Name: 정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 배우세요 정면 RNA 중합효소와 충돌한 후 복제체의 운명을 관찰하는 방법을. Mfd가 복제 재시작을 촉진하는 역할과 DNA 복제 동역학에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

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우리는 RNAP와 Mfd 단백질과 표현 벡터를 제공하는 세스 다라 특히 감사합니다. 우리는 또한 기술 지원을 GreB와 댄 장를 제공 세르게이 Borukhov 감사합니다. 이 작품은 건강 (MOD)의 국립 연구소에서 교부금에 의해 및 마리 - 조시와 록펠러 대학 (RTP)에서 헨리 Kravis 원정대에 의해 지원되었다.

이 방법에 보고된 연구에 사용된 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz와 오도넬, 과학 327, 590-592 (2010)</a> . 1. 중단 RNAP의 연신율 복잡한 조립은 다음과 같이 수행되었습니다 E. 500 NM 최종 농도 콜리 RNAP 사람은 (20 MM 트리스 - CL (산도 7.5), 8 MM MgCl 2, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 버퍼 100 μl의 T7A1 모터를 포함하는 biotinylated 3.6 이하 DNA 템플릿 5 NM 최종 농도로 혼합했다 70 σ 37 10 분 MM DTT, 10 % 글리세롤) ° C. APU 40 μm의 GTP, ATP와 CTP의 각 100 μm의는 37 추가 10 분 ° C.에 추가되었습니다 2. streptavidin 비즈에 중단 RNAP의 신장 복합 고정은 다음과 같이 수행되었습니다 streptavidin 자기 코팅 구슬 (Invitrogen) 200 μl는 방 온도에서 10 분 이상 반응 추가되었습니다. 3. 고정 중단 RNAP의 신장 복합 정제는 다음과 같이 수행되었습니다 구슬이 (위에서) 버퍼의 0.9 ML 포함하는 0.75 M NaCl, 200 μg / ML의 헤파린, 20 μg / ML 다음 ssDNA (뜨는은 자기 분리하여 각 세척 단계 후 삭제되었습니다.) 5 번 씻어되었습니다 구슬은 버퍼 A.의 0.9 ML로 2 번 씻어되었습니다 4. :에 정면 RNAP 다음과 같이 수행되었다 하류 상대 복제 포크의 형성 구슬이 (위에서) 뉴잉글랜드 Biolabs 버퍼 4 삽 I (뉴잉글랜드 Biolabs) 10 단위 100 μl에 resuspended되었습니다 것은 37 10 분 추가되었습니다 ° C. 구슬은 버퍼의 0.9 ML 3 번 씻어 후 빠른 T4 결합 반응 버퍼 (뉴잉글랜드 Biolabs) 50 μl에 resuspended되었습니다. 빠른 T4 ligase (뉴잉글랜드 Biolabs) 2 μl는 방 온도에서 10 분 사전 annealed 포크드 DNA 6 nm의 최종 농도 (RP10, RP22, RP25)와 함께 추가되었습니다. 구슬은 버퍼 A.의 0.9 ML 3 번 씻어되었습니다 5. 복제 분기점에서 최고의 스트랜드 합성의 replisome와 개시의 총회는 다음과 같이 수행되었습니다 DnaB (hexamer 등)의 448 pmol는 버퍼의 비즈 150 μl와 incubated되었습니다 (20 MM 트리스 - CL (산도 7.5), 8 MM MgCl 2, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 MM DTT, 10 % 글리세롤) 30 s에 대한 23 ° C. 