2.7: 중합 효소 연쇄 반응 및 겔 전기 영동을 통한 환경 미생물 검출

1. 샘플 수집

1. 오거 또는 삽을 사용하여 토양을 채집하여 결정된 깊이로 내려간다. 뿌리 부각 (주변 토양의 좁은 영역 및 식물 뿌리와 관련 미생물에 의해 영향을 받는 토양의 좁은 영역)에서 토양을 수집하는 경우, 단지 수집 배럴에 토양을 타격하여 식물 뿌리 주위에서 직접 수집합니다.
2. 침지 스틱의 끝을 들고 있는 동안 멸균 플라스틱 병을 물에 담그어 물 샘플을 수집합니다.

2. 핵산 추출 및 준비

1. 샘플에서 유기체와 바이러스를 수집하고 그들로부터 DNA와 RNA를 추출합니다. 자세한 내용은 지역 사회 핵산 추출에 대한 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.
2. 표지된 마이크로퍼지 튜브에 추출된 DNA를 저장합니다. DNA를 하룻밤 또는 더 긴 시간 동안 보관해야 하는 경우 -20°C에서 동결하고 사용할 준비가 되면 실온에서 튜브를 해동하십시오.
3. 분석될 유전 물질이 RNA(RNA 바이러스의 게놈이든, 또는 세포 유기체의 전사된 RNA이든) PCR로 진행하기 전에 상호 보완적인 DNA(cDNA)를 생성하기 위해 샘플상에서 역전사(RT)를 수행한다. 자세한 내용은 RT-PCR의 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.

3. 중합체 연쇄 반응

1. PCR효소(예: Taq 폴리머라제)를 얼음 위에 놓고 실온에서 지정된 "클린" 후드 내부에 다른 시약(PCR 버퍼, dNTP, 프라이머)을 해동한다. 효소는 -20 °C에 저장되지만 결코 얼지 않습니다. 온도에 민감하므로 시원하게 유지되어야 하며 주변 온도에 대한 노출이 최소화되어야 합니다.
2. 모든반응(표 1)에서일정한 모든 시약의 "마스터 믹스"를 만드는 데 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 계산에서양수(예:대상 영역을 포함하는 것으로 알려진 템플릿)와 네거티브(예: 템플릿 없음)를 고려해야 합니다. 파이펫팅 오류를 고려하여 최종 볼륨에 10%를 추가합니다. 프라이머 볼륨은 특정 유기체에 대한 저서에 의존합니다. 적절한 값에 대해 출판된 문헌을 참조하십시오.
3. 플라스틱 벽에 시약 분자의 접착을 최소화하는 저결합 미세 분리 튜브를 사용하여 각 시약의 계산된 볼륨을 추가하여 마스터 믹스를 조립합니다. 추가하기 전에 각 시약마다 부드럽게 소용돌이와 원심분리기를 넣습니다. 마스터 믹스가 준비되면, 소용돌이를 혼합하고 원심분리에 의해 수집
4. 8튜브 PCR 스트립을 준비합니다. 양수 및 음수 컨트롤을 포함하여 각 샘플에 대한 튜브 지정
5. 스트립의 각 튜브에 PCR 혼합물의 적절한 볼륨을 분배
6. 샘플에서 DNA 템플릿의 적절한 볼륨뿐만 아니라 양수 템플릿의 5 μL과 분자 등급 물의 5 μL을 음의 대조군으로 추가하여 각각의 PCR 튜브에 넣습니다.
7. 캡을 8튜브 스트립과 원심분리기에 미니센트리슈어지를 사용하여 몇 초 간 단단히 놓습니다.
8. 온도 사이클러에 8 튜브 스트립을 배치
9. 열순환기에서 실행할 적절한 PCR 프로그램을 설정합니다. 일반적인 프로그램은 다음과 같은 것으로 구성됩니다.
   1. 94°C에서 3분 동안 의결.
   2. 증폭의 30-40 사이클: 30초에 대한 94°C에서 의 약화, 프라이머 별 온도(보통 50~60°C 사이)에서 30초, 30초/500bp에 72°C로 연장하였다.
   3. 7-10 분 동안 72 °C에서 최종 연장.

