로블롤리 파인 PtGen2 cDNA Microarray 처리

이 비디오는 조지아 대학교의 워넬 산림 및 천연 자원 학교의 연구원들이 제작했습니다. 이 교육 비디오의 목적은 하이브리드화 전후에 어레이의 세척 및 취급에 특히 주의를 기울여 LOB 롤리 파인 pt, 2세대 CDNA, 마이크로어레이를 처리하는 방법을 자세히 설명하는 것입니다. 일반적으로 당사의 프로토콜은 Institute for Genomic Research Tiger 및 Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility(VMSR)에서 개발한 프로토콜을 따릅니다.

우리는 신호 품질의 균일성과 낮은 배경과 관련하여 최대한의 일관성을 제공하기 위해 PT Gen 2의 보다 엄격한 처리가 필요하다는 것을 발견했습니다. 첫 번째 단계는 사전 세척입니다. 우리가 이렇게 하는 이유는 스포팅 버퍼에 매우 높은 염분 함량이 포함되어 있고 해당 염분을 제거하기 위해 이 사전 세척이 필요하기 때문입니다.

슬라이드를 현미경 슬라이드 캐리어에 넣고 43도로 예열된 0.2% SDS 용액에 15-20회 격렬하게 낙하합니다. 슬라이드를 SDS 용액에서 세척한 후 집게로 조심스럽게 제거하여 사전 혼성화 완충액을 포함하는 Copeland 용기에 넣습니다. 이 버퍼에는 5개의 XSSC 0.1%SDS 및 1%BSA가 포함되어 있으며 43도에서도 가열됩니다.

Copeland 병은 퍼퓸으로 덮여 43도 인큐베이터에 1 시간 동안 배치됩니다. 사전 교잡 다음, 슬라이드는 현미경 슬라이드 캐리어로 제거되고 각 변경에서 15-20 번 급락하는 탈 이온수의 5 가지 변화를 통해 연속적으로 처리됩니다. 마지막으로, 슬라이드를 이소프로판올에 넣고 5-6회 담근 후 칩 M 메이트 원심분리기에서 원심분리하여 건조시킵니다.

원심분리 후 0.2미크론 필터를 통과한 압축 공기로 슬라이드를 불어냅니다. 그런 다음 슬라이드는 압축 공기로 청소된 리프터 슬립으로 오버레이되고 작은 피펫 팁을 사용하여 리프터 슬립을 올바른 위치로 조정합니다. 슬라이드에서.

리프터 슬립이 배치된 후 혼성화 버퍼가 추가되기 전에 챔버 끝에 위치한 습도 웰에 20마이크로리터의 100밀리몰 디히, 3개의 환초를 추가합니다. 이제 하이브리드화 버퍼에 다시 부유된 타겟 CDNA를 추가할 준비가 되었습니다. 피펫 팁은 리프터 슬립의 가장자리에 배치되고 슬라이드와 용액이 천천히 피펫팅됩니다.

우리는 모세관 효과를 사용하여 어레이를 로드하는 것이 가장 일관성을 제공하고 원치 않는 기포의 통합을 크게 줄인다는 것을 발견했습니다. 타겟 재료가 어레이에 추가된 후, 혼성화 챔버를 조립하고 알루미늄 호일로 덮습니다. 그런 다음 혼성화 챔버를 진탕 수조에 넣어 일반적으로 14-16시간 동안 하룻밤 배양합니다.

수조는 48도로 설정되고 셰이커는 50rpm으로 설정됩니다. 또한 혼성화 용액을 첨가하는 시점부터 모든 혼성화 세척 후 과정을 통해 절차가 광산화를 방지하기 위해 저조도에서 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 다음 날, 슬라이드를 혼성화 챔버에서 제거하고 53도로 예열된 세척 용액 1번이 들어 있는 Copeland 용기에 넣습니다.

슬라이드는 리프터 슬립이 떨어질 때까지 약 1분 동안 Copeland 용기에 남아 있을 수 있으며, 이 시점에서 슬라이드는 집게로 부드럽게 제거하고 현미경 슬라이드 캐리어에 넣어 세척을 진행합니다. 그런 다음 슬라이드를 두 번째 용기에 약 15-20회 격렬하게 밀어 넣으며 53도에서 1번 세척 용액을 포함합니다. 그런 다음 용기를 퍼퓸으로 덮고 53도 및 100RPM으로 설정된 인큐베이터 에어 셰이커에 넣습니다.

10분 배양 및 세척 용액(첫 번째) 후, 슬라이드를 실온에 있는 세척 용액 2번이 있는 용기에 15-20회 격렬하게 밀어 넣습니다. 이것은 파라 필름으로 덮이고 10분 동안 배양하기 위해 실온의 셰이커에 다시 놓습니다. 마지막으로, 슬라이드를 2번 세척액에서 제거하고 3번 세척액이 있는 용기에 15-20회 격렬하게 넣습니다.

그런 다음 슬라이드를 퍼필로 덮인 3번 세척 용액의 두 번째 용기로 제거하고 다시 10분 동안 셰이커에 놓습니다. 최종 세척 후 슬라이드를 원심 분리하여 완전히 건조시킵니다. 이를 위해 15mil Falcon 캡을 50mil 원뿔형 튜브에 배치하고 어레이 바코드 면이 아래로 향하게 하여 원뿔형 튜브에 배치합니다.

그런 다음 튜브는 실온에서 1500RPM으로 스윙 버킷 헤드에서 회전합니다. 원심분리 후, 슬라이드는 알루미늄 호일로 덮인 50mil 원추형 튜브의 두 번째 세트로 제거됩니다. 그런 다음 튜브를 질소 가스로 퍼지한 다음 0.22미크론 필터와 캡을 통해 여과하여 스캔할 때까지 운반하거나 보관합니다.

PerkinElmer 스캔 어레이 5, 000에서 스캔 데이터를 수집합니다. 어레이 이미지는 그리드화되고 원시 스캔 데이터가 처리되며 초기 데이터 분석은 Bio Discovery의 이미징 소프트웨어 제품군으로 수행됩니다. 다음으로, 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에서 다운로드할 수 있는 견고하고 자유롭게 사용할 수 있는 마이크로어레이 통계 패키지인 BRB 어레이 도구를 사용하여 통계 분석을 수행함에 따라 스폿 신호 강도 데이터가 정규화됩니다.

다른 통계 분석 및 유전자 발현 패턴 검색은 유전자 발현 패턴 및 분석 제품군 Jeep PPA를 사용하여 수행됩니다. 무료로 사용할 수 있는 또 다른 웹 기반 분석 패키지입니다. lob lolly pine PT Gen 2 마이크로어레이를 처리하는 방법에 대한 비디오를 시청해 주셔서 감사합니다.

다음 개인은 이 교육 비디오의 내용 및 제작을 담당했습니다.