투표소 III의 4.9 pmol * (폴 III HE 마이너스 β), β 15 pmol, 2 MM ATP, 60 μm의 dGTP 및 dATP 각각 200 μl의 볼륨에 추가 37에서 추가로 5 분 ° C.를 incubated되었습니다 복제가와 함께 10 μg SSB와 24 μm의 dATP와 dTTP 각 추가시 시작되었다 [α - 32 P] dTTP와 [α - 32 P] dCTP (특정 활동, 3,000-5,000 CPM / pmol) 250 마지막 볼륨 μL. 반응 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 12 μl를 추가시 10 분 이후에 종료되었습니다. 6. 정화 및 라디오 레이블이 붙은 DNA 제품의 농도는 다음과 같이 수행되었습니다 반응이 구슬에서 DNA를 제거하기 위해 종료 후에 구슬이 (위에서) 삶은되었습니다. 비즈에 연결된 나머지 잔여 DNA는 50 30 분 10 UL의 볼륨에 proteinase K와 구슬을 치료 ° C.를하여 제거되었습니다 구슬 그런 다음 삶은되었으며 뜨는은 자기 분리에 의해 제거되었습니다. DNA를 포함하는 결합 뜨는은 Qiagen PCR 정리 키트를 사용하여 정화되었다. 라디오 표시 DNA 제품은 다음 알칼리성 아가로 오스 겔에서 분석되었다 정화. 정면 RNAP 신장 복합은 위와 같이 수행되었다 중단 단, σ 70 부재에 * 복제가 생략되었습니다. 대표 결과 : 함께 replisome의 충돌 정면 RNAP 보통 2.5 킬로바이트와 길이 3.6 킬로바이트 두 제품에 발생합니다. 2.5 이하 제품은 중단 RNAP와 RNAP와 충돌시 연기 replisome에서 결과를 분기점에서 DNA의 길이를 나타냅니다. 3.6 이하 제품은 불완전한 RNAP에 의해 모터의 숙박 또는 일부 replisome 정면 RNAP의 읽기를 통해서에서 전체 길이 DNA와 결과를 나타냅니다. 좋은 또는 정확한 결과는 약 50 % 전체 길이 DNA 생산 것을 보여줍니다. 그러나, 경우에 RNAP에 의해 모터의 적은 인가 발생하고 전체 길이의 DNA보다 높은 비율이 replisomes의 큰 인구 이후 관찰된 것은 정면에 RNAP가 발생하지 않습니다. 단 전체 길이 DNA (3.6 KB)에서 중단 RNAP 결과의 부재에 복제. <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림. 1 replisome는 정면에서 RNAP에 의해 장애가 있습니다. (A) 실험 설정은. E. 안부나는 중단 연신율 복잡한는 이전에 설명한대로 T7A1 발기인 (9)를 포함하는 biotinylated DNA를 조립했다 RNAP. 간단히 중단 연신율 복합은 더욱 10 분 APU, GTP, ATP와 CTP의 또한 다음 10 분 biotinylated DNA와 RNAP의 holoenzyme을 잠복기로 모터 20 BPS 하류를 형성했다. Streptavidin 비즈는 다음 비즈가 0.75M NaCl, 200 MG / ML 헤파린, 100 nm의 단일 스트랜드 불안정 RNAP - DNA의 단지 및 초과 NTPs를 제거하는 DNA를 포함하는 버퍼의 0.9 ML, 5 번 각각 씻어 줄 추가 10 분 추가되었습니다 . DNA는 다음 SAPI와 소화, 세탁 및 사전 annealed 포크드 DNA에 출혈도 잡았습니다. 구슬은 replisome의 조립하기 전에 다시 한번 씻어되었습니다. 발기인은 분기점에서 2.5 킬로바이트에 위치하고 분기점으로 직접 전송하는 방향입니다. (B) DnaB는 다음 replisome 조립했을 추가되었습니다 및 복제는 존재하거나 시작 (레인 2) 또는 부재 (레인 1)되었습니다 정면 RNAP.

