Summary
涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。本文的目的是提出一种评估分 生孢子木霉 刺激的人外周血单核来源巨噬细胞的吞噬作用和清除能力的方法。
Abstract
巨噬细胞是一道重要的防线，负责防止病原体在不同组织中的生长和定植。分生孢子吞噬作用是一个关键过程，可以研究巨噬细胞 - 病原体相互作用中涉及的细胞质和分子事件，以及确定内化分生孢子的死亡时间。涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。吞噬作用的逃避和吞噬体的逃逸是真菌毒力的机制。在这里，我们报告了可用于分析 T. stromaticum conidia 的吞噬作用、清除率和活力的方法，分生孢子是一种用作生物防治和生物肥料剂并能够诱导人类感染的真菌。该方案包括 1） 木霉 培养，2） 洗涤以获得分生孢子，3） 使用聚蔗糖溶液方法分离外周血单核细胞 （PBMC） 并将 PBMC 分化为巨噬细胞，4） 使用圆形玻璃盖玻片和着色的 体外 吞噬作用方法，以及 5） 清除测定以评估分生孢子吞噬后的分生孢子活力。综上所述，这些技术可用于测量巨噬细胞的真菌清除效率。
Introduction
木霉属（木霉属：木霉属，科：木霉科木霉属）由无处不在的腐生真菌组成，这些真菌是其他真菌物种的寄生虫，能够产生一系列商业上有用的酶1。这些真菌种类用于生产异源蛋白质2，生产纤维素3，乙醇，啤酒，葡萄酒和造纸4，在纺织工业5，食品工业6中，以及在农业中作为生物控制剂7,8。除了对这些真菌物种的工业兴趣外，人类感染数量的增加使一些木霉物种具有机会性病原体的地位9。
木霉属在培养物中生长迅速，最初有白色和棉质菌落，然后变成黄绿色至深绿色10.它们适应生活在广泛的pH值和温度条件下，机会主义物种能够在生理pH值和温度下生存，因此可以在不同的人体组织中定植11,12,13。重要的是，木霉属感染率的上升可能与毒力因素有关，而这些因素尚未得到很好的研究。此外，专注于了解针对机会性木霉菌种的免疫反应的研究仍然很少见。
在感染期间，巨噬细胞与中性粒细胞一起代表负责吞噬作用的防线，从而防止病原体在不同组织中的生长和定植。使用模式识别受体，如Toll样受体和C型凝集素受体，巨噬细胞吞噬真菌并将它们加工成吞噬溶酶体，从而促进呼吸爆发，促炎细胞因子的释放，以及吞噬微生物的破坏14。然而，吞噬作用的机制可以受到不同微生物策略的影响和逃避，例如真菌细胞的大小和形状;存在阻碍吞噬作用的胶囊;减少吞噬诱导受体的数量;细胞质中肌动蛋白纤维结构的重塑;阻碍伪足的形成;吞噬体或吞噬溶酶体在吞噬过程后逃逸14.
