Name: 브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 Micromirror 장치와 패턴 Photostimulation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 디지털 마이크로미러 장치를 이용한 복잡한 빛 패턴 제어로 신경 세포를 자극하는 방법을. 이 기술은 수상돌기 가지점에서의 비선형 통합 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 VA 리서치 서비스에서 C. - MT에 NIH와 메리트 리뷰에서 RO1 지원하고, CWL하는 개인 NRSA했습니다

일반적인 설계 고려 사항 사진 자극의 파장 이러한 optogenetic의 실험으로 보이는 범위에있는 경우, 시스템의 레이아웃이 UV 광분해 실험에 비해 상당히 간단합니다. 하나는 현미경 회사의 모든에서 사용할 수있는 듀얼 카메라 포트 모듈을 구매해야합니다. DMD 비행기는 두 카메라의 포트 중 하나의 공액 이미지 평면에서 위치 수 있습니다. 카메라 선도 이미징 튜브 렌즈를 상용 현미경에도 자외선 파장에 대한 수정되지 않기 때문에 자외선 광분해에있는 치과에서 발생하는 빛을은 에피 조명 경로 (그림 3A)를 통해 가지고 있어야합니다. 350 nm의에서 이미징 튜브 렌즈의 구면 수차가 꽉 조여에 빛을 집중하고 충분한 공간 해상도를 생성할 수있는 능력을 막기 위해 충분히 심각한 것입니다. collimated 레이저가 같은 광학 축을 따라 가져온 때 튜브 렌즈가 제거되기 때문에이 문제는 공촛점 현미경에서 발생하지 않습니다. 거기 튜브 렌즈가 모든 부분 UV 파장에서 구면 수차에 대한 수정 때문에 자외선 조명의 문제는 에피 형광 경로를 통해 조명을 동원하여 해결하실 수 있습니다. 우리는 어떤 학위 저널 소원에 현미경의 광학에 확장할 수 있습니다. 과학 커뮤니티는이 주제에 일반적으로 빠른 관심에 잘 그것을 가르치는 많은 소스이 없습니다. 현미경의 수정을 최소화하고 있기 때문에 에피 형광 장치에 꽉 공간 제약을하기 위해서는 DMD은 릴레이 렌즈 (관련하여 DMD 장치의 위치 지적 만든 새로 만든 공액 이미지 비행기에 배치됩니다 현미경). 상업적인 자외선은 릴레이 렌즈 (그림과 현미경에 지적) (특수 광학) 구입한 수정. DMD의 조명 는 바이너리 입력을 받으면 micromirror는 긍정적이고 부정적인 12 ° 기울기 칩의 비행기에 상대적으로 전환할 수 있습니다. 회전의 축은 각 미러 (칩의 양쪽에 45 °)의 대각선 모서리를 따라합니다. 미러 회전의 방향은 칩의 전면 표면 한 모서리에서 황금 색의 삼각형으로 지정되어 있습니다. micromirror의 기울기 각도가 들어오는 조명 빔의 높이와 azithmus의 정렬을 지시. 조명 광선의 피치는 DMD 칩 및 미러 회전 축에 수직으로 azithmus 요구의 수직 축에서 24 °해야합니다. 정확한 빔 정렬 효율적인 운영을 위해 중요합니다. 프로토 타입 시스템에서 우리는 우리가 설계와 가공에 대한 정확한 부족한 허용 여러 수동 기울기 조정을 설계했습니다. 이것은 필요한 것보다 상당히 더 부피가있는 시스템에서 발생. 빛 가운데에 데려 와서 대체보다 소형 협정 (유용하다고 판단하는 경우 대체 디자인을 표시) 할 수 있습니다. 광분해 실험을위한 레이저 소스 신속한 uncaging에 대한 높은 빛의 강도 집중 광선이 필요한 생성하기 위해 필요합니다. 고휘도 급격히 집중 조명이 필요하지 않습니다 optogenetic 실험 들어, 비 코히어런트 광원은 적절한 것입니다. 