multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로

이 실험 절차의 전반적인 목적은 서로 다른 조건하에서 thal cord 막 내 MultiPro 복합체의 조성을 비교 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 혐기성 조건에 노출된 lamona 세포로부터 thal 막을 분리합니다. 그다음, th cord 막을 가용화하고 sucrose 밀도 구배를 통해 분획합니다.

그런 다음 원하는 분획물을 동일한 부피로 혼합하여 SDS page로 분리합니다. 마지막으로, kumasi로 염색된 밴드를 trypsin으로 소화시킵니다. 최종적으로, 정량 질량 분석법을 통해 샘플을 분석하여 조사된 분획물 간의 단백질 발현량 변화를 관찰합니다.

정해진 양의 단백질을 비교하는 정량 단백질체학 연구와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 본 접근 방식에서는 분획된 샘플의 동일한 부피를 결합하여 분석한다는 점입니다. 이를 통해 구배 내에서 단백질의 이동 거동을 연구할 수 있으며, 나아가 세 번째 그룹 막에 존재하는 다양한 비단백질 복합체의 조성을 분석할 수 있습니다. 적용된 균주와 관련하여, 텍스트 프로토콜에 따라 chlamydomonas rein hardy 균주를 배양한 후, 2 M sucrose, 10% beta DM 수용액 및 0.5 M Tris pH 8.0 스톡 용액을 사용하십시오.

14 by 89 millimeter 원심분리 튜브를 사용하여 수크로스 밀도 구배를 설정하기 위한 다음 용액들을 준비하려면, 먼저 1.3 molar 용액 1 milliliter를 천천히 붓고, 이어서 1.0 molar 용액 1 milliliter를 붓습니다. 그런 다음 0.85, 0.7, 0.65 molar 용액을 각각 2 milliliter씩 붓고, 마지막으로 0.4 molar 용액 2 milliliter를 붓습니다. 혐기성 조건을 유도하기 위해 밀도 구배 튜브를 저온실에 하룻밤 동안 보관하십시오.

클라미도모나스(chlamydomonas) 배양액이 담긴 배양 플라스크에 유리 피펫을 삽입하고, thylakoid 막을 분리하기 위해 지속적인 교반과 조명을 유지하며 4시간 동안 Argonne 가스를 버블링합니다. 배양 후, 2,500 ×g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 30 mL의 H1 완충액에 재현탁합니다.

원심분리를 반복하고 다시 부유시킵니다. 세포를 파쇄하기 위해 H one 완충액에 세포를 부유시킨 후, 1,500 Pascal의 질소 압력으로 네뷸라이저에 통과시킵니다. 세라믹 볼과 금속 사이의 거리가 세포가 파쇄될 수 있을 만큼 충분히 가까운지 확인하십시오.

그 다음 세포를 2,500 ×g, 4°C에서 7분 동안 원심 분리합니다. 상층액은 연한 녹색을 띠어야 합니다. 세포 파쇄가 성공적이었다면, 세포를 50 mL의 H two buffer에 다시 현탁하고 32,800 ×g, 4°C에서 10분 동안 원심 분리하여 펠렛을 형성합니다.

그런 다음 H three 완충액 10 milliliters로 세포를 재현탁한 후, potter를 사용하여 재현탁된 펠렛을 균질화합니다. 다음으로 thal cord 수크로스 밀도 구배를 준비하기 위해, H three 완충액에 담긴 세포 12 milliliters로 시작합니다.

그 다음 12 milliliters의 H four buffer를 천천히 층이 지게 붓고, 마지막으로 12 milliliters의 H five buffer를 붓습니다. H five buffer를 사용하여 로터를 균형 잡은 후, 70,700 ×g에서 1시간 동안 그래디언트를 원심분리합니다. 그래디언트에서 TH 밴드를 제거하고 적절한 부피의 H six buffer를 사용하여 희석합니다.

4°C에서 37,900 ×g로 20분 동안 세포를 원심 분리합니다. 펠릿이 단단하게 형성되지 않은 경우, 원심 분리 단계에서 H6 버퍼를 더 추가하십시오. 그 후 재현탁합니다.

광계 수크로스 밀도 구배(sucrose density gradient)를 로딩하기 위해 thal cords를 소량의 H six 버퍼에 현탁합니다. 먼저 각 구배에 필요한 thal cords, beta DM 및 H six 버퍼의 양을 계산하십시오. 이 지침에 따라 각 구배는 0.9% beta DM 내의 0.8 mg/mL 엽록소를 포함하며, H six 버퍼를 사용하여 최종 부피를 700 µL로 맞춥니다.

thylakoid를 가용화하기 위해, 각 구배(gradient)별로 Thylakoids beta DM과 H six 버퍼가 포함된 Eloqua를 각각 준비합니다. 샘플을 얼음 위에서 20분 동안 배양하며, 혼합을 위해 몇 분마다 한 번씩 뒤집어 줍니다. 이후 샘플을 4°C에서 14,000 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다.

펠렛은 작고 흰색이어야 하며, 상층액은 짙은 녹색을 띱니다. 상층액을 H six 버퍼와 함께 구배 균형 장치에 로딩하고, 4°C에서 134,470 ×g로 14시간 동안 초원심분리합니다. 원심분리 후, 분획을 하기 전에 구배의 사진을 찍습니다.

바늘을 사용하여 튜브 바닥에 구멍을 뚫고 500 µL 튜브에 분획을 수집합니다. 또는 96 웰 플레이트 공정을 사용하십시오. 여기에 제시된 텍스트 프로토콜에 따라, 야생형의 면역 혈액 분석 분획 6과 delta PS1의 분획 13의 결과를 사용하여 젤 소화 및 질량 분석을 위한 SDS-PAGE 샘플을 준비합니다.

본 그림에서는 cyclic electron flow super complex 성분 분석을 위해 A와 R1의 피크 분획을 선택하였습니다. 여러 PS1 코어 단백질, PS1의 light harvesting 단백질, 그리고 cyclic electron flow super complex로 할당된 단백질들에 대해 wild type 대비 delta PS1 14N/15N으로 표시된 상대적 단백질 비율을 나타내었습니다. wild type과 delta PS1의 분획 6 및 13에서 나타난 NDR1과 CAS의 함량 차이는 이들이 해당 complex의 새로운 성분임을 시사합니다. 여기에는 wild type과 PGL1 knockout 균주 간의 cyclic electron flow super complex에 대한 정량적 비교 결과가 제시되어 있습니다. 흥미롭게도 HCF136, cytochrome b6, cytochrome b6f subunit 4 및 PETC는 wild type에서 풍부한 것으로 보이며, FTSH2, cytochrome f 및 PETO는 PGL1에서 더 풍부한 것으로 보입니다.

이 영상을 시청하고 나면, 서로 다른 조건에서 액체 막 내 MultiPro 복합체의 조성을 비교하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 액체 막의 성공적인 제조와 환형 전자 흐름의 분리를 위해서는 슈퍼 복합체 세포 파쇄, 세포 파쇄 및 액체 막의 안정화 단계가 매우 중요하다는 점을 유념하십시오. 또한, 광합성 복합체의 완전한 분리를 달성하기 위해서는 자당 밀도 구배를 최소 12시간 동안 원심분리해야 합니다.