许多病原体，包括新型隐球菌，利用巨噬细胞作为在宿主体内生存、传播和诱导感染的生态位15。吞噬作用和清除测定用于评估对病原体的免疫反应，并鉴定用于逃避先天免疫系统的微生物策略15,16,17。这种类型的技术还可用于检查吞噬作用、延迟吞噬体酸化和氧化爆发的差异动力学，这些动力学导致真菌杀伤减少18。
可以使用不同的方法来评估吞噬作用、真菌存活和吞噬体成熟过程的逃避。这些包括荧光显微镜，用于观察吞噬作用、细胞位置和吞噬作用过程中产生的分子19;流式细胞术，其提供吞噬作用的定量数据，并用于评估该过程中涉及的不同标志物20,21;活体显微镜，用于评估微生物捕获和吞噬体成熟22;抗体介导的吞噬作用，用于评估病原体吞噬过程的特异性23;和其他24,25,26,27。
这里介绍的方案采用一种通用的、低成本的、直接的方法，使用光学显微镜和平板生长测定来评估真菌分生孢子的吞噬作用和杀伤作用。该方案将为读者提供使用暴露于 基质锥虫的人外周血单核来源的巨噬细胞进行吞噬作用和清除测定的分步说明。之所以使用PBMC，是因为分生 孢子木霉 被用作对抗植物病原体的生物防治剂和全球植物作物的生物肥料，并引起了几种人类感染，称为木霉病。除此之外，之前只有两篇研究分生 孢子 与人类免疫系统之间相互作用的工作，其中我们研究了中性粒细胞28 和巨噬细胞29中的自噬。本文首先展示了如何研究PBMC衍生的巨噬细胞对 T. stromaticum 分生孢子的吞噬作用，然后如何使用基于显微镜的简单技术评估被吞噬的分生孢子的活力。该方案可以进一步促进对巨噬细胞相关免疫反应或免疫系统调节相关机制的研究。
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Protocol
伦理考虑和人类主体
本研究中描述的所有人类实验均根据《赫尔辛基宣言》和巴西联邦法律进行，并经圣克鲁斯州立大学伦理委员会批准（项目识别代码：550.382/ 2014）。
从巴西巴伊亚州伊列乌斯市的健康志愿者那里收集人类外周血，这些志愿者没有暴露于与所研究真菌相关的职业活动。有健康医疗状况或使用药物的个人被排除在外。所有受试者在参与本研究之前都自愿同意参与并签署了知情同意书。
1.试剂和溶液的制备
注意：在继续之前准备以下试剂和溶液。有关试剂和材料供应商的信息，请参阅 材料表 （TOM）。
- 制备平衡的无菌磷酸盐缓冲盐水溶液 1x （PBS）。
注意：在本方案中，未使用不含内毒素的PBS。 - 制备马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 培养基，并将 20 mL 倒入每个培养皿中用于 T. stromaticum 培养物。为每个供体准备六个带有PDA的板，并针对每种条件使用一块板：3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时。此外，每个对照使用三个板： 三个用于木霉 对照，三个用于R10培养基对照。使用 60 mm x 15 mm 或 100 mm x 15 mm 的培养皿以获得最佳分生孢子回收率。
- 灭菌100%甘油。
- 制备用于细胞培养的 R10 培养基：补充有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素（青霉素/链霉素）的 RPMI 培养基。
- 对蒸馏水进行灭菌以进行细胞裂解。
- 准备pH值为7.0的水进行着色过程。
注意：如有必要，使用 pH 计和 0.1 M/L NaOH 和 0.1 M/L HCl 溶液调节 pH。 - 对圆形玻璃盖玻片（13毫米）和镊子进行消毒。
2. 基质木霉培养和加工
- T. stromaticum母体（M1）的制备：
注意：需要母料（M1）以确保所有实验都是从同一新鲜代（F1）的培养物中完成的。- 在28°C的PDA培养皿中在黑暗中生长7-10天，直到观察到分生孢子并且培养物变绿。
- 洗涤 T. stromaticum 的培养物。使用移液管向培养表面加入 3-5 mL PBS。从平板中收集PBS，然后再次将其分配到培养物上，以使用移液管逐渐除去分生孢子。根据需要重复此过程，直到悬架变为深绿色。
