Summary
Ici, nous décrivons les méthodes pour induire une dermatite de contact allergique dans les oreilles de souris par le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB) et comment évaluer la gravité de la dermatite de contact allergique.
Abstract
La peau est la première ligne de défense du corps humain et l’un des organes les plus exposés aux produits chimiques environnementaux. La dermatite de contact allergique (DCA) est une maladie de la peau courante qui se manifeste par une éruption cutanée locale, une rougeur et des lésions cutanées. L’apparition et le développement de la DCA sont influencés par des facteurs génétiques et environnementaux. Bien que de nombreux chercheurs aient construit une série de modèles de DCA au cours des dernières années, les protocoles expérimentaux de ces modèles sont tous différents, ce qui rend difficile pour les lecteurs de bien les établir. Par conséquent, un modèle animal stable et efficace est d’une grande importance pour étudier plus avant la pathogenèse de la dermatite atopique. Dans cette étude, nous détaillons une méthode de modélisation utilisant le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB) pour induire des symptômes de type DCA dans les oreilles des souris et décrivons plusieurs méthodes pour évaluer la gravité de la dermatite lors de la modélisation. Ce protocole expérimental a été appliqué avec succès dans certaines expériences et a un certain rôle promotionnel dans le domaine de la recherche sur la DCA.
Introduction
La dermatite de contact allergique (DCA) est une maladie de la peau courante qui se caractérise par des symptômes semblables à ceux de l’eczéma au site de contact, un œdème et un érythème dans les cas modérés, et des papules, de l’érosion, de l’exsudation ou même des cicatrices massives dans les cas graves1. Elle touche jusqu’à 20% de la population et peut toucher des personnes de tout âge2. La DCA survient souvent chez les personnes qui ont été exposées à des allergènes à plusieurs reprises et peut être causée par la réponse immunitaire de la personne à un ou plusieurs allergènes à la maison ou au travail3. L’hypersensibilité retardée de type IV est considérée comme le principal type de réponse immunitaire dans ACD4. Dans les zones de la peau qui ont été exposées à plusieurs reprises à des allergènes, les lymphocytes T mémoire circulants s’accumulent en grand nombre et induisent des réponses immunitaires et inflammatoires 3,5,6. Le but de ce travail est de proposer une technique de laboratoire fiable pour une étude plus approfondie des réponses immunologiques et inflammatoires dans le développement de la DCA.
L’apparition de la DCA est généralement due à une hypersensibilité de contact causée par une exposition répétée à des produits chimiques. De nombreux chercheurs ont développé divers modèles animaux de DCA chez des souris domestiques7,8, des cobayes 9,10 et d’autres animaux au cours des dernières décennies, afin de simuler l’apparition de la maladie. La plupart des méthodes expérimentales comportent deux étapes: la sensibilisation abdominale (induction) et l’apport de stimuli sur le dos ou le lobe de l’oreille (stimulation). Les substances chimiques couramment utilisées comprennent principalement le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB)/1-chloro-2,4-dinitrobenzène (DNCB)8,9,11, l’oxazolone 12, l’urushiol 13, etc. Parmi eux, DNFB et DNCB sont les plus utilisés, signalés pour la première fois en octobre 195810. Le modèle de sensibilisation au nickel14 et le modèle de dermatite de contact photoallergique15 sont également fréquemment utilisés.
Nous présentons une méthode expérimentale pour construire le modèle ACD. Cette méthode est résumée et optimisée sur la base d’études antérieures et par comparaison avec de multiples expériences. Par rapport à d’autres modèles de DCA, ce modèle présente certains avantages, tels que de petites différences individuelles, de courtes périodes expérimentales, une petite quantité de stimulation chimique, etc. En outre, cette étude est applicable aux souris, qui sont non seulement économiques, mais ont également plus d’options pour l’élimination des gènes ou la préparation de souris transgéniques16. Nous décrivons également les différentes méthodes utilisées pour surveiller les progrès de la DCA dans l’expérience, telles que la mesure de l’épaisseur de l’oreille, l’utilisation du colorant bleu Evans pour mesurer l’exsudation inflammatoire, etc. Ce modèle peut non seulement analyser les oreilles, le sang, la rate et d’autres échantillons de souris par des moyens de laboratoire pour explorer la pathogenèse de la DCA, mais est également applicable pour l’évaluation préclinique de nouvelles méthodes thérapeutiques, ce qui a une certaine signification promotionnelle.