4. 아가로즈 젤 준비

1. 원하는 젤 부피 및 겔농도(표 2)에기초하여, 125mL 에렌마이어 플라스크에 아가로즈 분말의 적량을 계량한다.
2. 적절한 양의 젤 러닝 버퍼를 플라스크에 넣고 플라스크를 손으로 소용돌이시다.
3. 완충-아가로즈 혼합물을 전자레인지에 넣고 1분간 고출력으로 가열합니다.
4. 전자레인지에서 플라스크를 제거하고 손으로 소용돌이어 모든 아가로즈가 용해되었는지 확인합니다. 아가로즈가 완전히 용해되지 않은 경우 30분 단위로 마이크로웨이브를 반복합니다.
5. 플라스크에 캡을 단단히 고정한 후 흐르는 차가운 물 에서 회전하여 50 °C로 식힙니다.
6. EtBr에 지정된 마이크로핍펫을 사용하여 아가로즈 혼합물에 에티듐 브로마이드(EtBr)의 1μL을 추가합니다. EtBr은 UV 빛으로 비춰질 때 이중 가닥 핵산과 형광 오렌지를 결합하는 염료입니다. EtBr은 잠재적으로 발암성이므로 개인 보호 장비 (고글, 실험실 코트, EtBr 내성 장갑)를 착용해야합니다.
7. 용융 젤을 전기포고시스 젤 주조 트레이에 붓습니다. 아가로즈 내에 거품이 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 빗을 젤에 넣고 단단히 고정합니다. 젤이 고화될 때까지 약 20-30분 정도 기다립니다.
8. 젤이 굳어지면 젤에 눈물을 흘리지 않고 조심스럽게 빗을 제거하십시오. 빗은 샘플을 적재하기 위한 젤의 우물을 만듭니다.

5. 젤 전기 전광

1. 고화된 아가로즈 젤을 전기전도 챔버에 넣습니다.
2. 젤이 거의 물에 잠길 때까지 적절한 실행 버퍼를 챔버에 추가합니다.
3. 파라필름, 로딩 염료 농축물의 파이펫 스팟에. 또한 PCR 제품의 예상 크기에 적합한 범위의 DNA 사다리를 포함한다. 또는, 마이크로 퍼지 튜브의 신선한 세트를 사용, 각 샘플에 대해 하나.
4. PCR이 완료되면 온도 순환기에서 8튜브 스트립을 검색하고 간략하게 원심분리기를 가져와 응축수들을 수집합니다. 적중염과 파이펫에 적절한 양의 DNA 제품을 넣고 혼합합니다. 예를 들어, 10x 로딩 염료의 2μL은 8μL의 샘플과 혼합되어 10 μL의 최종 부피를 제공하며 염료는 1x로 됩니다.
5. 파이펫 각 염료 샘플 혼합물은 아가로즈 젤의 지정된 우물에 들어가 우물에 구멍을 뚫지 않도록 주의한다.
6. 전극을 전극챔버에 연결합니다. DNA는 음전하로 충전되므로 양극쪽으로 "실행"됩니다. 따라서 양극을 우물이 로드된 챔버의 반대편에 연결합니다. 전원 공급 장치를 젤 챔버의 완충 시스템 및 크기에 적합한 전압으로 설정하고 실행하도록 설정합니다. 전기전도가 제대로 진행되는 경우 작은 기포가 챔버의 측면을 위로 이동하는 것을 볼 수 있어야 합니다.
7. 염료 전면이 젤 아래로 충분히 진보되면 전원 공급 장치를 끕니다. 젤을 일루미네이터 또는 시각 이미저로 조심스럽게 운반하고 UV 광을 켜서 젤의 DNA 밴드를 시각화합니다.
8. 젤의 밴드 크기와 위치를 분석합니다. 시료의 대역 위치를 양수 대조군과 비교하여 관심 있는 유기체로부터의 DNA가 샘플에 존재하는지 확인한다(도1).

표 1. PCR 마스터 믹스의 시약 볼륨입니다. *프라이머 볼륨은 유기체 분석에 따라 다릅니다. 분자 등급 물의 부피를 조정하여 최종 부피 45 μL을 만듭니다. 다른 구성 요소의 볼륨은 달라지지 않아야 합니다.

표 2. DNA 단편 크기 범위는 다른 아가로즈 젤 백분율에 의해 최적으로 해결됩니다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 토양, 물 및 기타 환경 샘플에 존재하는 미생물을 검출하고 식별하는 데 널리 적용되는 기본적인 생물학적 기술입니다.