광분해 실험은 여기에 설명된 우리는 유사 지속적인 다이오드는 주파수 NdVO4 레이저 (1 W, 355 nm의)를 배로 고체 (DPSS)을 펌핑 고용. (광분해에 대한 광원의 선택에 대한 자세한 논의에 대한 참조 2 참조). DMD 시스템을 사용할 때 레이저 출력의 작은 파편만이 실제로 표본 전달되기 때문에 상대적으로 높은 전력 레이저 여기에서 설명하는 실험이 필요합니다. 표본에게 전달 빛의 금액은 레이저 빔 조명에 의해 지역 내에 ON / OFF 거울의 숫자의 비율에 비례합니다. 레이저 광원이 필요한 경우, 그것은 치과를 조명에 대한 올바른 축을 따라 위치와 방향을 쉽게 할 수 있도록 다중 광섬유로 레이저의 출력을 실행하는 것이 좋습니다. 광섬유를 통해 빛을 전송하는 것은 일관된 조명에 내재된 작은 반점 패턴을 제거하는 방법을, 두 번째 문제를 해결합니다. 섬유 ~ 40 kHz에서에서 진동 압전 섬유 신장기 (모델 915, 캐나다 계측 및 연구, (주)) 주위에 상처입니다. (장비에 지점이 밖으로) 섬유의 스트레칭 미세한는식으로 효과적으로 speckling의 효과를 제거, 각 사진의 자극 펄스의 밀리초 기간 동안 패턴을 여러 번 작은 반점 이동하기 충분합니다. 광섬유의 출력은 다음 자외선 현미경 목표 (올림푸스 DApo20UV)와 collimated 있습니다. (이것을 시점) 시스템의 광학 해상도의 교정은 그림에 표시됩니다. 3B. 로 사진의 장소의 위치의 함수로 전류 흐름의 진폭에 의해 측정된 유효 생리 해상도자극은 그림에 표시됩니다. 3C. 다양한 농도의 photostimulation 전류 응답을 그림 그림입니다. 3D. 시스템 운영 : DMD 거울과 공동 등록 CCD 픽셀 사내 소프트웨어는 이미지 CCD 카메라의 특정 픽셀 개별 DMD 미러의 서신을 결정하는 것을 작성되었습니다. 이 소프트웨어 내에있는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)는 다음 사용자가 마우스로 태그 CCD 이미지의 영역에 해당하는 DMD 미러를 지정할 수 있습니다. 따라서 사진 자극에 대한 위치는 단순히 컴퓨터 화면에 표시되는 이미지 위로 커서를 이동하고 관심있는 태그 영역을 클릭하여 태그를하실 수 있습니다. (돌기 아버의 형광 이미지는 컴퓨터 화면에 표시됩니다. 학생이 컴퓨터 화면에 이미지를 통해 위치 번호를 표시합니다.) 빛의 전송을위한 패턴을 프로그래밍 운영자에 의해 컴퓨터 화면에 표시된 패턴은 별도의 이미지 시리즈로 저장됩니다. 각각의 공간적 패턴에 대한 레이저 펄스의 타이밍은 다음 데이터 수집 프로그램 (pClamp)와 통합되어 소프트웨어로 프로그래밍합니다. (이것을 보여줍니다.) DMD 패턴에 레이저 펄스를 조정 데이터 수집 프로그램은 시작하고 대상 신경 세포에서 전기 신호를 채워 DMD 전자, 레이저의 게이팅 및 패치 인수의 타이밍을 조정합니다. (컴퓨터에서이 시퀀스를 시뮬레이트) 실험 데이터 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 변론 전극과 돌기 통합은 전통적으로 개별 지역에서 자극의 진폭을 변화보다는 일정한 강도를 유지하면서 자극의 영역을 확대하여 실시되었습니다. electrogenesis과 위치에 의존 채널 모집의 포화에 관한 문제는 결과와 결론에 영향을 미칠 수있다. 분산 모수 석의 자극을 쉽게 DMD 기반 시스템 (그림 4A)를 사용하여 구현할 수 있습니다. 입력 강도는 photostimulation의 명소의 수를 늘림으로써 다양한했다. 우리는 공간 변론은 두 딸 지점에 도착 증가 입력 amplitudes와 함께 점점 위에 - 선형되는 지점 지점에 걸쳐 비선형 수 있습니다 볼 수 있습니다. 