중합 효소 연쇄 반응 및 겔 전기 영동을 통한 환경 미생물 검출

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 토양, 물 및 기타 환경 샘플에 존재하는 미생물을 검출하고 식별하는 데 널리 적용되는 기본적인 생물학적 기술입니다.

전통적으로 미생물은 특수 성장 배지를 사용하여 실험실에서 배양됩니다. 그러나 자연 환경의 많은 미생물은 신진대사 활동이나 성장률이 매우 낮거나 배양 접시에서 복제할 수 없는 매우 엄격한 성장 요구 사항을 가지고 있기 때문에 "배양할 수 없습니다". 미생물 간의 배양 가능성의 차이는 또한 환경 샘플의 미생물을 배양할 때 배양량의 상대적 풍부함이 환경에서의 실제 수준을 반영하지 않을 수 있음을 의미합니다.

혼합 샘플에 존재하는 소량의 DNA도 특이적으로 증폭할 수 있는 PCR의 출현으로 환경 샘플에 존재하는 복잡한 유기체 구색 내에서 배양할 수 없는 미생물이라도 관심 있는 특정 미생물을 신속하게 감지하고 식별할 수 있습니다.

이 비디오는 PCR의 원리를 소개합니다. 그런 다음 관심 유기체의 존재를 감지하기 위해 환경 샘플에서 분리된 DNA에 대해 PCR을 수행하기 위한 일반적인 프로토콜에 대해 논의합니다. 마지막으로, PCR 기반 미생물 식별의 몇 가지 응용 분야를 탐구할 것입니다.

PCR의 기본 전제는 연속적인 온도 변화의 반복되는 다른 온도를 통해 자동적으로 순환하기 위하여 thermocycler로 알려져 있는 기계에 DNA의 기하급수적인 확대를 달성하기 위하여 주기를, 보통 사용하기 위한 것입니다. DNA 합성은 Thermus aquaticus 또는 "Taq"와 같은 온천에 사는 박테리아에서 얻은 DNA 중합 효소에 의해 수행됩니다. 이러한 중합효소는 열에 안정적이어서 PCR 중에 사용되는 고온을 견딜 수 있습니다.

앰플리콘(amplicon)으로 알려진 표적 염기서열은 "프라이머(primers)"로 알려진 두 개의 짧은 뉴클레오티드를 사용하여 DNA 주형에서 증폭됩니다. 상보적 핵산 결합의 높은 특이성으로 인해 프라이머는 매우 특이적인 관심 염기서열의 표적 증폭을 허용합니다. PCR는 관심사의 유기체에서서만 유일한 순서, 또는 순서의 유일한 조합을, 증폭할 뇌관을 디자인해서, 복합적인 환경 표본에서 존재하는 모든 유전 물질 중 그 유기체의 DNA의 존재를 차별적으로 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다.

각 PCR 주기는 3단계로 나뉩니다. "변성"으로 알려진 첫 번째는 일반적으로 92 이상으로 설정됩니다. C는 약 30초 동안 지속됩니다. 변성은 증폭 반응이 진행될 수 있도록 DNA 분자를 단일 가닥으로 분해하는 데 사용됩니다.

두 번째 단계인 "어닐링"은 2에서 3으로 설정됩니다. 2개의 뇌관의 녹는 온도의 더 낮은 이하, 보통 50에서 65 사이 C? C이며 약 30초 동안 지속됩니다. 용융 온도는 이중 가닥 DNA 분자의 50%가 단일 가닥으로 분리된 온도이므로 어닐링 단계를 통해 프라이머가 DNA 템플릿의 타겟 부위에 결합할 수 있습니다.

PCR 주기의 제 3 단계는 DNA 폴리메라이제가 뇌관 템플렛 듀플렉스에 결합하고 새로운 물가의 종합을 촉매 작용할 때 "신장" 또는 "연장"입니다. 72로 설정 ? C에서 가장 일반적으로 사용되는 PCR 중합효소인 Taq의 경우, 이 상의 지속 시간은 앰플리콘의 길이에 따라 달라지며, 일반적으로 500 염기쌍당 30초입니다. 각 주기 후에, 증폭된 DNA는 다시 한 번 변성되고 새로운 주형으로 작용해, PCR 산물의 양에 있는 기하급수적인 증가로 이끌어 냅니다.