注意：或者，建议通过向平板中加入 3-5 mL PBS 然后进行圆周运动来轻轻洗涤培养物，直到悬浮液变绿以回收分生孢子。通过反复移液，可以收集更多的分生孢子。 - 用移液管将回收的悬浮液从板转移到 15 mL 无菌管中。根据需要多次重复步骤 2.1.2-2.1.3 以获得更多分生孢子。
- 在12°C下以1,160× g 离心悬浮液5分钟，并将沉淀重悬于5mLPBS中。重复此步骤（2.1.4）三次以获得无菌丝悬浮液。
注意：为了正确重悬颗粒，离心后，建议进行短暂的涡旋。 - 将最终沉淀重悬于 2-3 mL PBS 中，并使用 1：100 或 1：1,000 的稀释度在 Neubauer 室中计数分生孢子。
注意：在最佳条件下，可以从培养物中回收2×108 conidia / mL的终浓度。 使用台盼蓝排除法评估分生孢子的活力是可选的。 - 通过向每个试管中加入 0.5 mL 分生孢子悬浮液（来自步骤 2.1.5），将悬浮液分装到 1.5 mL 无菌管中。然后，加入 0.5 mL 无菌 100% 甘油以获得 M1 原液。短暂涡旋，识别管，并在-20°C或-80°C下储存。
- T . stromaticum 的培养和获得用于实验的分生孢子
- 在28°C的PDA中，在黑暗中培养10μLM1悬浮液（在步骤2.1中制备）7-10天，直到观察到分生孢子并且培养物变绿以获得新鲜的F1一代。
注意：为确保实验的新鲜 基质锥虫 培养物，评估真菌生长所需的时间和巨噬细胞分化所需的时间。 - 收集分生孢子，重复步骤2.1.2-2.1.4。
- 将最终沉淀重悬于2-3mL PBS中。使用台盼蓝排除法评估分生孢子的活力，或按照步骤2.1.5中提到的分生孢子计数。
- 在28°C的PDA中，在黑暗中培养10μLM1悬浮液（在步骤2.1中制备）7-10天，直到观察到分生孢子并且培养物变绿以获得新鲜的F1一代。
3. 外周血单核细胞（PBMC）分离
注：PBMCs是使用密度为1.077 g / mL30的聚蔗糖溶液通过密度屏障法获得的。
- 将 15 mL 聚蔗糖溶液分装到一个 50 mL 试管中，用于将收集的每个供体样品。
- 使用三到四个 EDTA 管从每个献血者那里收集 20 mL 血液。每个实验至少招募四名供体。不要汇集献血者的血液;相反，将每个样品单独用作生物学重复。对于每个供体，将血液转移到一个 50 mL 管中，并加入 PBS 以获得 35 mL 的最终体积。
- 沿着含有聚蔗糖溶液的管壁缓慢转移血液悬浮液（步骤3.2）（步骤3.2）以形成双相悬浮液。
注意：为防止血液与聚蔗糖溶液混合，请缓慢加入血液。建议使用每位供体至少 7 mL 的血液进行 PBMC 分离。 - 立即将含有双相悬浮液的管以1,600× g 在24°C离心30分钟。 对 PBMC 的离心进行编程：使用加速 1 和减速 0 以避免离心突然停止。
- 观察离心后含有PBMC的白色环的形成。红细胞和粒细胞位于下层，下一层包含聚蔗糖溶液，PBMC 位于聚蔗糖溶液和血浆之间的白环（上层）。使用移液管或无菌巴斯德移液管轻轻吸气收集白环，以免捕获红细胞、血浆或聚蔗糖溶液，然后转移到一个 15 mL 试管中。
- 将 PBS 加入含有 PBMC 的 15 mL 管中，以获得 10 mL 的最终体积。匀浆悬浮液，并在24°C下以1,600× g 离心管30分钟。
- 用10mLPBS在24°C下以1,600× g 洗涤细胞3次，持续5分钟。然后，将最终沉淀重悬于 2 mL R10 培养基中。
- 使用台盼蓝排除法评估细胞活力，并在Neubauer室中计数细胞。
4. 吞噬动力学
注意：人外周血单核来源的巨噬细胞以1：10的感染多重性（MOI）或仅R10培养基作为对照用 T. stromaticum conidia 处理。感染的多重性 （MOI） 表示添加到感染目标的传染性病原体的比率，以绝对数字表示：MOI = 病原体：目标31。在这里，我们对 10 个巨噬细胞（靶标）使用 1 个 T. stromaticum 分生孢子（试剂）。然后，将细胞在37°C和5%CO2 下孵育不同时间段（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）。接下来，使用圆形玻璃盖玻片在显微镜下观察参与吞噬过程的贴壁巨噬细胞。提供了实验设计图（图1）。