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
<li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors%3A+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li>
<li>Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+modulators+and+DNA+repair+activities+resolve+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription.</a> Mol Cell. 19, 247-247 (2005).</li>
<li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+RNA+Polymerase+by+%28p%29ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).</li>
<li>Labib, K., Hodgson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+barriers%3A+pausing+for+a+break+or+stalling+for+time%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time.</a> EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).</li>
<li>Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+collapse+at+replication+terminator+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Replication fork collapse at replication terminator sequences.</a> Embo J. 21, 3898-3898 (2002).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+mechanics%3A+insights+into+a+twin+DNA+polymerase+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine.</a> Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+replisome+uses+mRNA+as+a+primer+after+colliding+with+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase.</a> Nature. 456, 762-762 (2008).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-557 (2006).</li>
<li>Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Cell. 86, 557-557 (1996).</li>
<li>Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+assembly+reveals+the+basis+for+asymmetric+function+in+leading+and+lagging+strand+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication.</a> J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).</li>
<li>Kaplan, D. L., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+binding+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+to+DNA.+V.+T7+RNA+chain+initiation+by+enzyme-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes.</a> Mol Cell. 15, 453-453 (2004).</li>
<li>Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+DNA+pumps+of+a+hexameric+helicase+provide+power+to+simultaneously+melt+two+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes.</a> Cell. 109, 757-757 (2002).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+Transcription+repair+coupling+factor+%28Mfd+protein%29+rescues+arrested+complexes+by+promoting+forward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).</li>
<li>Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Science. 266, 1957-1957 (1994).</li>
<li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+repair+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li>
<li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li>
<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

높은 소금과 비즈로 바운드 중지 신장 컴플렉스를 세척하는 것은 어떤 불안이나 비 특별히 바운드 RNAP 분자를 제거하기 위해 중요합니다. RNAP는 프라이머 - 템플릿 타입 DNA 구조에 대해 매우 높은 친화력을했다. 따라서, 그것은 뇌관 - 템플릿에서 복제를 수행하기 위해 이러한 불특정 RNAP - DNA의 단지를 제거하는 것이 필요합니다. Qiagen PCR 정화 키트를 사용하여 라디오 레이블이 붙은 DNA 제품을 집중하면 겔에서 관찰할 수있을만큼 충분히 높은 방사성 신호를 얻기 위해서도 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Quick Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

정면 rna 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

생체내 연구에서 복제 퍽스가 전사 단지 정면에 함께 인한 일로 체포하는 것이 좋습니다. 그러나, replisome 및 RNA 효소 (RNAP)의 운명은 다음과 같은 머리를에 충돌 알 수 있습니다. 여기, 우리가 찾을 수있는 E. 와 충돌시 대장균 replisome 노점을 정면에서 전사 복잡 대신 무너지고의 복제 포크는 매우 안정적인 남아 결국 DNA의 RNAP를 생기죠 후 신장을 다시 시작합니다. 우리는 전사 - 수리 커플링 계수, Mfd이 RNAP의 변위를 촉진하여 충돌을 다음과 포크를 직접 다시 시작을 촉진 것을 또한 확인하십시오. 이러한 결과는 복제 장치의 본질적인 안정성과 RNAP 블록 과거 복제를 추진하고있는 전사 결합 수리 경로에 대한 소설 역할을 보여줍니다.

replisome의 운명과 충돌을 따라 정면에서 RNA 효소 (RNAP) 알 수 있습니다. 우리는 DNA에서 RNAP를 생기죠 후 신장을 replisome 정면에 RNAP와 충돌시 포장 마차지만, 이력서 것을 발견했습니다. Mfd은 충돌 후 RNAP의 변위를 촉진하여 복제 다시 시작을 추진하고 있습니다.