일단 반응이 완료되면, PCR 제품은 보통 중합체 agarose, 전기 이동법으로 알려져 있는 과정으로 만든 "젤"에 크기에 의하여 분리될 수 있습니다. 전기장이 겔 전체에 가해지고 DNA 분자의 골격에 있는 음전하로 인해 전기장이 필드의 양극 끝으로 이동합니다. 일반적으로 더 큰 선형 DNA 분자는 겔 매트릭스를 통과하는 데 더 오래 걸립니다.

이제 PCR의 작동 원리를 이해했으므로 환경 샘플에서 미생물을 식별하기 위해 반응을 사용하는 방법을 살펴보겠습니다.

먼저 처리할 샘플의 수에 따라 필요한 각 시약의 부피를 계산하고 파이펫팅 오류를 설명하기 위해 추가로 10%를 계산합니다. 표적 영역을 포함하는 positive control template은 반응이 작동하는지 확인하기 위해 포함되어야 합니다. 뿐만 아니라 반응 성분의 오염을 배제하기 위해 DNA 템플릿이 포함되지 않은 음성 대조군도 있습니다. Taq 중합효소를 얼음 위에 보관하고 나머지 시약과 DNA 샘플을 오염을 방지하기 위해 지정된 층류 후드에서 실온에서 해동합니다.

모든 시약이 해동되면 각 시약의 계산된 부피를 결합력이 낮은 마이크로분리 튜브에 추가하여 시약 "마스터 믹스"를 구성하며, 이는 튜브 표면에 대한 분자의 흡착으로 인한 시약 양의 불일치를 최소화합니다. 추가하기 전에 각 시약을 부드럽게 와류와 원심 분리하십시오. 마스터 믹스가 준비되면 와류가 혼합되고 원심 분리로 수집됩니다.

8-튜브 PCR 스트립에 라벨을 지정하여 대조군을 포함한 각 샘플에 대해 하나의 튜브를 지정합니다. 스트립의 각 튜브에 적절한 양의 PCR 마스터 믹스를 분배합니다. 그런 다음 각 DNA 샘플을 해당 튜브에 추가합니다.

스트립 캡을 스트립 튜브에 단단히 놓고 스트립 어댑터가 있는 미니 원심분리기에 잠시 원심분리합니다. 그런 다음 튜브를 thermocycler에 넣고 적절한 PCR 프로그램에 따라 반응을 실행합니다.

PCR이 실행되는 동안 PCR 산물의 전기영동을 위해 아가로스 겔을 준비합니다. 예상 크기에 따라 PCR 산물을 분해할 수 있는 농도의 겔에 적합한 양의 아가로스 분말을 계량합니다. 아가로스를 125mL 플라스크에 넣은 다음, 겔 캐스트의 부피에 따라 적절한 부피의 겔 실행 버퍼를 플라스크에 넣고 소용돌이쳐 섞습니다. 전자레인지에 아가로스 용액을 고출력으로 1분 동안 돌립니다. 완료되면 플라스크를 휘젓아 아가로스가 완전히 녹았는지 확인하고 필요한 경우 30초 단위로 전자레인지를 반복합니다.

캡을 플라스크에 단단히 고정하고 아가로스 용액을 50으로 냉각합니다. C 흐르는 찬물에 플라스크를 휘젓습니다. 냉각되면 1을 추가하십시오. L의 에티듐 브로마이드를 아가로스에 첨가합니다. 브롬화 에티듐은 발암 가능성이 있으므로 고글, 실험실 가운, 브롬화 에티듐 방지 장갑과 같은 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.

아가로스 용액을 전기영동 젤 주조 트레이에 붓고 아가로스 내부에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 필요한 수의 웰이 있는 빗을 용액에 놓습니다. 겔을 실온에서 20-30분 동안 그대로 두어 응고시킵니다. 젤이 굳으면 빗을 조심스럽게 제거하고 과정에서 젤이 찢어지지 않도록 합니다.

응고된 겔을 전기영동 챔버에 넣습니다. 겔이 잠길 때까지 챔버에 LB 버퍼를 추가합니다. 파라필름(Parafilm) 조각에 PCR 산물의 예상 크기에 적합한 범위의 DNA 사다리의 "스폿"을 피펫으로 만듭니다. thermocycler에서 완료된 반응이 있는 PCR 튜브를 회수합니다. 간단한 원심분리로 PCR 튜브에 응축수를 모으고 8을 첨가합니까? L을 파라필름에 넣습니다. 2 추가? 염료의 최종 농도가 2x가 되도록 PCR 제품의 각 스폿에 염료를 10x 적재하는 L.

