Summary
यहां, हम 1-फ्लोरो-2,4-डाइनिट्रोबेंजीन (डीएनएफबी) द्वारा माउस कानों में एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन को प्रेरित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं और एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन की गंभीरता का मूल्यांकन कैसे करें।
Abstract
त्वचा मानव शरीर की रक्षा की पहली पंक्ति है और पर्यावरणीय रसायनों के लिए सबसे अधिक उजागर अंगों में से एक है। एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन (एसीडी) एक सामान्य त्वचा रोग है जो स्थानीय दाने, लालिमा और त्वचा के घावों के रूप में प्रकट होता है। एसीडी की घटना और विकास आनुवंशिक और पर्यावरणीय दोनों कारकों से प्रभावित होते हैं। यद्यपि कई विद्वानों ने हाल के वर्षों में एसीडी के मॉडल की एक श्रृंखला का निर्माण किया है, इन मॉडलों के प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सभी अलग-अलग हैं, जिससे पाठकों के लिए उन्हें अच्छी तरह से स्थापित करना मुश्किल हो जाता है। इसलिए, एटोपिक डर्मेटाइटिस के रोगजनन का आगे अध्ययन करने के लिए एक स्थिर और कुशल पशु मॉडल का बहुत महत्व है। इस अध्ययन में, हम चूहों के कानों में एसीडी जैसे लक्षणों को प्रेरित करने के लिए 1-फ्लोरो-2,4-डाइनिट्रोबेंजीन (डीएनएफबी) का उपयोग करके एक मॉडलिंग विधि का विस्तार करते हैं और मॉडलिंग के दौरान जिल्द की सूजन की गंभीरता का आकलन करने के लिए कई तरीकों का वर्णन करते हैं। इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को कुछ प्रयोगों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है और एसीडी अनुसंधान के क्षेत्र में एक निश्चित प्रचार भूमिका है।
Introduction
एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन (एसीडी) एक सामान्य त्वचा रोग है जो संपर्क स्थल पर एक्जिमा जैसे लक्षणों, मध्यम मामलों में एडिमा और एरिथेमा, औरगंभीर मामलों में पपुल, क्षरण, उत्सर्जन या यहां तक कि बड़े पैमाने पर निशान की विशेषता है। यह 20% आबादी को प्रभावित करता है और किसी भी उम्र के लोगों को प्रभावित कर सकताहै। एसीडी अक्सर उन व्यक्तियों में होता है जो बार-बार एलर्जी के संपर्क में आते हैं और अपने घर या कार्यस्थल में एक या अधिक एलर्जी के लिए व्यक्ति की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण हो सकतेहैं। टाइप IV विलंबित अतिसंवेदनशीलता को एसीडी4 में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मुख्य प्रकार माना जाता है। त्वचा के उन क्षेत्रों में जो बार-बार एलर्जी के संपर्क में आते हैं, परिसंचारी मेमोरी टी कोशिकाएं बड़ी संख्या में जमा होती हैं और प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करती हैं 3,5,6. इस काम का उद्देश्य एसीडी के विकास में प्रतिरक्षाविज्ञानी और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की आगे की जांच के लिए एक विश्वसनीय प्रयोगशाला तकनीक का प्रस्ताव करना है।
