S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

이 절차는 SLAC 대조군 균주와 무거운 동위원소 라이신 및 아르기닌에 있는 일반 아미노산을 포함하는 배지에서 미끼 균주를 배양하는 것으로 시작됩니다. 동일한 양의 두 균주를 분쇄 및 액체 질소 미처리 용해물로 혼합 및 용해하고, 먼저 원심 분리기로 펠릿화한 다음 스페로스 비드에 결합하여 제거합니다. 그런 다음 세포 용해물을 IgG 비드에 결합합니다.

IgG 비드에 결합된 단백질은 프로테아제, 분열 및 침전물에 의해 암시됩니다. 이제 시료를 질량 분석법으로 분석할 준비가 되었습니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 생명 과학 연구소 세포 환경 생물학과의 단독 연구실에서 근무하는 제시 차오입니다.

오늘은 silak이라는 정량적 단백질체학 분석 절차를 보여줍니다. 친화성 정제와 결합됩니다. 우리는 실험실에서 단백질 복합체를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

시작하겠습니다 이 절차에서 미끼 균주에는 일반 아미노산이 포함되어 있고 SLAC 대조군 균주에는 무거운 동위원소, 라이신 및 아르기닌이 포함되어 있습니다. 시작하려면 먼저 미끼 균주와 대조군 균주를 화면에 표시된 값으로 개별적으로 1리터씩 성장시킵니다. 다음으로, 배양액을 500ml Nalgene 원심분리기 튜브에 붓습니다.

2, 580 RCF에서 펠릿 셀의 하중 균형을 맞추고 매체를 디캔팅하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 세포를 50ml로 옮기는 동안 50ml의 차가운 D H2O로 원심분리 튜브는 튜브를 원심분리하여 3000RCF에서 세포를 펠릿화합니다. 이 시점에서 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 동결할 수 있습니다.

건조 펠릿 중량에 의해 일대일로 대조군 균주 배양을 미끼 균주 배양과 일치시키는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 세포 펠릿을 10ml의 NP 40 완충액에 1-2000 프로테아제 억제제 칵테일로 재현탁시킵니다. 한 튜브를 다른 튜브로 직접 디캔팅하여 두 세포 배양액을 혼합합니다.

먼저 세포 분쇄를 시작하려면 미리 냉각된 모르타르에 액체 질소를 붓고 완전히 증발시키십시오. 다음으로, 모르타르에 2ml의 세포를 추가합니다. 액체 질소를 부어 세포를 얼립니다.

세포가 미세해질 때까지 세포를 분쇄합니다. 가루. 모든 셀이 분쇄될 때까지 이 과정을 반복합니다. 세포가 해동되지 않도록 하십시오.

필요한 경우 액체 질소를 첨가하십시오. 다음으로 분말을 얼음처럼 차가운 비커에 옮겨 실온에서 해동합니다. 가장자리가 해동되기 시작하면 해동 후 20-200 PIC와 함께 20ml의 NP 40 버퍼를 추가합니다.

미처리 용해물을 40 millil Nalgene 튜브로 옮기고 Sovos SA 600 로터에서 16, 000 RPM으로 30분 동안 회전합니다. 기다리는 동안 300마이크로리터의 SRO B 비드 2개를 가져다가 300마이크로리터의 NP 40 버퍼에서 비드를 3회 세척합니다. 다음으로, 비드를 300마이크로리터 버퍼에 재현탁시켜 일대일 슬러리에

다음 단계는 세포 용해물을 미리 제거하는 것입니다. 이를 위해 먼저 슈퍼 나틴을 새 튜브로 옮기고 스페로스에 두 개의 B 비드를 추가합니다. 차가운 방의 회전 플랫폼에서 30 분 동안 배양하십시오.

배양하는 동안 300마이크로리터의 IgG SRO 6개의 비드를 취하고 300마이크로리터의 NP 40 버퍼에서 비드를 3회 세척합니다. 그런 다음 비드를 300마이크로리터 버퍼에 다시 부유시켜 일대일 슬러리에 있도록 합니다. 배양 후 SRO를 펠릿화합니다.

두 개는 구슬이 있습니다. 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 나중에 웨스턴 블로팅(western blotting)을 위해 세포 용해물의 부분 표본을 저장하는 것을 잊지 마십시오.

그런 다음 IgG 비드를 추가합니다. 보다 효율적인 결합을 위해 내용물을 두 개의 튜브로 분리하고 차가운 방의 회전 플랫폼에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 섭씨 4도의 크로마토그래피 컬럼에서 비드를 수집합니다.

