multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로 ¹⁵ N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 조건에서 탯줄 막의 MultiPro 복합체 구성을 비교적으로 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 혐기성 조건에 노출된 층세포에서 탈막을 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, th cord membranes는 sucrose density gradient 상에서 가용화되고 분획된다.

그런 다음 원하는 분획의 동일한 부피가 SDS 페이지에서 혼합되고 분리됩니다. 마지막으로, 쿠마시 염색 밴드는 트립신으로 소화됩니다. 궁극적으로, 샘플은 조사된 분획 사이의 단백질 풍부도 변화를 관찰하기 위해 정량적 질량 분석법으로 분석됩니다.

정의된 양의 단백질을 비교하는 정량적 단백질체학 연구와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 당사의 접근 방식에서 동일한 부피의 분획된 샘플을 결합하고 분석한다는 것입니다. 이를 통해 구배 내에서 단백질의 이동 거동을 연구할 수 있으며, 또한 세 번째 그룹 막에서 서로 다른 비단백질 복합체의 구성을 분석할 수 있습니다. 적용된 균주와 관련하여 텍스트 프로토콜에 따라 클라미도모나스 고삐 강건 균주를 배양한 후 2개의 몰 자당, 물에 10%베타 DM 및 0.5몰 trice pH 8.0의 원액을 사용합니다.

14 x 89mm 원심분리 튜브를 사용하여 그래디언트를 설정하기 위해 자당 밀도 구배에 대한 다음 용액을 준비하려면 먼저 1ml의 1.3몰 용액을 천천히 부은 다음 1ml의 1.0몰 용액을 붓습니다. 그런 다음 0.85, 0.7, 0.65, 마지막으로 0.4 몰 용액을 각각 2 밀리리터씩 붓습니다. 혐기성 상태를 유발하기 위해 그라디언트를 추운 방에서 밤새 보관하십시오.

클라미도모나스 배양액에서 유리 피펫을 배양 플라스크에 삽입하고 타르 탯줄 막을 분리하기 위해 연속 교반과 조명으로 아르곤으로 4시간 동안 거품을 냅니다. 배양 후 중력의 2, 500배 및 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 펠릿화하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 resus는 세포 펠릿을 30ml의 H 1 완충액에 현탁시킵니다.

원심분리를 반복하고 다시 소생시킵니다. 세포를 H 1 buffer에 현탁시켜 세포를 분리하고 질소 압력이 1, 500 Pascals인 분무기를 통해 통과시킵니다. 세라믹 볼과 금속 사이의 거리가 세포가 깨질 수 있을 만큼 충분히 작은지 확인하십시오.

그런 다음 중력의 2배, 500배, 섭씨 4도에서 7분 동안 셀을 회전시킵니다. 상등액은 연한 녹색이어야 합니다. 세포 파괴가 성공적이면 resus는 세포를 50ml의 H 2 버퍼에 현탁시키고 중력의 32배, 800배 및 섭씨 4도에서 10분 동안 펠릿화합니다.

그런 다음 Resus를 10ml의 H 3 버퍼에 세포를 현탁시킨 후 포터를 사용하여 재부유된 입천장을 균질화합니다. 다음으로 thal cord sucrose density gradient를 준비합니다. H 3 buffer에 12ml의 세포로 시작합니다.

그런 다음 12 밀리리터의 H 4 버퍼 층을 천천히 붓고 12 밀리리터의 H 5 버퍼로 마무리합니다. H 5를 사용하여 로터의 균형을 맞추고 70, 700배 중력에서 1시간 동안 기울기를 원심분리합니다. 그래디언트에서 TH 밴드를 제거하고 적절한 부피의 H 6 버퍼를 사용하여 희석합니다.

섭씨 4도에서 20분 동안 중력 37, 900배에서 셀을 스핀다운합니다. 펠릿이 단단하지 않으면 원심분리 단계에 H six 버퍼를 더 추가합니다. 그런 다음 소생합니다.

소량의 H 6 버퍼에 탈 코드를 매달아 사진 시스템 자당 밀도 구배를 로드합니다. 먼저 각 그래디언트에 필요한 thal cords, beta DM 및 H six buffer의 양을 계산합니다. 이 지침에 따라 각 그래디언트는 0.9%베타 DM에 엽록소 밀리리터당 0.8mg을 포함하고 H six Buffer는 최종 부피를 최대 700마이크로리터까지 가져옵니다.

thys를 용해시키려면 각 그래디언트에 대해 Thylakoids beta DM 및 H six buffer가 있는 별도의 Eloqua를 준비합니다. 얼음 위에서 샘플을 20분 동안 배양하고 몇 분마다 뒤집어 섞습니다. 14, 000배 중력에 표본을 10 분 및 4 섭씨 온도에 원심 분리하기 후에.

펠릿은 작고 희끄무레해야 하며 상등액은 짙은 녹색이어야 합니다. H 6 버퍼와 134, 470 배의 중력에서 14시간 동안 섭씨 4도의 온도에서 초원심분리기를 사용하여 그래디언트 저울에 상등액을 로드합니다. 스핀 후 그라디언트 사진을 찍은 다음 분별합니다.

바늘을 사용하여 튜브 바닥에 구멍을 뚫고 500마이크로리터 튜브에 분획을 수집합니다. 또는 96웰 플레이트 공정. 여기에 표시된 텍스트 프로토콜에 따라 겔 분해 및 질량 분석법의 SDS 페이지에 대한 샘플은 야생형의 분획 6 및 델타 PS 원의 분획 13의 면역 혈액 분석 결과를 사용합니다.

A와 R 1의 피크 분율은 이 그림에서 순환 전자 흐름 초복합 성분의 분석을 위해 선택되었습니다. 여러 PS 1 코어 및 PS 1의 광 수확 단백질에 대해 델타 PS 1 14 N 이상 15 N에 걸쳐 야생형으로 묘사 된 상대 단백질 비율과 순환 전자 흐름 슈퍼 복합체에 할당 된 단백질이 NR 1 및 CAS의 풍부도 차이로 표시되며, 야생형과 델타 PS 1의 분획 6 및 13에서 NR 1 및 CAS의 풍부도 차이는 이들이 도시된이 복합체의 새로운 구성 요소임을 시사합니다 다음은 야생형과 PG L one 녹아웃 변형주 사이의 이 순환 전자 흐름 슈퍼 복합체의 정량적 비교에 대한 결과입니다. 흥미롭게도, HCF 1 36, 시토크롬 B 6, 시토크롬 B 6 F 서브유닛 4 및 PET C는 야생형에서 농축된 것으로 보이며, FTSH 2, 사이토크롬 F 및 PET O는 PG L 1에서 농축된 것으로 보입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다양한 조건에서 액체 멤브레인의 MultiPro 복합체의 구성을 비교하는 방법을 잘 이해할 수 있습니다. 액체 막의 성공적인 준비와 순환 전자 흐름의 격리를 위해서는 매우 복잡한 세포 파괴, 세포의 포터링 및 액체 막의 화가 중요한 단계임을 명심하십시오. 또한, 자당 밀도 구배는 광합성 복합체의 완전한 분리를 달성하기 위해 최소 12시간 동안 원심분리되어야 합니다.