एसीडी की शुरुआत आमतौर पर रसायनों के बार-बार संपर्क के कारण संपर्क अतिसंवेदनशीलता के कारण होती है। कई शोधकर्ताओं ने बीमारी की शुरुआत का अनुकरण करने के लिए पिछले कुछ दशकों के दौरान घर के चूहों7,8, गिनी सूअरों 9,10 और अन्य जानवरों में विभिन्न एसीडी पशु मॉडल विकसित किए हैं। अधिकांश प्रयोगात्मक विधियों में दो चरण होते हैं: पेट संवेदीकरण (प्रेरण) और पीठ या कान लोब (उत्तेजना) पर उत्तेजना प्रदान करना। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले रासायनिक पदार्थों में मुख्य रूप से 1-फ्लोरो-2,4-डाइनिट्रोबेंजीन (डीएनएफबी)/1-क्लोरो-2,4-डाइनिट्रोबेंजीन (डीएनसीबी) 8,9,11, ऑक्साज़ोलोन 12, उरुशिओल 13, आदि शामिल हैं। उनमें से, DNFB और DNCB सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, पहली बार अक्टूबर 195810 में रिपोर्ट किए गए थे। निकल संवेदीकरण मॉडल14 और फोटोएलर्जिक संपर्क जिल्द की सूजन मॉडल15 का भी अक्सर उपयोग किया जाता है।
हम एसीडी मॉडल के निर्माण के लिए एक प्रयोगात्मक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि को पिछले अध्ययनों के आधार पर और कई प्रयोगों के साथ तुलना पर संक्षेप और अनुकूलित किया गया है। अन्य एसीडी मॉडल की तुलना में, इस मॉडल के कुछ फायदे हैं, जैसे कि छोटे व्यक्तिगत अंतर, छोटी प्रयोगात्मक अवधि, रासायनिक उत्तेजना की एक छोटी मात्रा, आदि। इसके अलावा, यह अध्ययन चूहों पर लागू होता है, जो न केवल किफायती हैं, बल्कि जीन नॉकआउट या ट्रांसजेनिक चूहों की तैयारीके लिए अधिक विकल्प भी हैं। हम प्रयोग में एसीडी प्रगति की निगरानी के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न तरीकों का भी वर्णन करते हैं, जैसे कि कान की मोटाई मापना, भड़काऊ उत्सर्जन को मापने के लिए इवांस ब्लू डाई का उपयोग करना, आदि। यह मॉडल न केवल एसीडी के रोगजनन का पता लगाने के लिए प्रयोगशाला के माध्यम से माउस कान, रक्त, प्लीहा और अन्य नमूनों का विश्लेषण कर सकता है, बल्कि नए चिकित्सीय तरीकों के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के लिए भी लागू होता है, जिसका एक निश्चित प्रचार महत्व है।
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Protocol
चूहों की सभी देखभाल और उपचार यंग्ज़हौ विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा स्थापित दिशानिर्देशों के अनुसार थे और परियोजना लाइसेंस एसवाईएक्सके (एसयू) 2022-0044 के तहत संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे। इस अध्ययन में 6-8 सप्ताह की आयु के पुरुष और महिला चूहों का उपयोग किया गया था। प्रत्येक समूह में छह चूहे शामिल थे ( सामग्री की तालिका देखें)। पिंजरों को एक तापमान-नियंत्रित कक्ष (22 ± 2 डिग्री सेल्सियस, 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र) में भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ रखा गया था। एक प्रयोगात्मक प्रवाह आरेख चित्र 1 में दिखाया गया है।
1. पशु तैयारी
- पर्यावरण के अनुकूल होने के 1 सप्ताह के बाद मॉडलिंग शुरू करें।
- चूहों को हेरफेर करने से पहले पर्यावरण और काउंटरटॉप्स को साफ और कीटाणुरहित करने के लिए एक पराबैंगनी दीपक और 75% अल्कोहल कीटाणुनाशक का उपयोग करें।