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Protocol
Tous les soins et traitements des souris étaient conformes aux directives établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yangzhou et ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux sous la licence de projet SYXK (SU) 2022-0044. Des souris mâles et femelles BALB/c âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées dans cette étude. Chaque groupe était composé de six souris (voir le tableau des matériaux). Les cages ont été placées dans une chambre à température contrôlée (22 ± 2 °C, cycle lumière/obscurité de 12 h) avec libre accès à la nourriture et à l’eau. Un organigramme expérimental est illustré à la figure 1.
1. Préparation des animaux
- Commencer la modélisation après 1 semaine d’acclimatation à l’environnement.
- Utilisez une lampe ultraviolette et un désinfectant à l’alcool à 75 % pour nettoyer et désinfecter l’environnement et les comptoirs avant de manipuler les souris.
REMARQUE: Afin d’éviter l’influence de facteurs externes, le marquage des souris pour identification ne peut pas être effectué sur l’oreille de la souris; La coloration sur le dos ou sur la queue peut être utilisée comme alternative. - Utilisez un petit coton-tige pour appliquer de l’eau savonneuse sur l’abdomen des souris (environ 1-2 cm2 de taille). Rasez la zone dans le sens de la croissance des poils avec une lame ou un rasoir (voir Tableau des matériaux) au début du modelage (jour 0; Figure 2A).
REMARQUE: L’utilisation d’une lame de rasoir droite pour l’épilation nécessite un opérateur qualifié. Si elle n’est pas effectuée correctement, elle peut provoquer une irritation de la peau. Envisagez d’utiliser une crème dépilatoire, une tondeuse ou un rasoir de sécurité pour l’épilation. - Pesez la souris et comparez les changements de poids dans chaque groupe.
2. Stimulation de la sensibilisation abdominale
- Assurer la récupération complète de toute blessure mineure à la peau de l’abdomen induite par le rasage. Appliquer la sensibilisation abdominale 2 jours après le rasage (jour 2).
- Préparer la solution de DNFB à 0,5 % : diluer le DNFB avec un mélange acétone/huile d’olive dans un rapport de 4:1 (p. ex., 400 μL d’acétone mélangé à 100 μL d’huile d’olive; voir le tableau des matières). Utilisez un pistolet à pipette pour souffler et mélanger 20 fois pour bien mélanger la solution DNFB. Avant chaque administration de solution DNFB à la souris, souffler et mélanger trois à cinq fois.
REMARQUE: Préparez la solution avant utilisation et enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière directe du soleil. - Appliquer 25 μL de la solution de DNFB à 0,5 % sur la peau de la zone rasée sur l’abdomen des souris à l’aide d’une pipette (figure 2B).
- Déposer la solution DNFB au milieu de la zone de rasage abdominal et étaler légèrement avec le côté lisse de l’extrémité du pipeteur pour la disperser uniformément.
- À 30 s après la stimulation DNFB, placez les souris dans des cages vides sans litière pour les empêcher de frotter la solution DNFB. Lorsque la solution de DNFB est complètement sèche (environ 2 min), remettez les souris dans leur cage d’origine.
- Portez des gants lorsque vous manipulez la solution DNFB car elle est fortement irritante pour la peau humaine.
3. Stimulation de la sensibilisation à l’oreille
- Préparez une solution de DNFB à 0,2% comme ci-dessus, la solution du véhicule (un mélange 4: 1 d’acétone et d’huile d’olive) et de l’eau pure.
- Orientez le corps de la souris et faites en sorte que le bord extérieur de l’oreillette soit orienté vers le bas pendant toute l’opération pour empêcher la solution de pénétrer dans le conduit auditif pendant la stimulation DNFB.