정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

생체 내(in vivo) 연구에 따르면, 복제 포크(replication fork)는 정면으로 충돌하는 전사 복합체로 인해 정지되는 것으로 나타났습니다. 하지만 리플리솜(replisome)과 RNA의 운명은...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 정면 충돌 후 Repli zone 및 RNA polymerase(RNAP)의 운명을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 비오틴화된 DNA 상에 전사 복합체를 조립하고 이를 Stripp 태블릿과 비드에 고정하여, RNAP 신장 복합체가 정지된 상태가 되도록 합니다. 절차의 두 번째 단계는 RNAP 신장 복합체에 미리 준비된 포크형 DNA를 연결하여, 정면으로 마주한 RNAP의 하류에 복제 포크를 형성하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 복제 구역을 조립하고 복제 분기점에서 선도 가닥 합성을 개시하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 자기 비드로부터 DNA를 분리하고 PCR 정제 컬럼을 통해 DNA를 정제하는 것입니다. 최종적으로, 정제된 방사성 표지 DNA 생성물의 알칼리성 아가로스 겔 전개 분석을 통해 roso가 정면 충돌 전사 복합체와 충돌할 때 정지한다는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 로펠러 대학교 Mike O'Donnell 연구실의 Richard Pomerance입니다. 오늘은 고체상에서 리보솜과 RNA 중합효소의 정면 충돌을 유도하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 DNA 상의 전사 복합체가 복제 과정에 어떤 영향을 미치는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작해 보겠습니다. 본 프로토콜을 시작하려면, T7 A1 프로모터를 포함하는 biotinylated 3.6 KB DNA 템플릿과 RNAP holo enzyme을 100 µL의 버퍼 A에 혼합한 후, 이 혼합물을 37 °C에서 10분 동안 인큐베이션하십시오. 10분간의 인큐베이션이 끝나면, RNA 합성이 20개 뉴클레오타이드로 제한되도록 ribonucleotides인 adenosine triphosphate, cytidine phosphate, 그리고 uridine을 첨가하십시오.정지된 RN ape 신장 복합체를 비드에 고정시키기 위해 해당 용액을 37 °C에서 10분 더 배양합니다. 이 용액을 streptavidin이 코팅된 자성 비드에 추가합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.0.9 mL의 고염 농도 버퍼로 비즈를 세척하여 고정된 정지 상태의 RNAP 신장 복합체를 정제하십시오. 매 세척 후 비특이적 R-N-A-P-D-N-A 복합체를 제거하기 위해 자기 분리를 통해 상층액을 제거하십시오. 이 세척 과정을 5회 반복해야 합니다.그 후 비드를 0.9 mL의 버퍼 A로 두 번 더 세척합니다. 마지막 세척 후, 정지된 RNAP 신장 복합체 하단에 복제 포크를 형성하기 위해 하류 복제 포크를 조립할 수 있습니다. 자석 스트립을 이용해 정지된 RNAP 신장 복합체에 부착된 비드를 100 µL의 New England Biolabs 버퍼 4에 현탁합니다. 다음으로, 10 units의 shrimp alkaline phosphatase 또는 SAP 1을 첨가하고 샘플을 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 비드를 0.9 mL의 버퍼 A로 세 번 세척합니다. 그 다음 비드를 50 µL의 quick T4 ligation 반응 버퍼에 다시 현탁합니다.2 µL의 quick T4 ligase를 추가하고 포크 형성된 DNA를 미리 준비한 후, 용액을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로, 0.9 mL의 buffer A로 비드를 3회 더 세척합니다. hexamer DNA helicase를 정지된 RNAP 신장 복합체 및 하류 복제 포크가 결합된 magnetic strep A 비드와 혼합합니다. 150 µL의 buffer A에서 용액을 준비하고 23 °C에서 30초 동안 배양합니다.23°C에서 짧게 32회 배양한 후, polymerase three beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, alpha P 32로 표지된 DGTP 및 alpha P 32로 표지된 DATP를 추가하여 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 시료를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.단일 가닥 DNA 결합 단백질 DCTP와 DTTP를 첨가하여 복제를 개시합니다. 또한, $\alpha$ P 32로 표지된 DTTP와 DCTP를 추가하여 최종 부피를 250 µL로 맞춥니다. 10분 후, 0.5 M EDTA 12 µL를 첨가하여 반응을 종료합니다.다음으로, strp din 비드를 가열하여 비드로부터 DNA를 분리합니다. 비드를 proteinase K로 50 °C에서 30분 동안 처리하여 잔류 DNA를 제거합니다. 비드를 다시 가열하고 자기 분리를 통해 상층액을 제거합니다.Kyogen PCR cleanup kit를 사용하여 DNA가 포함된 혼합 상층액을 정제합니다. 마지막으로, 정제된 방사성 표지 DNA 생성물을 알칼리성 아가로스 겔에서 분석합니다. RNAP와 정면으로 충돌하면 보통 2.5 KB 및 3.6 KB 길이의 두 가지 생성물이 만들어집니다. 2.5 KB 생성물은 복제 분기점(fork)부터 정지된 RNAP까지의 DNA 길이를 나타냅니다.이는 RNAP와 충돌 시 복제 포크가 정지됨으로써 발생합니다. 3.6 KB 생성물은 전체 길이의 DNA를 나타내며, 이는 RNAP가 프로모터를 완전히 점유하지 않았거나 복제 포크가 정면으로 마주 오는 RNAP를 부분적으로 통과하여 읽어냈기 때문에 발생합니다. 양호한 결과는 전체 길이 DNA가 약 50% 생성되었음을 보여줍니다.하지만 어떤 경우에는 RNAP의 프로모터 점유율이 낮아져 더 높은 비율의 전체 길이 DNA가 관찰됩니다. 이는 정지된 RNAP가 없는 상황에서 더 많은 복제 구역(repli zones)이 정면 충돌 RNAP 복제를 겪지 않기 때문에 결과적으로 전체 길이 DNA만 생성되기 때문입니다. 지금까지 DNA에 결합하여 정지된 RNA 중합효소 신장 복합체가 존재하는 상태에서 복제 및 고체상 실험을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, DNA에 비특이적으로 결합하여 복제를 방해하는 과잉 RNA 중합효소를 제거하기 위해 정지된 전사 복합체를 고농도 염으로 세척하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