注意：建议使用 24 孔板。
- 用 T. stromaticum 分生孢子治疗人源性巨噬细胞
- 使用无菌镊子向每个孔中加入无菌圆形玻璃盖玻片（13mm）。
- 将步骤3.7-3.8中获得的细胞悬液的体积调整至每孔板8×105 个细胞至最终体积为1mL，并含有R10培养基。使用倒置显微镜评估细胞形态。
注意：细胞必须悬浮在培养基中并具有圆形形态。 - 将细胞在37°C下在5%CO2 气氛下孵育7天，并每2天用新鲜的R10培养基替换培养基，以使单核细胞分化为巨噬细胞32。使用倒置显微镜观察细胞形态。巨噬细胞将呈现纺锤形形态，具有扁平和延伸的形状;还可以观察到细胞质比率增加和伪足的存在。寻找贴壁性单核来源的巨噬细胞。
注意：极小比例的未分化单核细胞可能仍悬浮在培养基中。 - 使用移液管除去每个孔的培养基，并用 1 mL PBS 洗涤细胞以除去碎片和非贴壁细胞。
- 使用步骤2.2中制备的悬浮液在R10培养基中制备终浓度为8×104分生孢子/ mL的T.stromaticum conidia的新悬浮液。
- 将步骤4.1.5制备的分生孢子悬浮液的1mL加入到每个处理孔（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）中，以获得1：10的MOI。在对照中，仅向孔中加入 1 mL R10 培养基。
- 在37°C下，在5%CO2气氛下用T. stromaticum conidia挑战巨噬细胞3小时。3小时后，除去培养基，洗涤细胞以除去未吞噬的分生孢子。
- 向每个孔中加入1mL R10培养基，并在37°C下在5%CO2 气氛下孵育板不同时间（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）。
- 着色和分析
- 在相应的孵育（步骤4.1.8）完成后，从每个孔中取出培养基，并向该孔中加入1mL PBS。
- 使用无菌镊子和针从孔中取出圆形玻璃盖玻片，用染色套件进行着色。
注意：或者，可以使用 May Grünwald-Giemsa染色剂 33 进行染色。 - 在每个圆形玻璃盖玻片中，加入染色固定剂（5 秒）、染料 1（5 秒）、染料 2（2 秒）和 pH 值为 7.0 的缓冲水（5 秒），这些都是染色套件的组成部分。等到它们干燥，然后使用封固剂将盖玻片固定在载玻片上。
- 量化结果：对每个时间条件的总共 100 个巨噬细胞 （Mø） 进行计数。使用光学显微镜，使用100倍物镜和浸油计算具有吞噬分生孢子的巨噬细胞的数量（公式[1]）。
（一） - 获得每个巨噬细胞吞噬的分生孢子数量：将 100 个巨噬细胞中存在的分生孢子除以具有至少一个吞噬分生孢子的巨噬细胞数量（等式 [2]）34。
（2）
注意：要评估和计数分生孢子，可以使用ImageJ 软件 35. - 使用40倍和100倍物镜拍摄每个样品和时间条件的吞噬作用，以呈现结果。
（一）
（2）
图 1：使用人外周血单核来源巨噬细胞的吞噬作用和分生孢子活力测定的示意图。 （1-10）吞噬作用测定：T. stromaticum 必须在 PDA 中生长，并通过用 PBS 洗涤板来回收分生孢子。PBMC应使用所述方案通过密度屏障法分离，在24孔板中用无菌圆形玻璃盖玻片培养7天以分化为巨噬细胞，然后以1：10的MOI处理，时间间隔不同。取出圆形玻璃盖玻片并用染色试剂盒染色，并使用光学显微镜分析结果。（1-8,11-13）分生孢子活力测定：分离后，将PBMC在没有圆形玻璃盖玻片的24孔板中培养7天，以分化为巨噬细胞，然后以不同时间间隔的MOI进行1：10处理。细胞必须通过与蒸馏水孵育来裂解;然后将悬浮液离心，然后将重悬的沉淀接种在PDA中，以分析木霉的生长动力学。该图是使用图像数据库设计的。请点击这里查看此图的较大版本.
