정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

이 절차의 전반적인 목표는 정면 충돌 후 Repli zone과 RNA polymerase(RNAP)의 운명을 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 biotinylated DNA 상에 전사 복합체를 조립하고 이를 Stripp tablet 및 bead에 고정함으로써 RNAP 신장 복합체가 정지된 상태를 유도하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 RNAP 신장 복합체에 pre-need forked DNA를 결합하여 정면 충돌한 RNAP의 하류에 복제 포크를 형성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 repli zone을 조립하고 복제 분기점에서 선도 가닥 합성을 개시하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 자기 비드로부터 DNA를 분리하고 PCR 정제 컬럼을 통해 DNA를 정제하는 것입니다. 최종적으로, 정제된 방사성 표지 DNA 생성물의 알칼리성 아가로스 겔 전기영동을 통해 roso가 정면 충돌 전사 복합체와 충돌 시 정지함을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 로크펠러 대학교의 Mike O'Donnell 연구실 소속 Richard Pomerance입니다. 오늘은 고상(solid phase)에서 리보솜과 RNA polymerase의 정면 충돌을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 DNA를 따라 형성된 전사 복합체가 복제 과정에 어떤 영향을 미치는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하기 위해, RNAP holo enzyme과 T7 A1 프로모터를 포함하는 biotinylated 3.6 KB DNA 템플릿을 buffer a 100 µL에 혼합합니다. 이 혼합물을 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 10분간의 배양 후, RNA 합성이 20 뉴클레오타이드로 제한되도록 리보뉴클레오타이드인 adenosine triphosphate, cytidine phosphate 및 uridine을 첨가합니다.

정지된 RN ape 신장 복합체를 비드에 고정시키기 위해 용액을 37°C에서 10분 동안 더 배양합니다. 해당 용액을 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비드에 첨가합니다. 혼합물을 상온에서 10분 동안 배양합니다.

0.9 milliliters의 고염 농도 버퍼(high salt buffer)로 비드를 세척하여 고정된 정지 상태의 RNAP 신장 복합체를 정제합니다. 매 세척 후 비특이적 R-N-A-P-D-N-A 복합체를 제거하기 위해 자기 분리를 통해 상층액을 제거합니다. 이 세척 과정은 5회 반복해야 합니다.

그런 다음 비즈를 0.9 milliliters의 버퍼 A로 두 번 더 세척해야 합니다. 최종 세척 후, head-On RNAP 하류에 복제 분기점을 형성하도록 하류 복제 분기점을 조립할 수 있습니다. 정지된 RNAP 신장 복합체에 부착된 비즈를 100 microliters의 New England Biolabs 버퍼 4에 현탁하여 자성 스트립을 띄웁니다. 다음으로, 10 units의 shrimp alkaline phosphatase 또는 SAP 1을 첨가하고, 샘플을 37 degrees Celsius에서 10분 동안 배양합니다. 비즈를 0.9 milliliters의 버퍼 A로 세 번 세척합니다. 그런 다음 비즈를 50 microliters의 quick T 4 ligation 반응 버퍼에 재현탁합니다.

2 µL의 quick T4 ligase를 추가하고 pre-need forked DNA와 함께 실온에서 10분 동안 반응시킵니다. 마지막으로, 0.9 mL의 buffer A로 비드를 3회 더 세척합니다. 정지된 RNAP 신장 복합체 및 하류 복제 포크가 결합된 magnetic strep A 비드에 hexamer, DNA helicase를 혼합합니다. 150 µL의 buffer A로 용액을 조제하고 23 °C에서 30초 동안 반응시킵니다.

23°C에서 짧게 32번째 배양을 마친 후, polymerase three beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, α P 32 표지 DGTP 및 α P 32 표지 DATP를 최종 부피 200 µL가 되도록 첨가합니다. 해당 샘플을 37°C에서 5분 동안 배양합니다.

단일 가닥 DNA 결합 단백질, DCTP 및 DTTP를 첨가하여 복제를 개시합니다. 또한, 최종 부피가 250 µL가 되도록 $\alpha$ P 32로 표지된 DTTP와 DCTP를 첨가합니다. 10분 후, 0.5 M EDTA 12 µL를 첨가하여 반응을 종료합니다.

다음으로, 스트렙타비딘 비드를 끓여 비드에서 DNA를 분리합니다. 50 °C에서 30분 동안 프로테이나제 K(proteinase K)로 비드를 처리하여 잔류 DNA를 제거합니다. 비드를 다시 한번 끓인 후 자성 분리를 통해 상층액을 제거합니다.

Kyogen PCR cleanup 키트를 사용하여 DNA가 포함된 혼합 상층액을 정제합니다. 마지막으로, 정제된 방사성 표지 DNA 생성물을 알칼리성 아가로스 겔로 분석합니다. 구역(zone)과 RNAP가 정면으로 충돌하면 보통 2.5 KB와 3.6 KB 길이의 두 가지 생성물이 생성됩니다. 2.5 KB 생성물은 포크(fork)에서 정지된 RNAP까지의 DNA 길이를 나타냅니다.

이는 RNAP와의 충돌로 인해 복제 포크(replisome)가 정지됨으로써 발생합니다. 3.6 KB 생성물은 전체 길이의 DNA를 나타내며, 이는 RNAP의 프로모터 점유가 불완전하거나 정면으로 충돌한 RNAP를 복제 포크가 일부 통과했기 때문에 발생합니다. 양호한 결과에서는 전체 길이 DNA가 약 50% 생성됩니다.

하지만 일부 경우에는 RNAP의 프로모터 점유율이 낮아져 더 높은 비율의 전장 DNA가 관찰됩니다. 이는 정지된 RNAP가 없는 상태에서 더 많은 수의 복제 구역이 RNAP와 정면으로 충돌하지 않으므로 전장 DNA만 생성되기 때문입니다. 지금까지 DNA에 결합하여 정지된 RNA 중합효소 신장 복합체가 존재하는 상태에서 복제 및 고상 분석을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, DNA에 비특이적으로 결합하여 복제를 방해하는 과잉 RNA 중합효소를 제거하기 위해 정지된 전사 복합체를 고농도 염으로 세척하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.