur 3D-F). Sørg for, at efterproduktionskanalen er lang nok, og at migreringen af dobbeltemulsionerne er langsom nok til affugtning.
      BEMÆRK: Inden for få minutter efter anstændig produktion forlader liposomer og oktanoldråber postproduktionskanalen og går ind i EW. Som et resultat, der er mindre tæt end vand, flyder oktanoldråberne til overfladen af ES. På grund af tilsætningen af dextran i IA er liposomerne tungere end deres omgivelser og går til bunden af kammeret klar til observation og yderligere manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne undersøgelse demonstrerer dannelsen af membranløse kondensater via processen med væske-væskefaseseparation (LLPS) inde i liposomer som et repræsentativt eksperiment.

Forberedelse af prøver
IA, OA, ES og foderopløsning (FS) fremstilles som følger:

IA: 12% glycerol, 5 mM dextran, 150 mM KCl, 5 mg / ml poly-L-lysin (PLL), 0,05 mg / ml poly-L-lysin-FITC mærket (PLL-FITC), 8 mM adenosintrifosfat (ATP), 15 mM citrat-HCI (pH 4)

OA: 12% v / v glycerol, 5% w / v F68, 150 mM KCl, 15 mM citrat-HCI (pH 4)

ES: 12% glycerol, 150 mM KCl, 15 mM citrat-HCI (pH 4)

FS: 12% glycerol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCI (pH 9)

Kondensatdannelse inde i liposomer
Et simpelt assay af pH-følsom kompleks koacervation af positivt ladet poly-L-lysin (PLL) og negativt ladet multivalent adenosintrifosfat (ATP) blev valgt til at demonstrere fænomenerne LLPS i liposomer. For at forhindre faseadskillelse af polylysin og ATP under indkapsling blev opløsningens pH opretholdt ved 4, hvor ATP er neutral. Forøgelse af pH i ES ved tilsætning af FS (en buffer på pH 9) øgede til sidst pH inde i liposomerne på grund af transmembranprotonflux, hvilket gjorde ATP negativt ladet og udløste dets faseseparation med positivt ladet PLL21 (figur 4A). Efter ca. 2 timers liposomdannelse blev IA- og LO-trykket slukket. OA-kanaltrykket blev holdt på 100 mbar for langsomt at strømme de resterende liposomer ind i observationskammeret. Når alle liposomerne i kanalen blev genvundet i EW, blev trykket slukket for at stoppe strømmen og forhindre liposomerne i at bevæge sig. De liposomer, der blev genereret ved en lavere pH, viste en homogen fluorescens (fra den indkapslede fluorescerende PLL-FITC) i deres lumen (figur 4B, D). Octanoldråber, der flyder på overfladen, blev fjernet ved omhyggeligt pipettering af 5 μL opløsning fra toppen for at forhindre dem i at påvirke yderligere pipetteringstrin. Derefter blev der tilsat 10 μL FS-buffer til EW, hvilket inducerede faseadskillelse af den indkapslede PLL og ATP. Den homogene FITC-fluorescens fra hvert liposom omdannes gradvist til forskellige fluorescerende kondensatdråber. Til sidst fusionerede de enkelte dråber til en større kondensatdråbe, der frit diffunderede inden for liposomerne (figur 4C, E-G).