전통적으로 미생물은 특수 성장 배지를 사용하여 실험실에서 배양됩니다. 그러나 자연 환경의 많은 미생물은 신진대사 활동이나 성장률이 매우 낮거나 배양 접시에서 복제할 수 없는 매우 엄격한 성장 요구 사항을 가지고 있기 때문에 "배양할 수 없습니다". 미생물 간의 배양 가능성의 차이는 또한 환경 샘플의 미생물을 배양할 때 배양량의 상대적 풍부함이 환경에서의 실제 수준을 반영하지 않을 수 있음을 의미합니다.

혼합 샘플에 존재하는 소량의 DNA도 특이적으로 증폭할 수 있는 PCR의 출현으로 환경 샘플에 존재하는 복잡한 유기체 구색 내에서 배양할 수 없는 미생물이라도 관심 있는 특정 미생물을 신속하게 감지하고 식별할 수 있습니다.

이 비디오는 PCR의 원리를 소개합니다. 그런 다음 관심 유기체의 존재를 감지하기 위해 환경 샘플에서 분리된 DNA에 대해 PCR을 수행하기 위한 일반적인 프로토콜에 대해 논의합니다. 마지막으로, PCR 기반 미생물 식별의 몇 가지 응용 분야를 탐구할 것입니다.

PCR의 기본 전제는 연속적인 온도 변화의 반복되는 다른 온도를 통해 자동적으로 순환하기 위하여 thermocycler로 알려져 있는 기계에 DNA의 기하급수적인 확대를 달성하기 위하여 주기를, 보통 사용하기 위한 것입니다. DNA 합성은 Thermus aquaticus 또는 "Taq"와 같은 온천에 사는 박테리아에서 얻은 DNA 중합 효소에 의해 수행됩니다. 이러한 중합효소는 열에 안정적이어서 PCR 중에 사용되는 고온을 견딜 수 있습니다.

앰플리콘(amplicon)으로 알려진 표적 염기서열은 "프라이머(primers)"로 알려진 두 개의 짧은 뉴클레오티드를 사용하여 DNA 주형에서 증폭됩니다. 상보적 핵산 결합의 높은 특이성으로 인해 프라이머는 매우 특이적인 관심 염기서열의 표적 증폭을 허용합니다. PCR는 관심사의 유기체에서서만 유일한 순서, 또는 순서의 유일한 조합을, 증폭할 뇌관을 디자인해서, 복합적인 환경 표본에서 존재하는 모든 유전 물질 중 그 유기체의 DNA의 존재를 차별적으로 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다.

각 PCR 주기는 3단계로 나뉩니다. "변성"으로 알려진 첫 번째는 일반적으로 92 이상으로 설정됩니다. C는 약 30초 동안 지속됩니다. 변성은 증폭 반응이 진행될 수 있도록 DNA 분자를 단일 가닥으로 분해하는 데 사용됩니다.

두 번째 단계인 "어닐링"은 2에서 3으로 설정됩니다. 2개의 뇌관의 녹는 온도의 더 낮은 이하, 보통 50에서 65 사이 C? C이며 약 30초 동안 지속됩니다. 용융 온도는 이중 가닥 DNA 분자의 50%가 단일 가닥으로 분리된 온도이므로 어닐링 단계를 통해 프라이머가 DNA 템플릿의 타겟 부위에 결합할 수 있습니다.

PCR 주기의 제 3 단계는 DNA 폴리메라이제가 뇌관 템플렛 듀플렉스에 결합하고 새로운 물가의 종합을 촉매 작용할 때 "신장" 또는 "연장"입니다. 72로 설정 ? C에서 가장 일반적으로 사용되는 PCR 중합효소인 Taq의 경우, 이 상의 지속 시간은 앰플리콘의 길이에 따라 달라지며, 일반적으로 500 염기쌍당 30초입니다. 각 주기 후에, 증폭된 DNA는 다시 한 번 변성되고 새로운 주형으로 작용해, PCR 산물의 양에 있는 기하급수적인 증가로 이끌어 냅니다.