언바운드 진영의 부분 표본을 반드시 저장하십시오. 10밀리리터로 구슬을 씻으십시오. NP 40 버퍼.

다음으로 3ml로 구슬을 씻으십시오. TEVC 버퍼. 다시 말하지만, 구슬의 부분 표본을 저장하는 것을 잊지 마십시오.

이것은 비드를 용리시키기 위한 결합의 효율성을 반영합니다. 먼저 1ml의 TEVC 버퍼에 5마이크로리터의 A-C-T-E-V를 추가합니다. 비드에 TEVC 버퍼를 추가하고 혼합합니다.

보다 효율적인 혼합을 통해 내용물을 두 개의 1.5 millil EINOR 튜브로 옮기고 밤새 냉장실의 회전 플랫폼에서 배양합니다. 다음으로, 비드를 스핀다운하고 용리액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 세척 후 추가로 0.5ml의 TEVC 버퍼로 비드를 세척합니다.

여덟 개를 하나의 튜브에 결합하십시오. 총 1.5ml의 ELU 8이 있어야 합니다. TEV Elu eight의 부분 표본을 저장하여 침전시킵니다.

부분 표본을 100% TCA와 함께 25% TCA로 조정합니다. 이렇게하려면 1.5 밀리리터 LU 8을 각각 750 마이크로 리터의 두 튜브로 분리하십시오. 튜브에 250마이크로리터의 100% TCA를 추가합니다.

당신의 솔루션은 유백색으로 변해야 합니다. 그런 다음 얼음 위에 30분 동안 놓습니다. 배양 후 혼합물을 주기적으로 와류로 만듭니다.

차가운 방에서 탁상용 원심 분리기에서 최대 속도로 30분 동안 회전합니다. 0.05 일반 염산을 함유한 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 아세톤으로 한 번 씻습니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 최대 속도로 5분 동안 회전합니다.

그런 다음 500마이크로리터의 얼음처럼 차갑게 한 번 세척하고 아세톤을 넣고 섭씨 4도에서 최대 속도로 5분 동안 회전합니다. 회전 후 아세톤을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 건조시켜 은 염색을 합니다. SDS 샘플 버퍼의 1배인 50마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다.

질량 분석 기반 분석을 위해 침전된 단백질을 사용할 계획이라면 에탄올을 사용하여 침전시키는 것이 좋습니다. 이를 먼저 수행하려면 20마이크로그램의 글리코겐을 첨가한 다음 100% 에탄올로 샘플을 5회 희석한 다음 pH 5.0에서 2.5몰 스톡으로 50밀리몰의 중탄산나트륨으로 조정합니다. 튜브를 뒤집어 용액을 혼합합니다.

실온에서 2시간 동안 그대로 두십시오. 마지막으로 내용물을 두 개의 einor 튜브로 나눕니다. 12에 10 분 동안 분리기분리에 의하여 침전된 단백질을 펠릿, 실내 온도에 000 GS.

정제 절차 중에 저장된 부분 표본에는 사전 세척된 세포 용해물, 결합 분획, 결합되지 않은 분획 및 용출된 분획이 포함되어야 합니다. 실험의 결합 및 용리 효율을 반영하기 위해 Antit TAP 항체 또는 은 염색을 사용하여 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 위 부분 표본의 단백질 함량을 분석하는 것이 좋습니다. 이 은색 염색 젤에서 SCS는 상호 작용 할 때 두 번 탭되며, 파트너를 시각화하고이 웨스턴 블롯에서 태그되지 않은 대조군과 비교했습니다.

SCS two tap의 정제 과정에서 취한 다양한 factions를 Antit tap 항체를 이용하여 Western blotting으로 분석하였다. SCS 2 tap은 TEV 프로테아제 절단에 의한 elucian 후 더 낮은 분자량으로 이동했으며, 용리 후 IgG 비드에 S SCS 2 tap이 남아 있지 않았습니다. 이를 통해 정제가 매우 효율적임을 확인했습니다.

IgG 비드를 사용한 친화성 정제를 통해 단백질 복합체를 정제하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 정제 절차를 시작하기 전에 기본 변형률과 제어 변형률을 건조 펠레 중량으로 일치시켜야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. LAC는 단백질 결합 파트너에 대한 비편향 및 큐(qued) 측정을 제공하기 때문에 시료 손실을 최소화하기 위해 탭 정제의 첫 번째 단계만 수행합니다.

상당한 양의 불특정 바인딩이 발생하는 경우 Cold Springing Harbor Manual에서 찾을 수 있는 전체 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

이봐, 어서, 마크. 아, 간다.