- Les jours 4, 6, 8 et 10, utilisez un pipeteur pour appliquer 20 μL de la solution de DNFB à 0,2 % ou de la solution du véhicule lentement et uniformément sur la surface interne des oreillettes gauches des souris. Pour éviter que la solution de DNFB ne pénètre dans le conduit auditif, utilisez le côté lisse de l’embout de la pipette pour répartir délicatement la solution de DNFB pendant l’administration. Laissez l’oreille droite non traitée (Figure 2C).
- Attendez que la solution de DNFB soit sèche et replacez les souris dans la cage (environ 30 s).
- Portez des gants lorsque vous manipulez la solution DNFB.
4. Enregistrement du poids de la souris et des symptômes de la DCA
- Pesez la souris tous les jours, commencez le jour 1 et comparez avec son poids correspondant le jour 0; évaluer l’effet de la DCA sur le poids corporel des souris sous forme de changement de poids (g) ± erreur-type de la moyenne (MEB).
- Prenez des photos haute résolution des oreilles de souris pour enregistrer les symptômes cliniques de la DCA tous les 2 jours, à partir du jour 1.
5. Mesure de l’épaisseur de l’oreillette
- Mesurez l’épaisseur de l’oreillette tous les 2 jours, à partir du jour 1. Mesurez et notez les deux oreilles en détail.
- Utilisez des étriers vernier (voir le tableau des matériaux) pour mesurer l’épaisseur de l’oreillette à la même heure chaque jour afin d’obtenir des résultats précis (figure 3A). Empêchez les étriers vernier de continuer à serrer vers l’intérieur lorsqu’il y a un léger blocage, afin d’éviter d’endommager les tissus de l’oreille de la souris. Gardez la position fixe et enregistrez les données.
- Collectez l’épaisseur à trois endroits différents sur chaque oreillette (Figure 3B). Notez la moyenne des trois données comme valeur valide. Évaluer le gonflement de l’oreille en micromètres (μm) ±erreur type de la moyenne (MEB).
6. Évaluation du degré de gonflement inflammatoire
- Préparer la solution de colorant bleu Evans à 0,5 % (voir le tableau des matières) : diluer le colorant bleu Evans avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) le jour 11. Portez une blouse de laboratoire et des gants en tout temps, car le colorant bleu Evans est légèrement toxique pour les humains.
- Immobiliser les souris avec un fixateur: ouvrez le couvercle du fixateur (voir Tableau des matériaux), tenez la queue de la souris, faites en sorte que la tête de la souris fasse face au fixateur et faites grimper instinctivement la souris dans le fixateur. Couvrez le couvercle, faites sortir la queue de souris du trou sur le couvercle et ajustez la longueur du fixateur pour exposer toute la queue de la souris.
- Essuyez la queue à plusieurs reprises avec une boule de coton alcoolisé ou faites-la tremper dans de l’eau tiède pendant 30 s et pincez doucement la racine de la queue pour remplir et élargir les veines des deux côtés. Effectuer l’injection sous l’irradiation d’une source de lumière froide.
- Injecter lentement la solution de colorant bleu Evans dans la veine de la queue de la souris à l’aide d’une aiguille à insuline de 1 mm. Attendez 15 minutes, puis prenez des photos des oreilles de la souris.
REMARQUE: Placez la souris sur la table et maintenez-la doucement pour exposer la région de l’oreille pour l’acquisition d’image. Peu de temps après l’injection avec la solution de colorant bleu Evans et en observant les indications correspondantes, utilisez la luxation cervicale pour euthanasier la souris.
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Representative Results
Sous stimulation répétée du DNFB, les oreilles de souris du groupe DNFB présentaient des symptômes cliniques évidents comparables à ceux de la DCA, avec des zones sensibles présentant les symptômes typiques de rougeur, de sécheresse et même d’érosion et d’exsudation. Cependant, l’administration d’eau pure (groupe témoin) ou de solvant témoin (groupe véhicule) n’a pas produit de symptômes similaires (figure 4).
Pendant ce temps, dans le groupe DNFB, par rapport à l’oreille droite non traitée, l’épaisseur de l’oreille gauche a augmenté de manière significative après la stimulation DNFB (Figure 5A), alors qu’il n’y avait pas de différence significative entre les groupes témoin et véhicule (Figure 5B). Les oreilles gauches des souris du groupe DNFB sont évidemment devenues bleu foncé après l’injection de colorant bleu Evans le 11ème jour de modélisation, qui était visuellement différent de l’oreille droite. Cependant, les oreilles gauche et droite des souris des groupes témoin et véhicule étaient approximativement de la même couleur (figure 5C).
