중합 효소 연쇄 반응 및 겔 전기 영동을 통한 환경 미생물 검출

1. 샘플 수집

1. 오거 또는 삽을 사용하여 토양을 채집하여 결정된 깊이로 내려간다. 뿌리 부각 (주변 토양의 좁은 영역 및 식물 뿌리와 관련 미생물에 의해 영향을 받는 토양의 좁은 영역)에서 토양을 수집하는 경우, 단지 수집 배럴에 토양을 타격하여 식물 뿌리 주위에서 직접 수집합니다.
2. 침지 스틱의 끝을 들고 있는 동안 멸균 플라스틱 병을 물에 담그어 물 샘플을 수집합니다.

2. 핵산 추출 및 준비

1. 샘플에서 유기체와 바이러스를 수집하고 그들로부터 DNA와 RNA를 추출합니다. 자세한 내용은 지역 사회 핵산 추출에 대한 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.
2. 표지된 마이크로퍼지 튜브에 추출된 DNA를 저장합니다. DNA를 하룻밤 또는 더 긴 시간 동안 보관해야 하는 경우 -20°C에서 동결하고 사용할 준비가 되면 실온에서 튜브를 해동하십시오.
3. 분석될 유전 물질이 RNA(RNA 바이러스의 게놈이든, 또는 세포 유기체의 전사된 RNA이든) PCR로 진행하기 전에 상호 보완적인 DNA(cDNA)를 생성하기 위해 샘플상에서 역전사(RT)를 수행한다. 자세한 내용은 RT-PCR의 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.

3. 중합체 연쇄 반응

1. PCR효소(예: Taq 폴리머라제)를 얼음 위에 놓고 실온에서 지정된 "클린" 후드 내부에 다른 시약(PCR 버퍼, dNTP, 프라이머)을 해동한다. 효소는 -20 °C에 저장되지만 결코 얼지 않습니다. 온도에 민감하므로 시원하게 유지되어야 하며 주변 온도에 대한 노출이 최소화되어야 합니다.
2. 모든반응(표 1)에서일정한 모든 시약의 "마스터 믹스"를 만드는 데 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 계산에서양수(예:대상 영역을 포함하는 것으로 알려진 템플릿)와 네거티브(예: 템플릿 없음)를 고려해야 합니다. 파이펫팅 오류를 고려하여 최종 볼륨에 10%를 추가합니다. 프라이머 볼륨은 특정 유기체에 대한 저서에 의존합니다. 적절한 값에 대해 출판된 문헌을 참조하십시오.
3. 플라스틱 벽에 시약 분자의 접착을 최소화하는 저결합 미세 분리 튜브를 사용하여 각 시약의 계산된 볼륨을 추가하여 마스터 믹스를 조립합니다. 추가하기 전에 각 시약마다 부드럽게 소용돌이와 원심분리기를 넣습니다. 마스터 믹스가 준비되면, 소용돌이를 혼합하고 원심분리에 의해 수집
4. 8튜브 PCR 스트립을 준비합니다. 양수 및 음수 컨트롤을 포함하여 각 샘플에 대한 튜브 지정
5. 스트립의 각 튜브에 PCR 혼합물의 적절한 볼륨을 분배
6. 샘플에서 DNA 템플릿의 적절한 볼륨뿐만 아니라 양수 템플릿의 5 μL과 분자 등급 물의 5 μL을 음의 대조군으로 추가하여 각각의 PCR 튜브에 넣습니다.
7. 캡을 8튜브 스트립과 원심분리기에 미니센트리슈어지를 사용하여 몇 초 간 단단히 놓습니다.
8. 온도 사이클러에 8 튜브 스트립을 배치
9. 열순환기에서 실행할 적절한 PCR 프로그램을 설정합니다. 일반적인 프로그램은 다음과 같은 것으로 구성됩니다.
   1. 94°C에서 3분 동안 의결.
   2. 증폭의 30-40 사이클: 30초에 대한 94°C에서 의 약화, 프라이머 별 온도(보통 50~60°C 사이)에서 30초, 30초/500bp에 72°C로 연장하였다.
   3. 7-10 분 동안 72 °C에서 최종 연장.