위에 - 선형성은 크게 NMDA 수용체를 중재하고 문이 채널 (그림 5) 전압하지 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. DMD에있는 micromirrors 운영. (사이드 뷰) 개인 거울에서 감독 정전기 세력이 거울은 두 가지 방향 12 ° 수평에서 중 하나에 기울어져되도록. ON 위치에 입사 빔은 칩의 광학 축 직각 따라 이동합니다. OFF 위치에 입사 빔은 48 °에서 축을 이동합니다. 거울 사이의 얇은 간격을 조회 라이트는 24 °에서 축을 이동합니다. (톱 뷰) 기울기는 45 ° 방향이다 거울과 칩의 측면과 관련하여. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 현대 형광 현미경의 기본 레이아웃. 필터 큐브는 객관적이고 튜브 렌즈 사이의 "무한의 공간"에 위치합니다. 카메라 연결 및 샘플에 빛을 가져다 조명 경로가 이미지 경로가 있습니다. 이 두 빛의 경로 튜브 렌즈는 일반적으로 디자인과 초점 길이 다릅니다. 조명은 아니지만 영상, 튜브 렌즈는 자외선 스펙트럼에서 작동하도록 설계되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. UV 기반 DMD 시스템 레이아웃. 조명은 UV 스펙트럼에있다면, 그것은 자외선에 대한 해결 튜브 렌즈를 통해 가지고 있어야합니다. 이미지 경로에 튜브 렌즈는 자외선을 위해 설계되지 않습니다. 릴레이 시스템을 쉽게 액세스할 수 공액 이미지 비행기를 만들 필요합니다. 현미경의 다른 공액 이미지 비행기도 곳곳에 빨간색 선으로 표시됩니다. 하나의 이미지 평면에 밝은 패턴이 다른 공액 비행기에서 예상하고 있습니다. 이미징 동안 샘플 비행기의 패턴은 감지기 / 카메라로 예상된다. 조명에 대한 DMD에 의해 생성된 패턴은 샘플로 예상된다. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 가시 광선 DMD 프로젝션 시스템 레이아웃. 조명 빛이 보이는 범위에있다면, 그것은 영상 조명 경로를 통해 DMD 생성된 빛의 패턴을 제공할 수 있습니다. 이것은 쉽게 commerci로 구현할 수 있습니다알 듀얼 카메라 포트 첨부하고 해당 이색성 거울. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 체제의 래터럴 해상도. (A) 형광 목표 광학 해상도는 ~ 2 μm의 수 있습니다. (B)로 dendrite에 걸쳐 갇힌 글루 탐 산염의 광분해에 의해 측정된 유효 해상도는 ~ 5 μm의 수 있습니다. 증가 거리는 글루 탐 산염의 확산과 dendrite의 유한 너비의 조합에 의한 것입니다. (C) 광분해은 시냅스 사건의 속도론을 모방 수 있습니다. 전압의 가족이 현재의 응답 dendrite로 전달 빛 에너지의 차이에 의한 것입니다 고정되어. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 변론. (A) 분산 입력은 별도로 두 가지 돌기에 적용됩니다. 각각의 전압 응답은 다음과 같습니다. (B) 자극 그러면 동시에 주어집니다. 측정 응답 (적색 추적)이 두 개인 응답 (회색 추적)의 산술 합계 다를 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. Supralinear 변론은 NMDA 수용체 따라 달라집니다. (A) APV는 선택 NMDA 수용체 길항제는 supralinear 변론을 차단합니다. (B) 자극 강도 관계 및 NMDA 수용체 길항제하기 위해 감도는 꾸몄다됩니다.