De plus, les changements de poids corporel des souris ont été analysés. La prise de poids chez la souris a été légèrement ralentie par la DNFB ou une simple stimulation du véhicule (Figure 6A), mais n’a pas entraîné de perte de poids significative (Figure 6B). Simultanément, la rate a été isolée immédiatement après le sacrifice des souris. L’indice de rate a été calculé en fonction du poids de la souris et du poids de la rate; La formule de calcul était la suivante :
Indice de rate = poids de la rate (g) / poids corporel (g) x 100
Le résultat montre que la stimulation répétée de DNFB dans l’oreille de la souris a entraîné une hypertrophie de la rate (Figure 6C) et une augmentation de l’indice de rate (Figure 6D), alors que l’indice de rate des souris du groupe de véhicules n’a pas changé de manière significative. Il a été prouvé que sous la stimulation de DNFB, la fonction de réponse immunitaire des souris du groupe DNFB était hyperactive.
Figure 1 : Diagramme schématique de l’axe temporel de moulage ACD. Les flèches indiquent ce qui a été fait au moment correspondant. Les opérations connexes comprennent le rasage, la sensibilisation, la mesure de l’oreillette, la pesée, la prise de photos et l’application de colorant bleu Evans. Abréviations : DNFB = 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: La méthode de fonctionnement de l’établissement modèle ACD . (A) Manipulation du rasage abdominal. (B) Manipulation de la stimulation sensibilisante abdominale. (C) Manipulation de la stimulation sensibilisante à l’oreille. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Méthode d’évaluation du gonflement de l’oreille . (A) Manipulation des mesures de l’épaisseur de l’oreille chez la souris. (B) Les sites de mesure de l’épaisseur de l’oreille chez la souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Image représentative de l’effet de l’administration de DNFB sur les oreilles des souris au fil du temps. (A) Groupe témoin. (B) Groupe de véhicules. (C) Groupe DNFB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Effet de l’administration de DNFB sur le gonflement de l’oreille chez la souris. (A) Différence d’épaisseur de l’oreille entre les oreilles gauche et droite des souris pendant la modélisation. (B) Comparaison de l’épaisseur de l’oreille gauche et de l’oreille droite des souris de chaque groupe à la fin de la modélisation. (C) Effet de l’administration de DNFB sur la perméabilité vasculaire de l’oreille chez la souris. (n = 6. ***p < 0,001, comparaison entre l’oreille droite et l’oreille gauche; N.S. = Non significatif). Toutes les données ont été exprimées sous forme de moyenne ± SEM. Différentes analyses de traitement entre les groupes ont été analysées à l’aide d’un test t non apparié ou d’une analyse unidirectionnelle de la variance avec le test de Dunnett. p valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Effets de l’administration de DNFB sur le poids corporel et l’indice de rate chez la souris. (A) Changements de poids corporel des souris de chaque groupe au cours de la modélisation. (B) Comparaison des changements de poids corporel chez les souris de chaque groupe au jour 11. (C) Comparaison de la taille de la rate dans chaque groupe de souris. (D) Comparaison de l’indice de rate entre groupes de souris. (n = 6. *p < 0,05, par rapport au groupe témoin; N.S. = Non significatif). Toutes les données ont été exprimées sous forme de moyenne ± SEM. Différentes analyses de traitement entre les groupes ont été analysées à l’aide d’un test t non apparié ou d’une analyse unidirectionnelle de la variance avec le test de Dunnett. p valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici pour induire des symptômes semblables à ceux de la DCA dans les oreilles des souris peut être utilisé pour étudier la physiopathologie de la DCA et comme outil de dépistage pour le développement de nouveaux médicaments.