5.吞噬作用后的分生孢子活力测定
注意：提供了实验设计图（图1）。
注意：使用 24 孔板。
- 用 T. stromaticum conidia 挑战人源性巨噬细胞。
- 重复步骤4.1.2-4.1.8区分单核细胞，并用分生 孢子锥虫 处理巨噬细胞。
注意： 不要在孔中使用圆形玻璃盖玻片。使用用于测定吞噬作用动力学的相同时间间隔，以便吞噬作用可以与分生孢子活力相关联。 - 通过使用步骤4.1.5（R10培养基+分生孢子）中制备的悬浮液作为对照，评估R10培养基对 T.基质 生长的影响。
- 重复步骤4.1.2-4.1.8区分单核细胞，并用分生 孢子锥虫 处理巨噬细胞。
- 分生孢子活力测定
- 在每个孵育期（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）后除去培养基，并用PBS洗涤细胞两次以除去未吞噬的分生孢子。
注意：含有R10培养基+分生孢子的对照品不应洗涤。 - 向每个孔中加入0.5mL无菌蒸馏水，并将板在37°C和5%CO2 下孵育30分钟。在此之后，在倒置显微镜下观察细胞形态，以确保细胞已被裂解。
- 收集悬浮液，并将其转移到 1.5 mL 试管中。在室温下使用6,000× g 的微型离心机离心悬浮液5分钟。
- 小心弃去上清液，将沉淀重悬于10μL无菌蒸馏水中，并将10μL悬浮液接种到28°C的含PDA的平板中。
- 制备基 质锥虫 生长的阳性对照：使用 基质锥虫 分生孢子的悬浮液（步骤2.2）制备终浓度为8×106 分生孢子/mL的新悬浮液。在黑暗中，在28°C的PDA中培养10μL该悬浮液。
注意：10μL该悬浮液将含有相同数量的分生孢子（8×104），该分生孢子用于感染血液单核来源的巨噬细胞。该阳性对照与步骤5.1.2中提到的对照之间的区别在于，上述步骤5.1.2中提到的对照用于评估R10培养基在吞噬作用期间对 木霉 生长的可能影响。步骤5.2.5中的阳性对照使用PBS中收集的 T. stromaticum conidia悬浮液代表了木 霉 生长的对照，而不受R10培养基的影响，以反映真菌如何自然生长。使用这种对照，可以评估 R10 培养基是否影响 木霉 的生长。 - 每天观察PDA中 T. stromaticum 的生长动力学，并拍摄培养物。
- 分析：可以使用两点来评估结果：1）培养物占据整个培养板所需的时间（以天为单位），以及2）培养物中 出现T. stromaticum conidia的特征性绿色色素沉着的时间（以天为单位）。
- 在每个孵育期（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）后除去培养基，并用PBS洗涤细胞两次以除去未吞噬的分生孢子。
6. 统计分析
- 使用 Kruskal-Wallis 检验确定 8 组/治疗之间的统计学显着差异。将 p < 0.05 视为具有统计学意义。所有数据均以均值±标准差 （SD） 表示。在图中，# 表示 p < 0.05 时的统计显著性。
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Representative Results
涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。我们利用 T. stromaticum 分生孢子的吞噬作用来评估吞噬作用后分生孢子的活力，因为吞噬作用的逃避和吞噬体的逃逸是真菌毒力的机制。研究人员在研究具有临床意义的物种时，应将这些技术作为首批检测之一。
