정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

replisome의 운명과 충돌을 따라 정면에서 RNA 효소 (RNAP) 알 수 있습니다. 우리는 DNA에서 RNAP를 생기죠 후 신장을 replisome 정면에 RNAP와 충돌시 포장 마차지만, 이력서 것을 발견했습니다. Mfd은 충돌 후 RNAP의 변위를 촉진하여 복제 다시 시작을 추진하고 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 정면 충돌 후 Repli 영역과 RNA 중합효소 또는 RNAP의 운명을 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 비오틴화된 DNA에 전사 복합체를 조립하고 이를 Stripp 정제 및 비드에 고정시켜 RNAP 신장 복합체를 중단시킴으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 preen pre-need forked DNA를 RNAP 신장 복합체에 접합하여 head-on RNAP의 다운스트림에 복제 포크를 형성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 repli 영역을 조립하고 복제 분기점에서 선행 가닥 합성을 시작하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 마그네틱 비드에서 DNA를 분리하고 PCR 클린업 컬럼을 통해 DNA를 정제하는 것입니다. 궁극적으로, 정제된 방사성 표지된 DNA 산물의 알칼리성 아그로 겔을 통해 head-on transcription complex와 충돌할 때 roso가 실속한다는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 록펠러 대학의 마이크 오도넬 연구실의 리처드 포메란스입니다. 오늘은 고체상에서 RNA 중합효소에서 리보솜과 헤드의 충돌을 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다. 저는 DNA를 따라 전사 복합체가 복제 과정에 어떤 영향을 미치는지 연구하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용합니다.

시작하겠습니다. 이 프로토콜 믹스를 시작하기 위해 100마이크로리터의 버퍼 A에 T seven A one promoter를 함유한 비오틴화된 3.6KB DNA 템플릿이 있는 RNAP 홀로 효소를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 10분 배양 후 리보뉴클레오티드 아데노신, 트리포스페이트, 시티딘 포스페이트, 아덴 대립유전자 우리딘을 첨가하여 RNA 합성을 20개의 뉴클레오티드로 제한합니다.

용액을 섭씨 37도에서 추가로 10분 동안 배양하여 중단된 RN ape elongation complex를 비드에 고정시킵니다. streptavidin 코팅된 마그네틱 비드에 용액을 추가합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.

0.9ml의 고염 완충액으로 비드를 세척하여 고정되지 않은 정지 RNAP 신장 복합체를 정제합니다. 각 세척 후 비특이적 R-N-A-P-D-N-A 복합체를 제거하려면 자기 분리로 상층액을 제거합니다. 이 세척은 5 번 반복해야합니다.

그런 다음 비드를 0.9 밀리리터의 완충액 A.로 두 번 더 세척해야 합니다.최종 세척 후, 다운스트림 복제 포크를 조립하여 head-On RNAP Resus의 다운스트림에 복제 포크를 형성하고, New England Biolabs 버퍼 4의 100마이크로리터에서 중단된 RNAP 신장 복합체에 부착된 명백한 비드에 마그네틱 스트립을 매달아 놓을 수 있습니다. 다음으로 새우 알칼리성 인산가수분해효소 10단위 또는 SAP 1을 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 완충기 A.의 0.9 밀리리터로 구슬을 3 번 세척하십시오.그런 다음 빠른 T 4 ligation 반응 완충액의 50 마이크로 리터에 있는 구슬을 다시 현탁하십시오.

2마이크로리터의 quick T four ligase와 pre-need forked DNA를 추가하고 실온에서 10분 동안 용액을 배양합니다. 마지막으로, 0.9ml의 완충액 A 믹스 헥사머, 마그네틱 스트렙 A가 있는 DNAB 헬리카제, 정지된 RNAP 신장 복합체 및 다운스트림 복제 포크에 부착된 비드로 비드를 세 번 더 세척합니다. 150마이크로리터의 버퍼 A에 용액을 준비하고 섭씨 23도에서 30초 동안 배양합니다.

섭씨 23도에서 32번째 짧은 배양 후. 중합효소 3 베타 클램프에서 A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P 알파 P 32는 DGTP를 표시하고 알파 P 32는 DATP를 200 마이크로 리터의 부피로 표시합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

단일 가닥 DNA 결합 단백질인 DCTP 및 DTTP를 추가하여 복제를 시작합니다. 또한 DTTP 및 DCTP로 표시된 알파 P 32를 250마이크로리터의 최종 부피에 추가합니다. 10분 후 12마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 첨가하여 반응을 종료합니다.

다음으로, strp din beads를 끓여서 beads에서 DNA를 분리합니다. 섭씨 50도에서 30분 동안 proteinase K로 비드를 처리하여 잔류 DNA를 제거합니다. 비드를 다시 끓여서 자기 분리로 상층액을 제거합니다.

Kyogen PCR cleanup kit를 사용하여 DNA를 포함하는 결합된 상등액을 정제합니다. 마지막으로, 알칼리성 aros gel에서 정제된 무선 라벨 DNA 산물을 분석합니다.RNAP의 헤드와 영역이 충돌하면 일반적으로 길이가 2.5KB와 3.6KB인 두 개의 제품이 생성됩니다. 2.5KB 곱은 포크에서 중단된 RNAP까지의 DNA 길이를 나타냅니다.

이는 RNAP와의 충돌 시 repli가 지연된 결과입니다. 3.6 KB 산물은 전체 길이 DNA를 나타내며 RNAP에 의한 promoter의 불완전한 점유 또는 head-on RNAP의 부분 repli readthrough의 결과입니다. 좋은 결과는 약 50%의 전장 DNA가 생성된다는 것을 보여줍니다.

그러나 일부 경우에는 RNAP에 의한 promoter의 점유가 적고 full length DNA의 더 높은 비율이 관찰됩니다. 이는 중단된 RNAP가 없을 때 RNAP 복제에서 헤드를 만나지 않기 때문에 전체 길이 DNA만 생성되기 때문이며, DNA에 결합된 중단된 RNA 중합효소 신장 복합체가 있는 상태에서 복제 및 고체상을 수행하는 방법을 방금 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 중단된 전사 복합체를 고염으로 세척하여 DNA에 비특이적으로 결합하여 복제를 억제하는 과도한 RNA 중합효소를 제거하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.