브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 Micromirror 장치와 패턴 Photostimulation

이 절차의 전반적인 목표는 시간과 공간에서 빛의 복잡한 패턴을 제어하여 뉴런을 자극하는 데 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 먼저 DMD 칩을 현미경의 광학 경로에서 적절한 공액 이미지 평면에 배치하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 레이저와 같은 강렬한 광원으로 DMD를 적절하게 비추는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 코히어런트 조명의 스페클링 효과를 제거하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 그래픽 사용자 인터페이스를 통합하여 DMD 칩을 조작하는 것입니다. 궁극적으로, 이전에는 수행하기 어려웠던 실험이 이제 DMD 시스템을 사용하는 케이지 신경전달물질의 다중 부위 용해를 통해 비교적 쉽게 완료될 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 메릴랜드 대학교 신경학과의 Chaman Tang 박사 연구실의 Michael Mohammed입니다. 오늘은 광학 현미경에서 복잡한 제거 패턴을 생성하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 수지상 통합을 연구합니다.

시작하겠습니다. 이 프로토콜은 실험 신경 과학을 위한 디지털 마이크로 미러 장치 또는 DMD 조명 시스템의 작동을 보여줍니다. DMD는 수십만 개의 미세한 이동식 거울이 직사각형 배열로 배열된 광학 반도체 칩으로, 표면에서 각 거울의 위치는 이미지의 픽셀에 해당합니다.

각 미러는 두 방향 사이에서 기울어지도록 개별적으로 제어할 수 있습니다. 꺼짐 방향에서 빛은 표본 조명의 광축에서 멀어지게 됩니다. 켜짐 방향에서 빛은 광축을 따라 향합니다.

DMD는 매우 강렬한 UV 광선을 견디고, 켜짐 및 꺼짐 픽셀 간에 높은 명암비를 생성하며, 수십 마이크로초 내에 두 상태 사이를 전환할 수 있기 때문에 용해에 매우 적합합니다. 생물 의학 연구를 위한 DMD의 적용은 이미지 조작 소프트웨어 및 하드웨어의 광범위한 사용과 이미지 디스플레이 분야에 대한 상업적 관심에 의해 지원됩니다. 모듈식 부품은 Texas Instruments에서 DMD를 미세한 시스템에 적응시키기 위한 지원 전자 드라이버를 제공하는 DLP 디스커버리 키트로 판매합니다.

현미경 검사의 광학에 관한 기본 개념을 이해해야 합니다. 현대의 기본적인 형광 현미경은 이미징 경로와 조명 경로로 구성됩니다. 이 렌즈는 대물렌즈, 필터 큐브, 이미징 및 조명 경로를 위한 두 개의 개별 튜브 렌즈로 구성됩니다.

현미경은 표본 이미지 평면에 켤레 위치를 갖도록 설계되었으며, 표본 평면에서 초점이 맞춰진 물체는 이러한 켤레 이미지 평면에서도 초점이 맞춰진 것처럼 보입니다. 이 개념의 필연적인 결과는 켤레 이미지 평면에서 생성된 모든 밝은 이미지가 표본 이미지 평면에도 선명하게 투영된다는 것입니다. 이 전략은 컴퓨터로 생성된 조명 패턴을 표본에 투사하는 데 사용됩니다.

레이저 빔은 매우 밝은 광원 역할을 하여 켤레 이미지 평면에 위치한 DMD 칩의 마이크로 미러에 의해 구현된 패턴을 비춥니다. DMD 조명 시스템의 설계는 가시 파장의 빛을 사용하는 광유전학 실험에 사용되는 여기 조명에 따라 달라집니다. 조명이 켜진 패턴은 카메라 경로를 통해 가져올 수 있습니다.

따라서 DMD 칩은 듀얼 카메라 포트 모듈의 두 카메라 포트 중 하나에 간단히 장착할 수 있습니다. 반대로, 케이지 화합물의 용해와 같이 UV 범위의 빛을 사용하는 실험의 경우 빛을 epi 조명 경로를 통해 가져와야 하며 보다 접근하기 쉬운 켤레 이미지 평면을 만들어야 합니다. 이는 이미징 튜브 렌즈가 자외선 투과용으로 설계되지 않았기 때문입니다.

대신, 조명 튜브 렌즈는 UV 투과에 사용되며 이미지 형성에 적절한 작업을 수행합니다. DMD의 각 마이크로 미러는 칩 평면을 기준으로 양의 12도 기울기와 음의 12도 기울기 사이를 전환할 수 있습니다. 컴퓨터로부터 받는 디지털 입력에 따라 회전축은 각 미러의 대각선 모서리를 따라 칩의 직사각형 면까지 45도 각도를 이룹니다.