Figure 1
Figur 1: Skematisk visning af samling og bearbejdning af OLA. Trykregulatoren er forbundet med reservoirerne indeholdende ydre vandige, lipid-i-octanol og indre vandige opløsninger. Rørene, der indsættes i reservoirerne, er forbundet til de respektive indløb på OLA-enheden. Passende strømme i de tre kanaler fører til dannelse af vand-i-(lipid-i-octanol)-i-vand dobbeltemulsioner. De dannede dobbeltemulsioner migrerer til udgangsbrønden, hvorunder oktanollommerne løsnes for at danne liposomer. De dannede liposomer samles i bunden af brønden til visualisering og yderligere eksperimentering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse af OLA-chippen (fotolitografi, mikrofabrikation, overfladebehandling). (A) Digitalt design, der viser nøglefunktionerne i OLA-designet, herunder tre indløb, et udløb og et seksvejs produktionskryds. (B) Et skema over masterwaferen, der viser flere OLA-design fremstillet ved hjælp af UV-litografi. (C) En PDMS-elastomer støbt på hovedskiven, anbragt i en brønd skabt af aluminiumsfolie og hærdet ved bagning ved 70 °C i 2 timer. (D) En mikrofluidisk anordning bundet ved hjælp af oxygenplasmabehandling, hvor PDMS-blokken indeholdende OLA-designet er fastgjort til et PDMS-belagt glasglas. (E) Overfladefunktionalisering af den fremstillede chip for at gøre enheden delvist hydrofil. Dette gøres ved at strømme 5% w / v PVA i 5 minutter fra den ydre vandige kanal mod udgangskanalen. Positivt lufttryk i de andre kanaler forhindrer PVA-opløsningen i at komme ind i disse kanaler. (F) PVA fjernes ved at anvende et vakuum i udgangskanalen. Enheden bages ved 120 °C i 15 minutter og er derefter klar til brug. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Demonstration af OLA, der effektivt producerer monodispergerede dobbeltemulsioner og til sidst liposomer med fremragende indkapsling. (A) Et lysfeltbillede, der viser hurtig generering af dobbeltemulsionsdråber. (B) Den fluorescerende lipidkanal viser dannelsen af en oktanollomme på grund af delvis affugtning. Lipid-i-octanolfasen indeholdt en blanding af DOPC (5 mg / ml) og Lis Rhod PE i forholdet 1.000: 1. C) Den indre vandige kanal, der viser indkapsling af gult fluorescerende protein (YFP). Justeringerne i (A-C) viser repræsentative zoomede visninger af de respektive paneler (skalabjælker = 10 μm). (D-F) Affugtning af oktanollommen i udgangskanalen, som danner et liposom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: pH-udløst væske-væskefaseseparation af pLL/ATP i liposomer. (A) Skematisk over den pH-afhængige overgang af den homogene opløsning af pLL og ATP indkapslet i liposomet (venstre) til faseseparerede pLL/ATP-koacervater (højre). Det oprindelige sure miljø i liposomet gør ATP's molekylære ladning neutral, hvilket hæmmer koacervation. Når pH inde i liposomerne ekvilibrerer med den eksternt påførte pH-stigning, får ATP en negativ ladning, hvilket udløser koacervation. (B-C) Linjegrafer (svarende til de stiplede linjer i panelerne [D] og [G], der viser den rumlige fordeling af pLL (grøn kanal) og membranen (rød kanal). (D-G) Time-lapse billeder, der viser dannelsen af pLL / ATP coacervates i liposomerne. Den eksterne tilsætning af en basisk buffer hæver pH-niveauet inde i liposomerne i løbet af minutter og initierer koacervation. t = 0 min henviser til tiden lige før forekomsten af den første koacervationshændelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende kodningsfil 1: CAD-fil af OLA-designet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cellulær kompleksitet gør det ekstremt vanskeligt at forstå levende celler, når de studeres som helhed. Reduktion af redundans og sammenkobling af celler ved at rekonstituere nøglekomponenterne in vitro er nødvendig for at fremme vores forståelse af biologiske systemer og skabe kunstige cellulære efterligninger til bioteknologiske applikationer22,23,24. Liposomer tjener som et fremragende minimalt system til at forstå cellulære fænomener. En ikke-udtømmende liste over disse fænomener omfatter cytoskeletdynamik og resulterende membrandeformationer 25,26, spatiotemporal regulering af biomolekylære kondensater 27,28 og deres interaktion med membranen 29, indkapsling af en lang række biomolekyler, herunder cellefrie transkriptionsoversættelsessystemer 30, cellefri lipidsyntese 31 og udvikling af proteiner 32,33,34. Liposomer er også blevet brugt i vid udstrækning som bærere til lægemiddellevering og er blevet godkendt af Food and Drug Administration (FDA) og Det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) til klinisk brug11. Liposomer og lipidbaserede nanopartikler bruges som bærere til lægemiddellevering, herunder mRNA-vacciner som den nylige COVID-19-vaccine35.