नोट: बाहरी कारकों के प्रभाव से बचने के लिए, पहचान के लिए चूहों को चिह्नित करना माउस कान पर नहीं किया जा सकता है; पीठ पर या पूंछ पर धुंधलापन एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। - चूहों के पेट में साबुन का पानी लगाने के लिए एक छोटे कपास के फाहे का उपयोग करें (आकार में लगभग 1-2 सेमी2 )। मॉडलिंग की शुरुआत में ब्लेड या शेवर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ बालों के विकास की दिशा में क्षेत्र को शेव करें (दिन 0; चित्रा 2 ए)।
नोट: बालों को हटाने के लिए एक सीधे रेजर ब्लेड के उपयोग के लिए एक कुशल ऑपरेटर की आवश्यकता होती है। यदि सही तरीके से प्रदर्शन नहीं किया जाता है, तो यह त्वचा में जलन पैदा कर सकता है। बालों को हटाने के लिए डिपिलेटरी क्रीम, क्लिपर्स या एक सुरक्षा रेजर का उपयोग करने पर विचार करें। - माउस का वजन करें और प्रत्येक समूह के बीच वजन परिवर्तन की तुलना करें।
2. पेट संवेदीकरण उत्तेजना
- शेविंग से प्रेरित पेट की त्वचा पर किसी भी मामूली चोट की पूरी वसूली सुनिश्चित करें। शेविंग (दिन 2) के 2 दिन बाद पेट की संवेदनशीलता लागू करें।
- 0.5% DNFB समाधान तैयार करें: DNFB को एसीटोन: जैतून के तेल के मिश्रण के साथ 4: 1 अनुपात में पतला करें (उदाहरण के लिए, 400 μL एसीटोन को जैतून के तेल के 100 μL के साथ मिलाया जाता है; सामग्री की तालिका देखें)। DNFB समाधान को अच्छी तरह से मिलाने के लिए 20 बार उड़ाने और मिश्रण करने के लिए एक पिपेट गन का उपयोग करें। माउस के लिए DNFB समाधान के प्रत्येक प्रशासन से पहले, इसे तीन से पांच बार उड़ाएं और मिलाएं।
नोट: उपयोग करने से पहले समाधान तैयार करें और इसे सीधे सूरज की रोशनी से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। - पिपेटर के साथ चूहों के पेट पर मुंडा क्षेत्र की त्वचा पर 0.5% DNFB समाधान के 25 μL लागू करें (चित्रा 2 बी)।
- पेट के शेविंग क्षेत्र के बीच में डीएनएएफबी समाधान को ड्रिबल करें और इसे समान रूप से फैलाने के लिए पिपेटर टिप के चिकनी तरफ के साथ हल्के से फैलाएं।
- DNFB उत्तेजना के 30 सेकंड बाद, चूहों को बिस्तर के बिना खाली पिंजरों में रखें ताकि उन्हें DNFB समाधान से रगड़ने से रोका जा सके। जब DNFB समाधान पूरी तरह से सूख जाता है (लगभग 2 मिनट), चूहों को उनके मूल पिंजरे में वापस कर दें।
- DNFB समाधान को संभालते समय दस्ताने पहनें क्योंकि यह मानव त्वचा को दृढ़ता से परेशान करता है।
3. कान संवेदीकरण उत्तेजना
- ऊपर के रूप में 0.2% DNFB समाधान तैयार करें, वाहन समाधान (एसीटोन और जैतून के तेल का 4: 1 मिश्रण), और शुद्ध पानी।
- माउस बॉडी को उन्मुख करें और DNFB उत्तेजना के दौरान समाधान को कान नहर में प्रवेश करने से रोकने के लिए पूरे ऑपरेशन के दौरान ऑरिकल चेहरे की बाहरी सीमा को नीचे की ओर बनाएं।
- 4, 6, 8 और 10 दिनों में, 0.2% DNFB समाधान या वाहन समाधान के 20 μL को धीरे-धीरे और समान रूप से चूहों के बाएं ऑरिकल्स की आंतरिक सतह पर लागू करने के लिए एक पिपेटर का उपयोग करें। DNFB समाधान को कान नहर में प्रवेश करने से रोकने के लिए, प्रशासन के दौरान DNFB समाधान को धीरे से वितरित करने के लिए पिप्टर टिप के चिकनी पक्ष का उपयोग करें। दाहिने कान को अनुपचारित छोड़ दें (चित्रा 2 सी)।
- डीएनएफबी समाधान सूखने तक प्रतीक्षा करें और चूहों को पिंजरे (लगभग 30 सेकंड) में वापस रखें।
- DNFB समाधान को संभालते समय दस्ताने पहनें।