DT40, 모델 척추 유전 시스템은 단백질 기능을 분석하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 여기서 우리는 단일 분자 수준에서 DT40 세포에있는 S - 단계에서 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정성 분석을 수있는 간단한 방법을 설명합니다.

DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

여기서는 대장균의 복제 분기점을 멈추고 붕괴시키기 위해 부위 특이적이고 가역적인 생체 내 단백질 블록을 사용하는 시스템을 설명합니다. 복제 블록의 설정은 형광 현미경으로 평가하고 중성 2차원 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 복제 중간체를 시각화합니다.

사이트 특정 복제 막힘의 유도<i&gt; E. 대장균</i&gt; 형광 리프레 운영자 시스템을 사용하여

여기에서는 2차원 겔 전기영동을 사용하여 병원성, 구조가 발생하기 쉬운 반복을 통한 복제 진행을 분석하는 절차를 간략하게 설명합니다.

SV40 기반 인간 에피솜 내에서 구조가 형성되기 쉬운 DNA 반복을 통한 복제의 전기영동 분석

이 기술은 인간의 oncogene을 인코딩 복제 - 결함 retroviral 주식을 준비하는 효율적인 방법을 보여줍니다, 그리고 이후 마우스 모델에 myeloproliferative 질병의 유도에 사용.

293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

이 프로토콜은 실시간으로 개인 replisomes하여 DNA 복제를 시각화하기위한 간단한 단일 분자 형광 현미경 기술을 보여줍니다.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

24hpf에서 zebrafish otocyst에 직접 morpholinos를 전달하는 방법이 개발되었습니다. 귀의 소포 및 침투력을 효과 electroporation의 루멘에 morpholinos의 microinjection을 사용하여, 우리는 두뇌에 morpholinos의 효과를 무시하고 내이 (内耳)에 특정 효과를 얻을 수 있었다.

사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향

Gaussia 루시페라아제 (GLuc) 유전자를 포함하는 선형화된 플라스미드로부터 캡핑 및 비캡핑 mRNA를 모두 고수율로 in vitro 합성하는 방법을 설명합니다. 합성된 RNA를 정제하고, 비캡핑 RNA의 일부를 Vaccinia 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 효소적으로 캡핑합니다. 마지막 단계로, mRNA를 HeLa 세포에 형질전환하고 세포 배양 상청액의 루시페라아제 활성을 측정합니다.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

배우세요 정면 RNA 중합효소와 충돌한 후 복제체의 운명을 관찰하는 방법을. Mfd가 복제 재시작을 촉진하는 역할과 DNA 복제 동역학에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

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