图2：人外周血单核来源巨噬细胞对 T. stromaticum conidia的吞噬作用。 吞噬动力学的代表性结果 （A） 在 40 倍和 （B） 100 倍物镜下显示含有 T. stromaticum 分生孢子的 PBMC 衍生巨噬细胞。（C） 无 基质分 生孢子并附着在外膜上;（D）被巨噬细胞完全内化的 T. stromaticum conidia ;（E） 上平面的 T. stromaticum 分生孢子;（F）多重吞噬作用;（G）巨噬细胞内部和外部的分生孢子萌发。箭头：黄色，游离分生孢子;白色，分生孢子附着在外膜上;黑色，完全内化的分生孢子;红色，分生孢子在巨噬细胞内萌发。虚线箭头：黑色，多重吞噬作用;红色，分生孢子在巨噬细胞外的R10培养基中萌发;白色，上平面有分生孢子。比例尺表示 20 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2显示了吞噬动力学的代表性结果。在吞噬过程的开始，可以观察到游离的T. stromaticum 分生孢子，以及附着在巨噬细胞外膜上或完全被巨噬细胞内化的分生孢子（图2A-C）。随着吞噬时间的增加，可以观察到更少的分生孢子游离或附着在巨噬细胞的外膜上。
值得注意的是，在这项工作中，分生孢子在吞噬过程开始时可以游离并附着在外膜上（图2C），完全被巨噬细胞内化（图2D），或者与巨噬细胞相比在上平面（图2E）但未吞噬，并且在同一巨噬细胞中可以发现多个分生孢子（图2F）。长时间（96小时）后，吞噬的分生孢子可以在巨噬细胞内萌发（图2G），游离分生孢子可以在R10培养基中萌发，在37°C下形成菌丝（图2H）。
吞噬作用后，可以观察到即使在与人PBMC衍生的巨噬细胞相互作用120小时后，T. stromaticum 分生孢子仍然存活。代表性结果显示了回收的分生孢子的培养物（图3A），并代表了培养物占据整个培养板（图3B）并形成彩色绿色分生孢子所需的时间（以天为单位）。只有离散的 T. stromaticum 分生孢子能够逃避吞噬体，并在人类外周血单核来源的巨噬细胞的细胞质中游离29。木霉减少活性氧和氮物质产生的能力也可能有助于吞噬体内分生孢子的存活，并解释吞噬作用后的活力28,29,36。到目前为止，我们已经证明吞噬的分生孢子仍然存活，即使在 120 小时后也能在 PDA 培养基中生长。据报道，其他微生物在被巨噬细胞吞噬后仍存活，例如曲霉菌 27,37 和隐球菌38。
图3：感染 基质锥 虫的人外周血单核来源巨噬细胞的清除能力。 在用 T. stromaticum 分生孢子攻击（3 小时、24 小时、48 小时、72 小时、96 小时或 120 小时）后，裂解 PBMC 衍生的巨噬细胞，并将悬浮液接种在 PDA 中以评估吞噬分生孢子的活力。（A） 显示了 PBMC 衍生的巨噬细胞吞噬作用后 T. stromaticum 生长的代表性结果。监测 （B） 基 质锥虫 生长和 （C） 分生孢子在不同日期的 PBS 中用 T. stromaticum 阳性对照（见步骤 5.2.5）、R10 培养基的对照（见步骤 5.1.2）和巨噬细胞吞噬的分生孢子不同时间段（3 小时、24 小时、48 小时、72 小时、96 小时、120 小时）。来自四位健康供体的代表性结果。平均值±标准差 （SD）。Kruskal-Wallis检验。符号 # 表示 p < 0.05 处的显著性，n = 4。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
对于几种真菌病原体，包括烟曲霉、隐球菌、白色念珠菌等，分生孢子或酵母吞噬作用是一个关键过程，可以研究巨噬细胞-病原体相互作用中的细胞质和分子事件，以及确定内化分生孢子的死亡时间14,39,40。吞噬作用是木霉-宿主相互作用的关键过程。木霉属调节多种吞噬途径，包括 Dectin-1 和 Dectin-2、Toll 样受体 2 和 Toll 样受体 4、MHC 和 NF-κB25、28、41、42、43。木霉病在免疫功能低下和非免疫功能低下个体中引起木霉病9.重要的是，该属的几个物种用于农业，是木霉病的潜在来源。由于木霉属（包括基质木霉）引起的职业危害正在惊人地上升，因此迫切需要了解基质毛滴虫的毒力因子以及人体对这些真菌的免疫反应机制。这里介绍的方法详细介绍了如何进行吞噬作用和杀伤测定，以研究人外周血源性巨噬细胞中的木霉-巨噬细胞相互作用;然而，这种方法也可用于研究来自不同组织的巨噬细胞，包括肺泡、腹膜或谱系巨噬细胞。