4. माउस वजन और एसीडी लक्षणों को रिकॉर्ड करना
- हर दिन माउस का वजन करें, दिन 1 पर शुरू करें, और दिन 0 पर इसके संबंधित वजन के साथ तुलना करें; वजन परिवर्तन (जी) ± औसत (एसईएम) की मानक त्रुटि के रूप में चूहों के शरीर के वजन पर एसीडी के प्रभाव का मूल्यांकन करें।
- 1 दिन से शुरू होने वाले हर 2 दिनों में एसीडी नैदानिक लक्षणों को रिकॉर्ड करने के लिए माउस कानों की उच्च रिज़ॉल्यूशन तस्वीरें लें।
5. ऑरिकल मोटाई का माप।
- दिन 1 से शुरू होने वाले हर 2 दिनों में ऑरिकल मोटाई को मापें। दोनों कानों को विस्तार से मापें और रिकॉर्ड करें।
- सटीक परिणामों के लिए प्रत्येक दिन एक ही समय में ऑरिकल मोटाई को मापने के लिए वर्नियर कैलिपर्स ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें (चित्रा 3 ए)। माउस कान को ऊतक क्षति को रोकने के लिए, थोड़ी सी रुकावट होने पर वर्नियर कैलिपर्स को अंदर की ओर क्लैंपिंग जारी रखने से रोकें। स्थिति तय रखें और डेटा रिकॉर्ड करें।
- प्रत्येक ऑरिकल पर तीन अलग-अलग स्थानों से मोटाई एकत्र करें (चित्रा 3 बी)। तीन डेटा के औसत को एक मान्य मान के रूप में रिकॉर्ड करें। माइक्रोमीटर (μm) में कान की सूजन का मूल्यांकन माध्य (SEM) की मानक त्रुटि के ± करें।
6. सूजन सूजन की डिग्री का मूल्यांकन
- 0.5% इवांस ब्लू डाई ( सामग्री की तालिका देखें) समाधान तैयार करें: 11 वें दिन फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ पतला इवांस ब्लू डाई। हर समय एक लैब कोट और दस्ताने पहनें, क्योंकि इवांस ब्लू डाई मनुष्यों के लिए थोड़ा विषाक्त है।
- एक फिक्सेटर के साथ चूहों को गतिहीन करें: फिक्सेटर का ढक्कन खोलें ( सामग्री की तालिका देखें), माउस पूंछ को पकड़ें, माउस के सिर को फिक्सेटर का सामना करें, और माउस को सहज रूप से फिक्सेटर में चढ़ें। ढक्कन को कवर करें, माउस पूंछ को ढक्कन पर छेद से बाहर लाएं, और पूरे माउस पूंछ को उजागर करने के लिए फिक्सेटर की लंबाई को समायोजित करें।
- अल्कोहल कॉटन बॉल से पूंछ को बार-बार पोंछें या इसे 30 सेकंड के लिए गर्म पानी में भिगोदें, और दोनों तरफ नसों को भरने और विस्तारित करने के लिए पूंछ की जड़ को धीरे से चुटकी लें। एक ठंडे प्रकाश स्रोत के विकिरण के तहत इंजेक्शन करें।
- धीरे-धीरे 1 मिमी इंसुलिन सुई का उपयोग करके माउस पूंछ की नस में इवांस ब्लू डाई समाधान इंजेक्ट करें। 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें और फिर माउस कानों की तस्वीरें लें।
नोट: मेज पर माउस रखें और छवि अधिग्रहण के लिए कान क्षेत्र को उजागर करने के लिए धीरे से इसे पकड़ें। इवांस ब्लू डाई समाधान के साथ इंजेक्शन के तुरंत बाद और संबंधित संकेतों को देखते हुए, माउस को इच्छामृत्यु करने के लिए ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करें।
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Representative Results
बार-बार DNFB उत्तेजना के तहत, DNFB समूह के माउस कानों ने एसीडी की तुलना में स्पष्ट नैदानिक लक्षण प्रदर्शित किए, संवेदनशील क्षेत्रों में लालिमा, सूखापन और यहां तक कि क्षरण और उत्सर्जन के विशिष्ट लक्षण दिखाई दिए। हालांकि, शुद्ध पानी (नियंत्रण समूह) या विलायक नियंत्रण (वाहन समूह) के कान प्रशासन ने समान लक्षण पैदा नहीं किए (चित्रा 4)।