<ol><li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li>
<li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+neurotransmitters%3A+Theory+and+procedures+for+light+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+Technology+Feature%2C+Cell+imaging%3A+Light+activated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li>
<li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li>
<li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+LJ+%22Digital+Light+Processing+and+MEMs%3A+An+overview%22">Digital Light Processing and MEMs: An overview</a>. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

DMD 기반 photostimulation 접근의 장점은 목표가 비교적 큰 지역을 차지하고 상황에 가장 분명합니다. 관심의 대상이 같은 몇 가지 돌기의 쪽이 같은 매우 작은 경우, 순차 스캐닝 공촛점 및 2 광자 시스템은 좀더 나은 접근 방법이 될 가능성이 높습니다. DMD 접근법 중 하나는 큰 약점이 가능한 조명 자사의 비효율적 사용합니다. 사용 가능한 빛의 대량은 반드시 OFF 거울로 이동하고 사용되지 않습니다. DMD 기반 시스템은 가장 가시 범위에서 작동에 적합합니다. 우리는 optogenetics 실험과 취업 때 DMD 기반 photostimulation 시스템은 상당한 영향을 미칠 것으로 예상.

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<table><tbody><tr><td>현대식 정립 형광 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라 및 이미지 획득 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 및 데이터 획득/인터페이스 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLP Discovery 개발자 키트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALP3 USB 인터페이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 + Optics w/LED</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>듀얼 카메라 포트 유닛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>355nm 3배 주파수 NdVO4 레이저 (~1 W)</td><td>DPSS Laser Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 셔터 Model LS6</td><td>Uniblitz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멀티모드 광섬유 및 광섬유 스트레처 Model# 915</td><td>Canadian Instrument and Research, Ltd</td><td></td><td>100 um 코어 멀티모드 광섬유</td></tr><tr><td>멀티모드 광섬유 런처</td><td>Oz Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>신호 발생기</td><td></td><td></td><td>최대 50 kHz</td></tr><tr><td>빔 콜리메이터</td><td>Olympus Corporation</td><td>DApo20UV340</td><td></td></tr><tr><td>UV 릴레이 렌즈</td><td>Special Optics</td><td>#: 54-25-60-355</td><td></td></tr></tbody></table>

브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 micromirror 장치와 패턴 photostimulation

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

라이트의 연결을 흥분을 제어하는​​ 다목적 정확한 의미합니다. 이러한 채널 rhodopsin 및 갇힌 신경 전달 물질로 빛이 민감한 effectors의 최근 도입 공간 및 실험 신경 과학에 대한 유용한 시간에 빛의 패턴을 제어하는​​ 더 나은 방법을 개발에 관심이 들어서있다. 공촛점 및 2 광자 현미경에서 근무 한 종래의 전략은, 회절 제한된 장소에 조명을 집중하고 관심의 영역을 통해 순차적으로 그 하나의 자리를 검사하는 것입니다. 큰 영역을 짧은 시간 창, 이미지에 비해 photostimulation 더 적용 문제 이내에 자극해야 할 경우이 방법은 문제가된다. 대체 전략은 디지털 micromirror 장치 (DMD)의 도움을 대상에 전체 공간 패턴을 프로젝트에있다. DMD 접근 방식은 하드웨어 구성 요소가 상대적으로 저렴한 때문에 매력이며 상업적 이익에 의해 지원됩니다. 이러한 시스템이 직립 현미경 사용할 수 없기 때문에, 우리는 DMD 시스템의 구축 및 운영에 중요한 문제를 논의합니다. 우리가 주로 UV 광분해을위한 시스템의 구축을 설명한다하더라도, optogenetic 실험에 대해 훨씬 더 간단 가시 광선 시스템을 구축하기위한 수정도 제공됩니다. UV 광분해 시스템 신경 과학에 근본적인 질문을 연구하기 위해 실험을 carryout 위해 사용되었던, 어떻게 공간 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 통합된 입력을 배포합니다. 결과는 통합 지점 지점에 걸쳐 비선형 수 있으며 supralinearity가 주로 NMDA 수용체에 의해 중재되어 좋습니다.

디지털 micromirror 장치 (DMD)는 흥분의 연결을 제어할 수있는 시간과 공간의 복잡한 패턴을 생성할 수 있습니다. 설계, 건설 및 DMD 시스템의 운영과 관련된 문제가 논의됩니다. 이러한 시스템은 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 통합의 데모를 활성화.