4. 아가로즈 젤 준비

1. 원하는 젤 부피 및 겔농도(표 2)에기초하여, 125mL 에렌마이어 플라스크에 아가로즈 분말의 적량을 계량한다.
2. 적절한 양의 젤 러닝 버퍼를 플라스크에 넣고 플라스크를 손으로 소용돌이시다.
3. 완충-아가로즈 혼합물을 전자레인지에 넣고 1분간 고출력으로 가열합니다.
4. 전자레인지에서 플라스크를 제거하고 손으로 소용돌이어 모든 아가로즈가 용해되었는지 확인합니다. 아가로즈가 완전히 용해되지 않은 경우 30분 단위로 마이크로웨이브를 반복합니다.
5. 플라스크에 캡을 단단히 고정한 후 흐르는 차가운 물 에서 회전하여 50 °C로 식힙니다.
6. EtBr에 지정된 마이크로핍펫을 사용하여 아가로즈 혼합물에 에티듐 브로마이드(EtBr)의 1μL을 추가합니다. EtBr은 UV 빛으로 비춰질 때 이중 가닥 핵산과 형광 오렌지를 결합하는 염료입니다. EtBr은 잠재적으로 발암성이므로 개인 보호 장비 (고글, 실험실 코트, EtBr 내성 장갑)를 착용해야합니다.
7. 용융 젤을 전기포고시스 젤 주조 트레이에 붓습니다. 아가로즈 내에 거품이 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 빗을 젤에 넣고 단단히 고정합니다. 젤이 고화될 때까지 약 20-30분 정도 기다립니다.
8. 젤이 굳어지면 젤에 눈물을 흘리지 않고 조심스럽게 빗을 제거하십시오. 빗은 샘플을 적재하기 위한 젤의 우물을 만듭니다.

5. 젤 전기 전광

1. 고화된 아가로즈 젤을 전기전도 챔버에 넣습니다.
2. 젤이 거의 물에 잠길 때까지 적절한 실행 버퍼를 챔버에 추가합니다.
3. 파라필름, 로딩 염료 농축물의 파이펫 스팟에. 또한 PCR 제품의 예상 크기에 적합한 범위의 DNA 사다리를 포함한다. 또는, 마이크로 퍼지 튜브의 신선한 세트를 사용, 각 샘플에 대해 하나.
4. PCR이 완료되면 온도 순환기에서 8튜브 스트립을 검색하고 간략하게 원심분리기를 가져와 응축수들을 수집합니다. 적중염과 파이펫에 적절한 양의 DNA 제품을 넣고 혼합합니다. 예를 들어, 10x 로딩 염료의 2μL은 8μL의 샘플과 혼합되어 10 μL의 최종 부피를 제공하며 염료는 1x로 됩니다.
5. 파이펫 각 염료 샘플 혼합물은 아가로즈 젤의 지정된 우물에 들어가 우물에 구멍을 뚫지 않도록 주의한다.
6. 전극을 전극챔버에 연결합니다. DNA는 음전하로 충전되므로 양극쪽으로 "실행"됩니다. 따라서 양극을 우물이 로드된 챔버의 반대편에 연결합니다. 전원 공급 장치를 젤 챔버의 완충 시스템 및 크기에 적합한 전압으로 설정하고 실행하도록 설정합니다. 전기전도가 제대로 진행되는 경우 작은 기포가 챔버의 측면을 위로 이동하는 것을 볼 수 있어야 합니다.
7. 염료 전면이 젤 아래로 충분히 진보되면 전원 공급 장치를 끕니다. 젤을 일루미네이터 또는 시각 이미저로 조심스럽게 운반하고 UV 광을 켜서 젤의 DNA 밴드를 시각화합니다.
8. 젤의 밴드 크기와 위치를 분석합니다. 시료의 대역 위치를 양수 대조군과 비교하여 관심 있는 유기체로부터의 DNA가 샘플에 존재하는지 확인한다(도1).

구성 요소	튜브당 부피(μL)	5튜브용 부피(μL)	최종 농도
10x 엑스 타크 버퍼	5.0	25	1x
2.5 mM dNTP	4.0	20	0.2 mM
포워드 프라이머*	2.0	10	400 nM
역프라이머*	2.0	10	400 nM
분자 H2O	31.75	158.75	-
엑스 타크	0.25	1.25	2.5 U
PCR 혼합물	45	225

표 1. PCR 마스터 믹스의 시약 볼륨입니다. *프라이머 볼륨은 유기체 분석에 따라 다릅니다. 분자 등급 물의 부피를 조정하여 최종 부피 45 μL을 만듭니다. 다른 구성 요소의 볼륨은 달라지지 않아야 합니다.

아가로즈 권장%	선형 DNA 단편에 대한 최적의 해상도(기본 쌍)
0.5	1,000-30,000
0.7	800-12,000
1.0	500-10,000
1.2	400-7,000
1.5	200-3,000
2.0	50-2,00

표 2. DNA 단편 크기 범위는 다른 아가로즈 젤 백분율에 의해 최적으로 해결됩니다.