일단 반응이 완료되면, PCR 제품은 보통 중합체 agarose, 전기 이동법으로 알려져 있는 과정으로 만든 "젤"에 크기에 의하여 분리될 수 있습니다. 전기장이 겔 전체에 가해지고 DNA 분자의 골격에 있는 음전하로 인해 전기장이 필드의 양극 끝으로 이동합니다. 일반적으로 더 큰 선형 DNA 분자는 겔 매트릭스를 통과하는 데 더 오래 걸립니다.

이제 PCR의 작동 원리를 이해했으므로 환경 샘플에서 미생물을 식별하기 위해 반응을 사용하는 방법을 살펴보겠습니다.

먼저 처리할 샘플의 수에 따라 필요한 각 시약의 부피를 계산하고 파이펫팅 오류를 설명하기 위해 추가로 10%를 계산합니다. 표적 영역을 포함하는 positive control template은 반응이 작동하는지 확인하기 위해 포함되어야 합니다. 뿐만 아니라 반응 성분의 오염을 배제하기 위해 DNA 템플릿이 포함되지 않은 음성 대조군도 있습니다. Taq 중합효소를 얼음 위에 보관하고 나머지 시약과 DNA 샘플을 오염을 방지하기 위해 지정된 층류 후드에서 실온에서 해동합니다.

모든 시약이 해동되면 각 시약의 계산된 부피를 결합력이 낮은 마이크로분리 튜브에 추가하여 시약 "마스터 믹스"를 구성하며, 이는 튜브 표면에 대한 분자의 흡착으로 인한 시약 양의 불일치를 최소화합니다. 추가하기 전에 각 시약을 부드럽게 와류와 원심 분리하십시오. 마스터 믹스가 준비되면 와류가 혼합되고 원심 분리로 수집됩니다.

8-튜브 PCR 스트립에 라벨을 지정하여 대조군을 포함한 각 샘플에 대해 하나의 튜브를 지정합니다. 스트립의 각 튜브에 적절한 양의 PCR 마스터 믹스를 분배합니다. 그런 다음 각 DNA 샘플을 해당 튜브에 추가합니다.

스트립 캡을 스트립 튜브에 단단히 놓고 스트립 어댑터가 있는 미니 원심분리기에 잠시 원심분리합니다. 그런 다음 튜브를 thermocycler에 넣고 적절한 PCR 프로그램에 따라 반응을 실행합니다.

PCR이 실행되는 동안 PCR 산물의 전기영동을 위해 아가로스 겔을 준비합니다. 예상 크기에 따라 PCR 산물을 분해할 수 있는 농도의 겔에 적합한 양의 아가로스 분말을 계량합니다. 아가로스를 125mL 플라스크에 넣은 다음, 겔 캐스트의 부피에 따라 적절한 부피의 겔 실행 버퍼를 플라스크에 넣고 소용돌이쳐 섞습니다. 전자레인지에 아가로스 용액을 고출력으로 1분 동안 돌립니다. 완료되면 플라스크를 휘젓아 아가로스가 완전히 녹았는지 확인하고 필요한 경우 30초 단위로 전자레인지를 반복합니다.

캡을 플라스크에 단단히 고정하고 아가로스 용액을 50으로 냉각합니다. C 흐르는 찬물에 플라스크를 휘젓습니다. 냉각되면 1을 추가하십시오. L의 에티듐 브로마이드를 아가로스에 첨가합니다. 브롬화 에티듐은 발암 가능성이 있으므로 고글, 실험실 가운, 브롬화 에티듐 방지 장갑과 같은 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.

아가로스 용액을 전기영동 젤 주조 트레이에 붓고 아가로스 내부에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 필요한 수의 웰이 있는 빗을 용액에 놓습니다. 겔을 실온에서 20-30분 동안 그대로 두어 응고시킵니다. 젤이 굳으면 빗을 조심스럽게 제거하고 과정에서 젤이 찢어지지 않도록 합니다.

응고된 겔을 전기영동 챔버에 넣습니다. 겔이 잠길 때까지 챔버에 LB 버퍼를 추가합니다. 파라필름(Parafilm) 조각에 PCR 산물의 예상 크기에 적합한 범위의 DNA 사다리의 "스폿"을 피펫으로 만듭니다. thermocycler에서 완료된 반응이 있는 PCR 튜브를 회수합니다. 간단한 원심분리로 PCR 튜브에 응축수를 모으고 8을 첨가합니까? L을 파라필름에 넣습니다. 2 추가? 염료의 최종 농도가 2x가 되도록 PCR 제품의 각 스폿에 염료를 10x 적재하는 L.