브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 Micromirror 장치와 패턴 Photostimulation

빛은 신경세포의 흥분성을 조절하는 다재다능하고 정밀한 수단입니다. 최근 채널로돕신(channel-rhodopsin)과 같은 광민감성 작동자(light sensitive effectors)의 도입으로...

이 절차의 전반적인 목표는 빛의 복잡한 시간적 및 공간적 패턴을 제어하여 뉴런을 자극하는 데 사용하는 것입니다. 이는 먼저 광학 현미경 경로 내의 적절한 공액 이미지 평면에 DMD 칩을 배치함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 레이저와 같은 강한 광원을 사용하여 DMD를 적절하게 조사하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 가간섭성 조명으로 인한 스펙클 현상을 제거하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 DMD 칩을 제어하기 위한 그래픽 사용자 인터페이스를 통합하는 것입니다. 궁극적으로, DMD 시스템을 이용한 케이지 신경전달물질의 다중 부위 용해를 통해 이전에는 달성하기 어려웠던 실험들을 이제는 비교적 쉽게 완료할 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 메릴랜드 대학교 신경과 Chaman Tang 박사님 연구실의 Michael Mohammed입니다. 오늘은 광학 현미경에서 복잡한 제거 패턴을 생성하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 수상돌기 통합을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 본 프로토콜에서는 실험 신경과학을 위한 디지털 마이크로 미러 장치(DMD) 조명 시스템의 작동 방법을 시연합니다. DMD는 표면에 수십만 개의 미세한 가동 미러가 직사각형 배열로 배치된 광학 반도체 칩으로, 각 미러의 위치는 이미지의 픽셀에 대응합니다.각 거울은 두 가지 방향 사이에서 기울기를 개별적으로 제어할 수 있습니다. off 방향일 때 빛은 시료 조명의 광축에서 벗어난 방향으로 진행합니다. on 방향일 때 빛은 광축을 따라 진행합니다.DMD는 매우 강한 UV 광원을 견딜 수 있고, 켜진 픽셀과 꺼진 픽셀 간의 높은 대비비를 생성하며, 두 상태 사이를 수십 마이크로초 내에 전환할 수 있어 용해(lysis)에 매우 적합합니다. 바이오메디컬 연구 분야에서 DMD의 적용은 이미지 조작 소프트웨어 및 하드웨어의 광범위한 사용과 이미지 디스플레이 분야의 상업적 관심 덕분에 더욱 촉진되었습니다. 모듈형 구성 요소들은 Texas Instruments에서 DLP discovery kit로 판매되고 있으며, 이는 DMD를 현미경 시스템에 적응시키기 위한 지원 전자 드라이버를 제공합니다.현미경 광학에 관한 기본 개념을 이해해야 합니다. 기본적인 현대식 형광 현미경은 이미징 경로와 조명 경로로 구성됩니다. 이는 대물렌즈, 필터 큐브, 그리고 이미징 경로와 조명 경로를 위한 두 개의 서로 다른 튜브 렌즈로 이루어져 있습니다.이 현미경은 시료 이미지 평면과 공액(conjugate) 관계에 있는 위치들을 갖도록 설계되었으며, 시료 평면에서 초점이 맞은 물체는 이러한 공액 이미지 평면에서도 초점이 맞은 상태로 나타납니다. 이 개념의 당연한 결과로, 공액 이미지 평면에서 생성된 모든 밝은 이미지는 시료 이미지 평면 위에도 선명하게 투영됩니다. 이러한 전략은 컴퓨터로 생성된 조명 패턴을 시료에 투영하는 데 사용됩니다.