미러 틸트의 방향은 칩 전면의 한쪽 모서리에 있는 금색 삼각형으로 지정됩니다. 마이크로 미러의 기울기는 들어오는 조명 빔의 피치와 방위각의 정렬을 결정합니다. DMD를 조명하기 위해서는 먼저 DMD 칩의 수직축으로부터 24도가 되도록 조명빔의 피치를 구성하고, 방위각이 미러 회전축에 수직이 되도록 구성한다.

효율적인 작동을 위해서는 정밀한 빔 정렬이 중요합니다. 용해 실험용. 레이저 소스를 사용하여 빠른 언케이징에 필요한 고강도 초점 가능 빔을 생성합니다.

여기서 준 연속 다이오드 펌핑 고체 상태 주파수 3 배 ND ate 레이저가 사용되며, 레이저 출력의 작은 부분 만 실제로 표본에 전달되기 때문에 상대적으로 높은 출력의 레이저를 사용합니다. DMD 시스템을 사용할 때 레이저 출력을 다중 모드 광섬유로 시작하여 DMD를 조명하기 위한 올바른 축을 따라 쉽게 배치하고 방향을 지정하여 스페클에 대한 솔루션을 제공할 수 있습니다. 코히어런트 조명에서 발생하는 문제는 광섬유를 통해 빛을 전달합니다.

광섬유는 약 40 킬로헤르츠를 진동시키기 위해 구동되는 pazo 전기 섬유 들것에 감겨 있습니다. 광섬유의 미세한 신축은 각 광 자극 펄스의 밀리초 지속 시간 동안 반점 패턴을 여러 번 이동시키기에 충분하여 반점을 효과적으로 제거합니다. 마지막으로, 광섬유의 출력은 UV 현미경 대물렌즈와 대조되어 DMD를 조명하고 CCD 픽셀을 이미징 CCD 카메라의 특정 픽셀과 개별 DMD 미러를 상관시키는 DMD 이미지 소프트웨어와 공동 등록합니다.

소프트웨어 내의 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 사용자는 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 컴퓨터 마우스로 CCD 이미지의 영역에 해당하는 DMD 미러 방향을 할당할 수 있습니다. 컴퓨터 화면에 표시된 이미지 위로 커서를 이동하여 사진 자극을 위한 위치에 태그를 지정하고 태그가 지정된 관심 영역을 클릭하여 광 전달 패턴 저장을 프로그래밍합니다. 컴퓨터 화면에 일련의 개별 이미지로 표시된 패턴은 각 공간 패턴에 대한 레이저 펄스의 타이밍을 소프트웨어로 프로그래밍합니다.

이것은 데이터 수집 프로그램 P 클램프와 통합됩니다. 마지막으로, 데이터 수집 프로그램을 사용하여 DMD 전자 장치의 타이밍, 레이저의 게이팅 및 대상 뉴런에서 패치 클램핑 전기 신호의 획득을 조정합니다. 여기에서는 광학 시스템 해상도의 보정이 표시됩니다.

최소 스폿 크기는 형광 타겟에서 측정한 것으로 표시됩니다. 효과적인 생리학적 해상도는 광 자극의 함수로서 전류 흐름의 진폭에 의해 측정됩니다. 여기의 스폿 위치, 케이지 글루타메이트는 2 마이크로 미터 직경의 수지상 가지에 인접하여 촬영되었습니다.

그 자리가 옮겨지면서. 서로 다른 강도의 광 자극에 대한 다이트를 가로질러 직각으로 전기적 반응이 설명됩니다. lysis intensity의 함수로 전압 클램핑 응답이 표시됩니다.

분산된 수지상 자극은 DMD 기반 시스템을 사용하여 쉽게 구현할 수 있습니다. 여기서, 입력 강도는 두 개의 수지상 가지에 원으로 표시된 사진 자극의 반점 수를 증가시켜 다양화되었습니다. 공간 합계는 분기 점 간에 비선형일 수 있습니다.

그것은 점점 더 초선형이 되고 입력 진폭이 증가함에 따라 분기에 대한 두 개의 문에 도달합니다. 이러한 결과는 수지상 분기점에 걸친 비선형 합계 방식을 명확하게 보여줍니다. 초선형성은 주로 전압 의존성 채널이 아닌 NMDA 수용체에 의해 매개됩니다.

이는 두 개의 NMDA 길항제인 A PV와 MK 8 0 1의 적용이 비선형 거동을 크게 제거하는 것으로 입증될 수 있습니다. 신경 조직의 패턴 사진 자극을 위한 DMD 기반 시스템의 기본 설계 및 작동을 보여드렸습니다. 이 시스템은 광유전학 실험에 사용되는 것과 같이 가시광선을 이용한 자극에 맞게 조정할 수 있습니다.

또한 단일 광자 용해에 사용되는 근 UV 광에 적응할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 400나노미터 미만의 파장의 빛을 사용하고 대부분의 사람들이 에피 조명 경로를 통해 나가는 경우 조명 빔을 몇 도 이내로 정밀하게 정렬하는 것이 중요하며 간섭성 조명을 사용하는 경우 스페클을 효과적으로 제거해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.