샘플과 사다리를 아가로스 겔의 지정된 웰에 넣고 겔을 뚫지 않도록 주의합니다. 로딩이 완료되면 전기영동 챔버에 뚜껑을 덮고 전극을 전원 공급 장치에 연결합니다. DNA는 음전하를 띠고 양극 쪽으로 이동하기 때문에 웰이 음극에 더 가까운 쪽에 있는지 확인하십시오. 전원을 켜고 전압으로 설정하십시오.tage 전기영동 챔버의 크기와 사용 중인 버퍼 시스템의 크기에 적합합니다. 전기영동을 "run"으로 설정합니다. 챔버의 측면을 따라 위로 이동하는 작은 기포는 전기영동이 제대로 진행되고 있는지 관찰됩니다.

염료 선단이 젤 아래로 충분히 진행되면 전원 공급 장치를 끕니다. 전기영동 산물을 시각화하기 위해 겔을 겔 이미저로 조심스럽게 운반합니다. 보호막을 사용하여 UV 광선을 켜고 젤의 DNA 밴드를 시각화합니다. 띠의 위치를 분석하여 환경 샘플에서 관심 종의 존재를 나타내는 예상 패턴과 일치하는지 확인합니다.

지금까지 PCR이 어떻게 수행되는지 살펴보았으므로 이제 환경에서 관심 있는 미생물을 검출하기 위해 PCR이 적용되는 다양한 방법을 살펴보겠습니다.

PCR 기반 환경 미생물 검출의 한 가지 용도는 담수와 염소 처리되지 않은 웅덩이에서 발견되는 단세포 유기체인 "뇌를 먹는 아메바" Naegleria fowleri와 같은 질병을 유발하는 유기체를 식별하는 것입니다. 의심되는 환자의 물 샘플 또는 뇌척수액에 이 치명적인 미생물이 존재하는지 여부는 아메바 게놈의 고유한 DNA 염기서열을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 테스트할 수 있습니다.

PCR 기반 미생물 식별을 위한 또 다른 응용 분야는 공중 보건 모니터링 및 질병 발병 조사의 일환으로 식품 시설 근처에서 잡힌 파리에서 병원성 박테리아의 존재 여부를 테스트하는 것입니다.

여기에서 연구자들은 먼저 파리의 신체 표면과 소화관 모두에서 박테리아를 분리한 다음 종 특이적 배양 조건을 사용하여 이러한 관심 종을 풍부하게 함으로써 살모넬라균 및 리스테리아균과 같은 병원성 박테리아의 존재를 찾았습니다. 배양된 박테리아에서 DNA를 추출한 후 상업적으로 이용 가능한 종 특이적 검출 PCR 키트를 사용하여 박테리아의 정체를 테스트했습니다.

마지막으로, 주요 공중 보건 문제를 제시하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 같은 항생제 내성 병원성 박테리아의 다양한 균주를 PCR로 식별하고 구별할 수 있습니다.

이 예시에서 연구원들은 임상 샘플에서 S. aureus를 분리 및 배양한 다음 박테리아 군체에서 DNA를 추출하고 PCR을 수행했습니다. 여기서의 증폭 반응은 "다중화(multiplexed)"되었는데, 이는 박테리아 게놈의 서로 다른 고유 영역을 표적으로 하는 여러 프라이머 세트가 동일한 반응으로 결합되었음을 의미합니다. 개별적 프라이머 세트는 PCR 산물이 단지 일부 균주의 DNA에서만 유래하도록 설계되었지만, 다른 균주는 그렇지 않으므로, 조합에서, 독특한 산물 밴드 패턴이 각 균주에 대해 관찰되었습니다.

PCR 기반 미생물 검출에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 우리는 중합효소 연쇄 반응의 원리를 살펴보았습니다. 환경 미생물로부터 추출한 DNA에 대해 PCR을 수행하기 위한 프로토콜; 마지막으로, 다양한 유형의 환경 또는 임상 샘플에서 관심 유기체를 테스트하기 위해 이 기술을 몇 가지 구체적으로 응용합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!