향상제 시퀀스를 평가하기위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

안녕하세요, 저는 펜실베니아 대학교 세포 및 발달 생물학과의 Shannon Fisher 실험실의 Erica Kgi입니다. 저는 역시 피셔 랩(Fisher Lab)의 크리스 웨버(Chris Weber)입니다. 저는 섀넌 피셔입니다.

오늘은 제브라피시 형질전환(transgenesis)을 사용하여 인핸서 엘리먼트(enhancer elements)의 기능을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차를 사용하여 골격 발달에 중요한 유전자의 전사 규칙을 연구합니다. 시작하겠습니다.

후보 유전자를 둘러싼 비암호화 염기서열을 식별하기 위해 uc SC 게놈 브라우저에서 트랙으로 액세스할 수 있는 알고리즘 fast cons를 사용합니다. 우리는 주로 골격 발달 중에 발현되는 유전자에 관심이 있지만, 초기 발달 과정에서 발현되는 모든 유전자를 연구하는 데에도 동일한 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 여기에 표시된 예에서는 보존된 염기서열을 식별했습니다.

human bumper 유전자를 둘러싼 구간에서 인접 유전자에 대한 전체 구간을 검사하고 비암호화 염기서열의 상위 5%에 해당하는 낮은 크기 특이적 로그 점수 컷오프를 결정합니다. 서열을 선정한 후, 인간 유전체학의 각 염기서열을 증폭하기 위해 프라이머 3을 사용하여 프라이머를 설계하고, DNA 프라이머를 선택하여 보존 영역과 양쪽에 30개 이상의 염기쌍을 증폭해야 합니다. 인간 게놈 DNA를 사용하여 고품질 중합효소로 관심 영역을 증폭하고, 표준 실험실 분자 생물학 절차를 사용하여 증폭된 산물을 발현 벡터로 클로닝합니다.

이 프로토콜에서 사용되는 벡터는 PG wc FOS GFPA 게이트웨이입니다. 대상 벡터입니다. 다음 벡터 생성은 전치하라는 지시를 받았습니다.

전위에 필요한 효소는 실험적 주입 전에 Ambion의 M message M 기계 키트와 PGB 600 플라스미드를 사용하여 먼저 in vitro에서 전사합니다. 마우스 양말과 같은 알려진 인핸서를 주입하여 전치의 각 배치를 효능에 대해 테스트합니다. 10 인핸서.

주사를 준비하려면 Sutter P 1.2 마이크로피펫 풀러의 97mm 필라멘트 모세관 유리에서 미세 주입에 사용되는 바늘을 당깁니다. 깨끗한 면도날과 마이크로미터 슬라이드로 손상되지 않은 코리온을 관통하기 위해 날카로운 테이퍼가 있는 강력한 팁을 생성하는 프로그램을 사용하십시오. 실체 현미경으로 팁을 손으로 약 15마이크로미터의 외경으로 부수십시오.

바늘은 뚜껑이 있는 담는 접시에 하루 동안 보관할 수 있습니다. 마이크로 주사를 수행하기 전날 표준 조건에서 14시간 동안 빛을 발하는 규칙적인 밝고 어두운 주기로 얼룩말 물고기 개체군을 유지합니다. 작은 번식 탱크에서 시간 제한 짝짓기를 위해 물고기를 준비합니다.

광 주기가 시작된 직후 마이크로 주입 아침에 탱크당 3명의 암컷 또는 2명의 수컷을 나란히 줄로 놓습니다. 계란 생산을 위해 깨끗한 시스템 처리 된 물에 수컷과 암컷을 결합하십시오. 물고기를 자주 확인하고 생산 후 몇 분 이내에 알을 수집하여 잘 동기화된 배치를 얻으십시오.

오전 내내 신선한 생선 그룹을 라텍스 전구가 장착된 넓은 구경의 5인치 및 1/4인치 유리 피펫과 계속 결합하여 2-3시간 동안 계란 생산을 유지하십시오. 수집된 배아를 60 x 15mm 페트리 접시로 분류하고, 50개의 배아 그룹으로 배아 배지로 부분적으로 채웁니다. 각 접시의 뚜껑에 수집된 시간을 표시하십시오.