Denne undersøgelse beskriver en detaljeret protokol om fotolitografi, mikrofluidisk samling og overfladefunktionalisering for at udføre OLA-teknikken for at generere on-chip liposomer (figur 1 og figur 3). De liposomer, der produceres ved hjælp af OLA, er monodispergerede (variationskoefficient: 4% -11% af gennemsnittet) og i det biologiske cellestørrelsesområde (typisk mellem 5-50 μm i diameter), og de kan indstilles ved hjælp af passende strømningshastigheder af de indre og ydre vandige kanaler36. For eksempel har liposompopulationen set i figur 1 en størrelsesfordeling på 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Med typiske produktionshastigheder på 10-30 Hz er de dannede liposomer unilamellære, som det tidligere blev bekræftet ved at indsætte et enkelt dobbeltlagsspecifikt transmembranprotein, alfa-hæmolysin36, i membranen såvel som ved anvendelse af dithionatblegeassay37. OLA er også kompatibel med en lang række lipidsammensætninger, hvilket giver brugeren fleksibilitet i valget af lipider. Det er vigtigt, at den oprindeligt anvendte lipidsammensætning afspejles i den endelige liposomsammensætning38.

Da der er tale om en relativt ny teknologi, er der yderligere muligheder for at forbedre OLA. For eksempel er overfladefunktionalisering ved hjælp af PVA afgørende, men kedelig at udføre. En lettere og enklere måde at overfladefunktionalisere enheden på ville reducere chipfremstillingstiden såvel som chip-til-chip-variabiliteten betydeligt. Pluronic F68 overfladeaktivt stof er en vigtig komponent i den ydre vandige fase for oprindeligt at stabilisere dobbeltemulsionerne; Ikke desto mindre kan brugen være restriktiv i visse tilfælde. Udskiftning af Pluronic F68 med et mere biokompatibelt overfladeaktivt stof eller fuldstændig fjernelse af overfladeaktivt stof kan forbedre systemets alsidighed. Under migreringen af genererede dobbeltemulsioner i udgangskanalen kan de briste på grund af forskydning. Opgradering af OLA-designet for at forbedre dobbeltemulsionsstabiliteten og oktanollommeadskillelsen kunne således øge gennemstrømningen. Ikke desto mindre har OLA flere fordele, som hovedsageligt inkluderer effektiv indkapsling, monodispergerede og unilamellære liposomer og kontrolleret on-chip-eksperimentering.

OLA er blevet anvendt og tilpasset i en bred vifte af undersøgelser, herunder vækst og opdeling af liposomer39, undersøgelse af processen med væske-væskefaseseparation27 og dens interaktion med membranen21 og forståelse af bakteriel vækstbioproduktdannelse i liposomer40. OLA-baserede højkapacitetsanalyser bruges også til at forstå iontransport over membranen 41 og lægemiddelpermeabilitet på tværs af lipiddobbeltlaget37, som et lægemiddelafgivelsessystem til terapeutiske formål 42, til at studere virkningen af antimikrobielle stoffer på membran43 og som et værktøj til at indkapsle flydende krystaller 44. Ud over den brede vifte af anvendelser af OLA-teknologi udvikles modificerede versioner af OLA, der er egnet til særlige formål 45,46,47,48,49,50. Samlet set, i betragtning af fordele og ulemper, tror vi stærkt på, at OLA er en alsidig platform for syntetisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dolf Weijers, Vera Gorelova og Mark Roosjen for venligt at give os YFP. S.D. anerkender økonomisk støtte fra det hollandske forskningsråd (bevillingsnummer: OCENW. KLEIN.465).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
  8. Zhang, H. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. D’Souza, G. G. M. , Humana. New York, NY. 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -X., Niederholtmeyer, H. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. Karim, A. S., Jewett, M. C. , Humana. New York, NY. 237-255 (2022).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 193
On-chip octanolassisteret liposomsamling til bioteknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande,… More

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter