E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

이 절차의 전반적인 목표는 태아의 척수에서 신경교세포 제한 전구체 또는 GRP 세포를 유도하는 것입니다. 이는 E 13 태아에서 척수를 추출하여 GRP 선택적 배지를 사용하여 배양 플레이트로 전달함으로써 이루어집니다. 다음으로, 면역 패닝은 GRP 개체군을 풍부하게 하고 비 GRP 계통을 제거하는 데 사용됩니다.

정제된 GRP 세포는 동결되어 장기 보관될 수 있습니다. 정제된 GRP 세포는 해동되어 단일 세포 너비의 통로를 통한 이식 GRP 세포의 이동을 보여주는 것과 같은 향후 실험에 사용할 수 있습니다. 수술 단계는 특히 경험이 없는 눈으로 배우기 어려울 수 있으므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

오늘 시연할 사람은 로슈 드 실바(Roche De Silva)와 조엘 마르크스(Joel Marx)입니다. 우리 연구실의 학생은 누구입니까 : 배아 E 12 또는 E 13 일 태아 발달 일에 상업적 출처 또는 사내에서 준비된 날에 임신 한 마우스 댐을 얻습니다. E one은 질에 위치한 점액 마개의 존재로 정의됩니다.

다음 날, 암컷은 모든 기구와 조직 배양 후드를 소독한 수컷과 함께 수용됩니다. 20ml의 냉 해부 매체로 깨끗한 페트리 접시를 준비합니다. 다음으로, 클로랄 수화물의 마취 주사로 마우스를 준비합니다.

생쥐가 발가락 꼬집음으로 인한 통증 반사를 보이지 않으면(예: 경추 탈구나 참수를 통해 안락사), 태아와 궁극적으로 파생 세포의 생존 능력에 대한 다운스트림 효과 가능성 때문에 동물을 마취하기 위해 CO2를 사용하지 않는 것을 선호합니다. 복부 소독 후 큰 가위와 집게를 사용하여 복부를 열어 자궁을 제거합니다. 균주에 따라 자궁에는 8-14명의 태아가 있습니다.

자궁을 신선한 냉찜질방에 넣고 깨끗한 페트리 접시에 넣어 태아를 격리합니다. 먼저 혈액과 여분의 조직을 씻어냅니다. 그런 다음 자궁 뿔에서 각 태아를 추출하여 배아 주머니와 태반에서 분리한다.

작은 가위를 사용하여 태아를 신선하고 시원한 해부 접시에 옮깁니다. 보통. 차가운 배지는 신진 대사 활동을 낮추고 해부 현미경에서 파생 세포의 생존력을 보존합니다. 집게와 스프링 가위를 사용하여 척수를 따라 피부를 자르고 다시 벗겨내고 척수를 노출시킵니다.

척수를 C 1 부근과 꼬리의 시작 부분에서 절제합니다. 그런 다음 뼈와 연골이 모두 이식된 척수를 조심스럽게 제거하고 준비된 각 척수를 한 접시에 모읍니다. 새로운 해부 매체를 사용하여 GRP 세포가 더 많이 분포되어 있더라도 척수 전체를 채취합니다.

그러나 결국 GRP 배지는 GRP 표현형을 선택하고 그 개체군은 수막 조직의 과증식을 방지하기 위해 H two B five 면역에 의해 더욱 최대화됩니다. 후속 세포 배양에서는 초기에 돌출된 말초 신경으로 인해 척수에서 가능한 한 많은 수막을 제거합니다. 이것은 적출된 뇌에서 수막 조직을 제거하는 것보다 더 어렵습니다.

수막이 최대한 제거되면 척수를 20mm 페트리 접시에 옮기고 해리를 진행합니다. 준비 중인 세포. 섭씨 37도의 수조에서 최소 30분 동안 트립신 분취액을 예열합니다.

다음 단계는 파생된 척수 조직의 생존력을 향상시키기 위해 신속하게 수행되어야 합니다. 트립신과 DNA가 들어 있는 50ml 원심분리 튜브에 척수를 옮깁니다. 그런 다음 파이퍼로 혼합물을 간단히 삼각질합니다.

혼합물을 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 다시 평가한 다음 10분 동안 더 배양을 계속하십시오. 그런 다음 원심분리기에 5ml의 GRP 배지를 5분 동안 추가합니다.