샘플과 사다리를 아가로스 겔의 지정된 웰에 넣고 겔을 뚫지 않도록 주의합니다. 로딩이 완료되면 전기영동 챔버에 뚜껑을 덮고 전극을 전원 공급 장치에 연결합니다. DNA는 음전하를 띠고 양극 쪽으로 이동하기 때문에 웰이 음극에 더 가까운 쪽에 있는지 확인하십시오. 전원을 켜고 전압으로 설정하십시오.tage 전기영동 챔버의 크기와 사용 중인 버퍼 시스템의 크기에 적합합니다. 전기영동을 "run"으로 설정합니다. 챔버의 측면을 따라 위로 이동하는 작은 기포는 전기영동이 제대로 진행되고 있는지 관찰됩니다.

염료 선단이 젤 아래로 충분히 진행되면 전원 공급 장치를 끕니다. 전기영동 산물을 시각화하기 위해 겔을 겔 이미저로 조심스럽게 운반합니다. 보호막을 사용하여 UV 광선을 켜고 젤의 DNA 밴드를 시각화합니다. 띠의 위치를 분석하여 환경 샘플에서 관심 종의 존재를 나타내는 예상 패턴과 일치하는지 확인합니다.

지금까지 PCR이 어떻게 수행되는지 살펴보았으므로 이제 환경에서 관심 있는 미생물을 검출하기 위해 PCR이 적용되는 다양한 방법을 살펴보겠습니다.

PCR 기반 환경 미생물 검출의 한 가지 용도는 담수와 염소 처리되지 않은 웅덩이에서 발견되는 단세포 유기체인 "뇌를 먹는 아메바" Naegleria fowleri와 같은 질병을 유발하는 유기체를 식별하는 것입니다. 의심되는 환자의 물 샘플 또는 뇌척수액에 이 치명적인 미생물이 존재하는지 여부는 아메바 게놈의 고유한 DNA 염기서열을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 테스트할 수 있습니다.

PCR 기반 미생물 식별을 위한 또 다른 응용 분야는 공중 보건 모니터링 및 질병 발병 조사의 일환으로 식품 시설 근처에서 잡힌 파리에서 병원성 박테리아의 존재 여부를 테스트하는 것입니다.

여기에서 연구자들은 먼저 파리의 신체 표면과 소화관 모두에서 박테리아를 분리한 다음 종 특이적 배양 조건을 사용하여 이러한 관심 종을 풍부하게 함으로써 살모넬라균 및 리스테리아균과 같은 병원성 박테리아의 존재를 찾았습니다. 배양된 박테리아에서 DNA를 추출한 후 상업적으로 이용 가능한 종 특이적 검출 PCR 키트를 사용하여 박테리아의 정체를 테스트했습니다.

마지막으로, 주요 공중 보건 문제를 제시하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 같은 항생제 내성 병원성 박테리아의 다양한 균주를 PCR로 식별하고 구별할 수 있습니다.

이 예시에서 연구원들은 임상 샘플에서 S. aureus를 분리 및 배양한 다음 박테리아 군체에서 DNA를 추출하고 PCR을 수행했습니다. 여기서의 증폭 반응은 "다중화(multiplexed)"되었는데, 이는 박테리아 게놈의 서로 다른 고유 영역을 표적으로 하는 여러 프라이머 세트가 동일한 반응으로 결합되었음을 의미합니다. 개별적 프라이머 세트는 PCR 산물이 단지 일부 균주의 DNA에서만 유래하도록 설계되었지만, 다른 균주는 그렇지 않으므로, 조합에서, 독특한 산물 밴드 패턴이 각 균주에 대해 관찰되었습니다.

PCR 기반 미생물 검출에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 우리는 중합효소 연쇄 반응의 원리를 살펴보았습니다. 환경 미생물로부터 추출한 DNA에 대해 PCR을 수행하기 위한 프로토콜; 마지막으로, 다양한 유형의 환경 또는 임상 샘플에서 관심 유기체를 테스트하기 위해 이 기술을 몇 가지 구체적으로 응용합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!