수집된 배아의 각 클러치에 대해, 난자 채취 사이에 주입된 통제를 위해 50개의 배아 접시를 저장하십시오. 마이크로 퍼지 튜브에 다음 성분을 혼합하여 신선한 주입 용액을 준비하고 얼음에 보관하십시오. 접시를 담고 있는 주사 바늘을 놓고 1.5-2마이크로리터의 주사 용액을 채웁니다.

각 바늘의 넓은 끝 부분에 500나노리터 방울을 피펫팅합니다. 액체는 모세관 작용을 통해 팁으로 당겨집니다. 각 주사 용액에 대해 최소 두 개의 바늘을 준비합니다.

채워진 바늘을 공압식 피코 펌프 또는 이와 유사한 압력 인젝터의 휴대용 바늘 홀더에 로드합니다. 제조업체의 지침에 따라 질소 탱크에 구성 및 연결되었습니다. 마이크로미터 슬라이드에서 광유로 방출되는 액적의 직경을 측정하여 주입량을 보정하며, 일반적으로 주입 시간은 120밀리초입니다.

20PS의 압력으로 6-10배 배율에서 실체 현미경을 사용하여 약 1나노리터의 물방울을 생성합니다. 한 쌍의 미세한 집게로 배아를 제자리에 고정하고 코리온을 통해 일정한 압력으로 주사 바늘을 1 세포 또는 초기 2 세포 단계에서 배아의 난황으로 밀어 넣고, 바늘 끝을 할구 바로 아래의 난황에 위치시키고, 약 1리터의 주사 용액을 배출하고, 주입이 완료된 후 200개 이상의 배아를 주입하는 각 구조물에 대해 바늘을 빼냅니다. 수정되지 않은 난자, 손상된 배아, 주사 실패 또는 신성 모독자에 페놀이 붉은색이 없는 배아를 제거하여 배아를 분류합니다.

그런 다음 관찰을 위한 적절한 시간이 될 때까지 섭씨 28.5도에서 배아와 배아 배지를 배양합니다. 이제 제브라피시 배아에서 GFP 발현의 조직 특이적 패턴을 생성하는 인핸서 요소의 몇 가지 대표적인 결과를 보여드리겠습니다. 우리는 임신 중 뼈나 연골에서 발현되는 유전자를 연구합니다.

다음은 수정 후 3일 후에 두개골 안면 연골의 발현을 조절하는 acan 유전자의 상류에 있는 인핸서 요소의 예입니다. 이번에는 뼈 세포의 발현을 조절하는 범퍼 유전자의 또 다른 인핸서가 있습니다. 우리가 확인한 많은 인핸서 중 5일 동안, 우리는 유전자에 상대적인 위치와 발현 조절 사이의 상관관계를 거의 발견하지 못했습니다.

검사할 염기서열을 선택할 때, 인핸서(enhancer)는 유전자의 수백 킬로베이스(kilobases) 상류 또는 하류 또는 이 배아에서 볼 수 있는 인트론(intron) 중 하나에 있을 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 염기서열의 상당 부분은 조직 특이적 발현을 조절하는 것으로 보이지 않습니다. 이들은 종종 형광이 거의 나타나지 않거나 이소성 발현을 위한 두 가지 공통 부위인 표피와 골격근에 몇 개의 흩어져 있는 세포를 가질 수 있습니다.

방금 염기서열 보존을 통해 잠재적인 인핸서 요소를 식별하고 제브라피시의 모자이크 형질전환을 통해 그 기능을 테스트하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 주사를 위한 DNA와 RNA의 품질을 검사하는 것이 중요합니다. 또한, 주입된 모든 배아를 주의 깊게 검사해야 하며, 특히 소규모 판매 그룹에서만 발현을 기대하는 경우 더욱 그렇습니다.

그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.