该协议的第一步从母原（M1）悬浮液开始，以获得真菌的新鲜培养物。 木霉 菌培养物生长迅速，因为它们通常会占据整个盘子，并在 5 天内开始显示绿色分生孢子。温度和光照是 木霉 生长的关键因素，这些因素的改变会影响 木霉 的动力学并影响实验44。
洗涤 T. stromaticum 培养物后，应回收 5-8 mL 的最终体积。悬浮液的颜色强度与分生孢子浓度成正比。获得的分生孢子悬浮液可用于 体外 和 体内 测定，例如用于评估吞噬作用26、中性粒细胞胞外陷阱28、鼻内暴露36、41、腹膜内暴露26、皮内感染45和静脉感染46。先前对人类巨噬细胞进行的研究已经评估了 木霉29诱导的自噬以及该属抑制中性粒细胞28中细胞外陷阱形成的能力，这是一种用于消除真菌病原体和其他微生物的机制。
需要注意的是，用于维持细胞的培养基会影响分生孢子的萌发（图3G，H）。如果特定实验不需要发芽，我们建议使用细胞培养基进行初步筛选测定，以确定木霉在该特定培养基中的生长动力学。该测定应在开始具有所需细胞谱系的体外实验之前进行，如果发现培养基不相容，则应在72小时后停止实验。分生孢子木霉（图3G，H）的萌发可以在巨噬细胞内外96h观察到。
由于 木霉 属物种在形态以及其生长的最佳温度和pH值方面存在差异，因此此处提供的结果可能无法针对该属的所有物种进行重现，并且当与其他物种一起执行时，该协议可能需要进行调整。例如，曲 霉 分生孢子在培养物中比 T. stromaticum 的分生孢子萌发得更快。
以前记录的使用流式细胞术和荧光显微镜评估吞噬作用和杀灭病原体的方案需要昂贵的试剂，但它们提供了有关吞噬作用过程的具体信息19。本文介绍的方案只需要光学显微镜和板生长来评估吞噬作用，并提供吞噬作用过程的综合图像。可以使用不同的方案来获得分化的巨噬细胞并诱导巨噬细胞裂解。这些方案包括使用不同的时间进行巨噬细胞分化，而不是此处使用的7天26 或使用2.5%脱氧胆酸盐47 在37°C和5%CO2 下裂解巨噬细胞而不是蒸馏水30分钟，如本方案中使用的那样。这些方法已有效地用于不同的真菌物种，例如 烟曲霉27、 尼杜兰曲霉18 和 新型隐球菌15。
该协议的一些局限性与使用不含内毒素的PBS，圆形玻璃盖玻片的使用以及人血的使用有关。我们建议在细胞上测试PBS（不含内毒素），以确保它不会激活单核细胞并偏倚实验。使用圆形玻璃盖玻片对于细胞染色和计数非常有用，但细胞可能无法在载玻片下均匀分布，因为一些细胞会很好地迁移到板的边缘，并且这种差异可能会影响圆形玻璃盖玻片中估计的总细胞数。由于我们在本方案中没有使用免疫荧光或类似技术，因此与巨噬细胞相比，上层存在非吞噬分生孢子可能会导致对吞噬结果的误解。当我们使用来自人类供体的血液时，最终的PBMC计数因供体而异，并且低供体细胞计数可能不足以满足所有实验。
总之，这些技术可用于测量巨噬细胞的功能和真菌清除率，特别是对于丝状真菌（如 木霉 ）和其他微生物（如酵母菌和细菌）。此外，该协议为研究人类群体中针对分生孢子形成真菌的免疫反应的实际变异性提供了未来的方向，这是使用同基因动物模型或细胞系无法观察到的。
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Disclosures
所有作者均声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了以下巴西金融机构的支持：巴伊亚州国家保护保护基金会（FAPESB），赠款RED0011/2012和RED008/2014。U.R.S.、J.O.C. 和 M.E.S.M. 分别感谢 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior （CAPES） 和 FAPESB 颁发的奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
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