इस बीच, डीएनएफबी समूह में, अनुपचारित दाएं कान की तुलना में, डीएनएफबी उत्तेजना (चित्रा 5 ए) के बाद बाएं कान की मोटाई में काफी वृद्धि हुई, जबकि नियंत्रण और वाहन समूहों (चित्रा 5 बी) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। मॉडलिंग के 11 वें दिन इवांस ब्लू डाई के इंजेक्शन के बाद डीएनएफबी समूह के चूहों के बाएं कान स्पष्ट रूप से गहरे नीले हो गए, जो दाएं कान से अलग था। हालांकि, नियंत्रण और वाहन समूहों में चूहों के बाएं और दाएं कान लगभग एक ही रंग के थे (चित्रा 5 सी)।
इसके अलावा, चूहों के शरीर के वजन में परिवर्तन का विश्लेषण किया गया था। माउस का वजन DNFB या सरल वाहन उत्तेजना (चित्रा 6 ए) द्वारा थोड़ा धीमा हो गया था, लेकिन इसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण वजन घटाने (चित्रा 6 बी) नहीं हुआ। इसके साथ ही, चूहों की बलि के तुरंत बाद तिल्ली को अलग कर दिया गया था। प्लीहा सूचकांक की गणना माउस के वजन और प्लीहा के वजन के अनुसार की गई थी; गणना सूत्र निम्नानुसार था:
तिल्ली सूचकांक = तिल्ली का वजन (जी) / शरीर का वजन (जी) x 100
परिणाम से पता चलता है कि माउस कान में बार-बार DNFB उत्तेजना के परिणामस्वरूप प्लीहा वृद्धि (चित्रा 6 सी) और प्लीहा सूचकांक (चित्रा 6 डी) में वृद्धि हुई, जबकि वाहन समूह में चूहों के तिल्ली सूचकांक में काफी बदलाव नहीं हुआ। यह साबित हुआ कि DNFB की उत्तेजना के तहत, DNFB समूह में चूहों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया समारोह अति सक्रिय था।
चित्र 1: एसीडी मोल्डिंग समय अक्ष का योजनाबद्ध आरेख। तीर इंगित करते हैं कि उसी समय क्या किया गया था। इसमें शामिल संबंधित कार्यों में शेविंग, संवेदीकरण, ऑरिकल माप, वजन, फोटो लेना और इवांस ब्लू डाई एप्लिकेशन शामिल हैं। संक्षेप: DNFB = 1-फ्लोरो-2,4-डाइनिट्रोबेंजीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: एसीडी मॉडल स्थापना की संचालन विधि । (ए) पेट की शेविंग में हेरफेर। (बी) पेट संवेदनशील उत्तेजना में हेरफेर। (सी) कान संवेदनशील उत्तेजना का हेरफेर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: कान की सूजन की मूल्यांकन विधि। (ए) चूहों में कान की मोटाई माप का हेरफेर। (बी) चूहों में कान की मोटाई माप की साइटें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: समय के साथ चूहों के कानों पर DNFB प्रशासन के प्रभाव का प्रतिनिधि चित्र । (ए) नियंत्रण समूह। (बी) वाहन समूह। (सी) डीएनएफबी समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: चूहों में कान की सूजन पर डीएनएफबी प्रशासन का प्रभाव। (ए) मॉडलिंग के दौरान चूहों के बाएं और दाएं कानों के बीच कान की मोटाई में अंतर। (बी) मॉडलिंग के अंत में प्रत्येक समूह में चूहों के बाएं और दाएं कान की मोटाई की तुलना। (सी) चूहों में कान संवहनी पारगम्यता पर डीएनएएफबी प्रशासन का प्रभाव। (n = 6. ***p < 0.001, दाएं कान और बाएं कान के बीच तुलना; N.S. = कोई महत्वपूर्ण नहीं)। समूहों ±के बीच विभिन्न उपचार विश्लेषणों का विश्लेषण एक अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट या डंनेट के परीक्षण के साथ भिन्नता के एक-तरफा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था। 