1000RPM에서 상층액을 흡입하고 소생합니다. DNA 1이 있는 10ml의 GRP 배지에 펠릿을 현탁시킵니다. 이제 10분 더 배양하고 1000RPM에서 5분 동안 세포를 펠릿

상등액을 흡입하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 신선한 GRP 매체에서. 40-70 미크론 세포 여과기에 세포를 통과시키고 PLL 라미닌 코팅된 T 25 플라스크에 플레이트를 만듭니다.

세포를 배양하고 다음날 배지를 100% 교체한 다음 격일로 또는 영양소가 주름진 경우 더 자주 변경합니다. 이 시점에서 GRP가 연결되어 프로세스 확장을 시작했으며 immuno panning을 사용하여 최적화할 수 있습니다. 세포가 85-90% confluent가 되거나 약한 세포가 지나갈 때까지 세포를 계속 성장시킵니다.

그런 다음 고무 경찰관이나 트립신을 사용하여 세포를 수확합니다. Resus는 세포를 신선한 배지에 재현탁시키고 3개의 T 25 플라스크로 확장하며, 최소 48시간마다 배지를 교체합니다.플라스크가 최대 농도에 도달하면 이전과 같이 5ml의 GRP 배지로 수확합니다. Tri rate: 세포 현탁액을 사용하여 덩어리를 분해하고 A, 2, B, 5 코팅된 세균으로 옮깁니다.

페트리 접시는 흔들리지 않고 실온에서 1시간 동안 A 두 개의 B 플레이트에 있는 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 흡인하고 PBS로 플레이트를 4-8회 세척하여 플레이트에 대한 세포의 비특이적 결합에 대한 높은 견고성을 유지합니다. 고무 경찰관을 사용합니다.

세척된 세포를 2ml의 GRP 배지에 모은 다음 현탁액을 GRP 배지가 있는 PLL lamina 코팅 플레이트 또는 플라스크로 옮깁니다. 세포가 85-90% 합류점에 도달하면 뮤징 트립신을 수확한 다음 트립신을 8ml의 GRP 스톡, 배지로 희석 및 비활성화하고 세포를 펠릿으로 수집합니다. 1ml의 GRP 동결 배지에 T 25 플라스크의 세포 부피를 재현탁하거나 2ml의 GRP 동결 배지에 T 75 플라스크의 세포를 재현탁합니다.

필요한 경우 세포 현탁액 농도를 조정하고 세포를 극저온 바이알로 옮기고 다음날 섭씨 영하 80도에서 이소프로판올이 들어 있는 극저온 용기에서 밤새 세포를 천천히 동결합니다. 세포를 장기 보관으로 옮깁니다. 세포는 6개월에서 1년 후에 해동된 후 60-80%의 생존 능력을 갖게 됩니다.

생존 가능성은 PLL 라미닌 코팅의 품질에 크게 좌우됩니다. 배양에서 이틀 후, 서로 다른 형태의 도금된 척수 세포가 최대로 농축하는 것이 관찰되었습니다. GRP 집단 세포는 A two B five 집단에 대해 선택하기 위한 면역 팬입니다.

신경 상피 세포 오염에 문제가 있는 경우, 이중 면역 패닝을 사용하여 NCA 양성 모집단을 먼저 제거한 다음 A two B five selection을 사용할 수 있습니다. 성숙한 희소돌기아교세포의 오염을 줄이기 위해 T three free B 27 보충제가 추가되었습니다. 정제된 GRP 세포는 작은 소마와 두세 개의 짧은 돌기로 식별되었습니다.

종종 신경 상피이며 GRP 또는 N rp가 될 수 있는 A, 2, B, 5개의 음성 세포로 구성된 작고 지속적인 집단도 있었습니다. 다행히도 세포가 GRP 배지에서 더 오래 유지될수록 GRP 표현형을 채택할 가능성이 더 높았습니다. 이 절차의 기본 기술은 다른 세포 유형을 유도하는 데 사용할 수 있으며, 이는 어떤 세포가 세포 대체 요법에 더 적합한지 또는 피질 유도 뉴런이 체외 수초화를 위한 좋은 모델이 될 수 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.