Il y a deux étapes clés pour établir un modèle de DCA : la sensibilisation initiale et la stimulation subséquente. L’abdomen est généralement le site de la sensibilisation initiale, mais le site de stimulation subséquente a été choisi légèrement différemment. Des études antérieures ont montré que la plupart des chercheurs choisissent d’utiliser des sensibilisants chimiques tels que DNFB / DNCB ou oxazolone pour établir des modèles ACD sur le dos ou le cou des souris, et il est inévitable d’utiliser des lames ou des tondeuses pour épiler la zone de modélisation des souris17,18,19. Cependant, cette étape peut facilement détruire la barrière cutanée et affecter les expériences ultérieures. En outre, le médicament dégoulinant est difficile à répartir uniformément et est facilement absorbé par les cheveux voisins, en raison de la grande surface sur la nuque et de l’influence des cheveux environnants.
Dans ce protocole expérimental, nous avons constaté que l’exécution de la manipulation pour une stimulation ultérieure dans la surface interne des oreillettes de souris nous permettait d’atténuer certains des problèmes ci-dessus, aidant à établir un modèle ACD stable et hautement reproductible. Conformément à nos expériences répétées20, nous avons également optimisé et ajusté l’intervalle du stimulus sensibilisant et la période expérimentale. Conformément à la méthode expérimentale donnée, un effet de modélisation très évident peut être obtenu le 10ème jour. De plus, comme la zone de modélisation se trouve sur la face interne relativement indépendante de l’oreillette, sur laquelle les facteurs externes ont moins d’interférences, il y a moins de différence dans la gravité de l’ACD chez les souris du même groupe expérimental dans cette expérience.
Ce protocole expérimental présente également certaines lacunes. Tout d’abord, l’application de sensibilisants chimiques à l’oreille doit être effectuée avec prudence pour éviter que les produits chimiques ne pénètrent dans le conduit auditif et nuisent aux souris. Deuxièmement, les modèles ACD sont souvent utilisés comme moyen d’étudier les démangeaisons chroniques chez la souris. Dans le modèle ACD établi sur la nuque des souris, les épisodes de grattage chez les souris ont pu être observés intuitivement, et la gravité du symptôme de démangeaison chez la souris a pu être mesurée par cela. Bien que le comportement de grattage ait également été observé chez les souris au cours de notre expérience, les souris avaient également des habitudes spontanées de nettoyage des oreilles, ce qui rendait difficile la distinction du comportement de grattage pathologique. Cela a limité l’utilisation de ce modèle dans l’observation du comportement de grattage induit par la DCA. L’applicabilité du protocole à ce type d’étude doit faire l’objet d’une vérification expérimentale plus poussée.
Pour suivre l’évolution pathologique de la DCA, diverses méthodes de surveillance ont été utilisées, telles que les symptômes cliniques de l’oreille, la mesure de l’épaisseur de l’oreille et la réflexion de la perméabilité vasculaire. Ces indicateurs pathologiques sont plus visibles dans l’oreille que dans la peau du cou et du dos. Lors de la mesure de l’épaisseur de l’oreille d’une souris, des erreurs de mesure se produiront en raison du comportement de la souris et de l’épaisseur inégale de l’oreille. Pour réduire les erreurs de mesure, les mesures doivent être effectuées à trois endroits différents sur chaque oreille. En injectant du colorant Evans pour évaluer la perméabilité vasculaire de la zone modélisée, la gravité de la dermatite peut être observée, mais cela nécessite également un taux de réussite élevé de l’injection de la veine de la queue. Si une analyse comparative plus approfondie est nécessaire, l’absorbance du surnageant de l’homogénat de tissu de l’oreille de souris peut être déterminée.
Il convient également de mentionner que, dans notre recherche précédente20, la structure du tissu de l’oreille était bien organisée et moins affectée par d’autres structures tissulaires désordonnées (par exemple, les follicules pileux), que dans le tissu cutané du cou et du dos, ce qui a conduit à choisir cette zone pour la recherche.
En conclusion, le modèle de DCA décrit dans cet article est une méthode de modélisation stable et efficace et mérite d’être promu dans les études ultérieures sur la dermatite de contact allergique.
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Disclosures
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC) à N.-N. Y. (81904212); Projet scientifique et technologique de médecine traditionnelle chinoise du Jiangsu (YB201995); et le Projet spécial de financement pour les chercheurs postdoctoraux en Chine (2020T130562).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
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