0.05 से कम पी मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: चूहों में शरीर के वजन और प्लीहा सूचकांक पर डीएनएएफबी प्रशासन के प्रभाव। (ए) मॉडलिंग के दौरान प्रत्येक समूह में चूहों के शरीर के वजन में परिवर्तन। (बी) 11 वें दिन प्रत्येक समूह में चूहों में शरीर के वजन में परिवर्तन की तुलना। (सी) चूहों के प्रत्येक समूह में प्लीहा के आकार की तुलना। (डी) चूहों के समूहों के बीच प्लीहा सूचकांक की तुलना। (n = 6. *p < 0.05, नियंत्रण समूह की तुलना में; N.S. = कोई महत्वपूर्ण नहीं)। समूहों ±के बीच विभिन्न उपचार विश्लेषणों का विश्लेषण एक अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट या डंनेट के परीक्षण के साथ भिन्नता के एक-तरफा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था। 0.05 से कम पी मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
चूहों के कानों में एसीडी जैसे लक्षणों को प्रेरित करने के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग एसीडी के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने और नई दवाओं के विकास के लिए एक स्क्रीनिंग टूल के रूप में किया जा सकता है।
एसीडी मॉडल स्थापित करने के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं: प्रारंभिक संवेदीकरण, और बाद में उत्तेजना। पेट आमतौर पर प्रारंभिक संवेदीकरण की साइट है, लेकिन बाद की उत्तेजना साइट को थोड़ा अलग तरीके से चुना गया था। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि अधिकांश विद्वान चूहों की पीठ या गर्दन पर एसीडी मॉडल स्थापित करने के लिए डीएनएएफबी / डीएनसीबी या ऑक्साज़ोलोन जैसे रासायनिक सेंसिटाइज़र का उपयोग करना चुनते हैं, और चूहों के मॉडलिंग क्षेत्र17,18,19 को कम करने के लिए ब्लेड या ट्रिमर का उपयोग करना अपरिहार्य है। हालांकि, यह कदम आसानी से त्वचा की बाधा को नष्ट कर सकता है और बाद के प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, टपकने वाली दवा को समान रूप से वितरित करना मुश्किल है और गर्दन की झपकी पर बड़े क्षेत्र और आसपास के बालों के प्रभाव के कारण आस-पास के बालों द्वारा आसानी से अवशोषित किया जाता है।
इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में, हमने पाया कि माउस ऑरिकल्स की आंतरिक सतह में बाद की उत्तेजना के लिए हेरफेर करने से हमें उपरोक्त कुछ परेशानियों को कम करने में मदद मिली, जिससे एक स्थिर और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एसीडी मॉडल स्थापित करने में मदद मिली। हमारे दोहराए गए प्रयोगों20 के अनुसार, हमने संवेदनशील उत्तेजना और प्रयोगात्मक अवधि के अंतराल को भी अनुकूलित और समायोजित किया। दी गई प्रयोगात्मक विधि के अनुसार, 10 वें दिन एक बहुत ही स्पष्ट मॉडलिंग प्रभाव प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, जैसा कि मॉडलिंग क्षेत्र ऑरिकल के अपेक्षाकृत स्वतंत्र आंतरिक पक्ष पर है, जिस पर बाहरी कारकों का कम हस्तक्षेप होता है, इस प्रयोग में एक ही प्रयोगात्मक समूह में चूहों में एसीडी की गंभीरता में कम अंतर होता है।
इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल में कुछ कमियां भी हैं। सबसे पहले, कान में रासायनिक सेंसिटाइज़र लगाने से सावधानी के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए ताकि कान नहर में प्रवेश करने वाले रसायनों से बचा जा सके और चूहों को नुकसान पहुंचाया जा सके। दूसरे, एसीडी मॉडल अक्सर चूहों में पुरानी खुजली का अध्ययन करने के साधन के रूप में उपयोग किया जाता है। चूहों की झपकी पर स्थापित एसीडी मॉडल में, चूहों में खरोंच के मुकाबलों को सहज रूप से देखा जा सकता है, और चूहों में खुजली के लक्षण की गंभीरता को इसके द्वारा मापा जा सकता है। यद्यपि हमारे प्रयोग के दौरान चूहों में खरोंच व्यवहार भी देखा गया था, चूहों में सहज कान-सफाई की आदतें भी थीं, जिससे पैथोलॉजिकल खरोंच व्यवहार से अंतर करना मुश्किल हो गया। इसने एसीडी-प्रेरित खरोंच व्यवहार को देखने में इस मॉडल के उपयोग को सीमित कर दिया। प्रोटोकॉल इस प्रकार के अध्ययन पर लागू होता है या नहीं, यह आगे प्रयोगात्मक सत्यापन के अधीन है।
एसीडी के पैथोलॉजिकल कोर्स को ट्रैक करने के लिए, विभिन्न प्रकार की निगरानी विधियों का उपयोग किया गया था, जैसे नैदानिक कान के लक्षण, कान मोटाई माप और संवहनी पारगम्यता का प्रतिबिंब। ये पैथोलॉजिकल संकेतक गर्दन और पीठ की त्वचा की तुलना में कान में अधिक दिखाई देते हैं। माउस के कान की मोटाई को मापते समय, माउस संघर्षपूर्ण व्यवहार और कान की असमान मोटाई के कारण माप त्रुटियां होंगी। मापने की गलतियों को कम करने के लिए, प्रत्येक कान पर तीन अलग-अलग स्थानों में माप किया जाना चाहिए। मॉडलिंग क्षेत्र की संवहनी पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए इवांस डाई को इंजेक्ट करके, डर्मेटाइटिस की गंभीरता को देखा जा सकता है, हालांकि, इसके लिए पूंछ शिरा इंजेक्शन की उच्च सफलता दर की भी आवश्यकता होती है। यदि आगे तुलनात्मक विश्लेषण की आवश्यकता होती है, तो माउस कान के ऊतक होमोजेनेट के सुपरनैटेंट का अवशोषण निर्धारित किया जा सकता है।
यह भी ध्यान देने योग्य है कि, हमारे पिछले शोध20 में, कान के ऊतक संरचना अच्छी तरह से संगठित थी और गर्दन और पीठ की त्वचा के ऊतकों की तुलना में अन्य अव्यवस्थित ऊतक संरचनाओं (जैसे, बालों के रोम) से कम प्रभावित थी, जिसके कारण अनुसंधान के लिए इस क्षेत्र को चुना गया।
निष्कर्ष में, इस पेपर में वर्णित एसीडी का मॉडल एक स्थिर और कुशल मॉडलिंग विधि है और एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन के बाद के अध्ययनों में पदोन्नति के योग्य है।
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Disclosures
लेखक ों ने इस काम में हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) द्वारा एन-एन द्वारा समर्थित किया गया था। वाई (81904212); जियांग्सू पारंपरिक चीनी चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (वाईबी 201995); और चीन में पोस्टडॉक्टरल शोधकर्ताओं के लिए विशेष वित्त पोषण परियोजना (2020T130562)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
References
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