레이저 빔은 공액 이미지 평면에 위치한 DMD 칩의 마이크로 미러로 구현된 패턴을 조명하는 매우 밝은 광원 역할을 합니다. DMD 조명 시스템의 설계는 가시광선 파장의 빛을 사용하는 광유전학 실험에 쓰이는 여기광에 따라 달라집니다. 조명된 패턴은 카메라 경로를 통해 전달될 수 있습니다.따라서 DMD 칩을 듀얼 카메라 포트 모듈의 두 카메라 포트 중 하나에 간단히 장착할 수 있습니다. 반대로, 케이지 화합물(caged compounds)의 용해와 같이 UV 범위의 빛을 사용하는 실험의 경우, 빛을 에피 조명 경로(epi illumination path)를 통해 가져와야 하며 더 접근하기 쉬운 공액 이미지 평면(conjugate image plane)을 생성해야 합니다. 이는 이미징 튜브 렌즈가 UV 투과용으로 설계되지 않았기 때문입니다.대신에, 조명 튜브 렌즈가 UV 투과를 위해 사용되며 이미지 형성에 적절한 역할을 수행합니다. DMD의 각 마이크로 미러는 칩 평면을 기준으로 +12도와 -12도 기울기 사이를 전환할 수 있습니다. 컴퓨터로부터 받는 디지털 입력에 따라, 회전축은 각 미러의 대각선 모서리를 따라 칩의 직사각형 측면과 45도 각도를 이룹니다.거울 기울기의 방향은 칩 전면의 한쪽 모서리에 있는 금색 삼각형으로 표시되어 있습니다. 마이크로 거울의 기울기는 입사 조명 빔의 피치와 방위각의 정렬을 결정합니다. DMD에 조명을 비추려면 먼저 조명 빔의 피치를 DMD 칩의 수직축에서 24도 되도록 설정하고, 방위각을 거울 회전축과 수직이 되도록 설정하십시오.정밀한 빔 정렬은 효율적인 작동을 위해 매우 중요합니다. 용해 실험의 경우, 신속한 언케이징(uncaging)에 필요한 고강도 집속 빔을 생성하기 위해 레이저 광원을 사용하십시오.여기에서는 준연속 다이오드 펌핑 고체 주파수 3배 ND:YAG 레이저가 사용됩니다. 레이저 출력의 아주 일부분만 실제로 시료에 전달되므로 상대적으로 고출력의 레이저를 사용하십시오. DMD 시스템을 사용할 때는 레이저 출력을 멀티모드 파이버로 유도하여, DMD를 조사하기 위해 올바른 축을 따라 쉽게 위치시키고 방향을 잡을 수 있도록 함으로써 코히런트 조명으로 인해 발생하는 스펙클 문제를 해결하십시오. 광섬유를 통해 빛을 투과시킵니다.광섬유는 약 40 kilohertz로 진동하도록 구동되는 피조 전기 광섬유 스트레처(pazo electric fiber stretcher)에 감겨 있습니다. 이러한 광섬유의 미세한 신축은 각 광 자극 펄스의 밀리초 지속 시간 동안 스펙클 패턴을 여러 번 이동시키기에 충분하며, 이를 통해 스펙클 현상을 효과적으로 제거합니다. 마지막으로, 광섬유의 출력단은 UV 현미경 대물렌즈와 정렬되어 DMD를 조사하며, 개별 DMD 미러를 이미징 CCD 카메라의 특정 픽셀과 상관시키는 DMD 이미지 소프트웨어를 사용하여 CCD 픽셀과 DMD를 코레지스터(coregister)하도록 작성되었습니다.소프트웨어 내의 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 사용자는 컴퓨터 마우스를 사용하여 CCD 이미지의 특정 영역에 해당하는 DMD 미러 방향을 지정할 수 있습니다. 컴퓨터 화면에 표시된 이미지 위로 커서를 이동하여 광자극 위치를 태그하고, 태그된 관심 영역을 클릭하여 빛 전달 패턴 저장소를 프로그래밍하십시오. 컴퓨터 화면에 일련의 개별 이미지로 표시되는 패턴은 각 공간 패턴에 대한 레이저 펄스 타이밍을 소프트웨어에 프로그래밍합니다.이는 데이터 수집 프로그램인 P clamp와 통합됩니다. 마지막으로, 데이터 수집 프로그램을 사용하여 DMD 전자 장치의 타이밍, 레이저 게이팅, 그리고 대상 뉴런으로부터의 패치 클램프 전기 신호 수집을 조정하십시오. 여기서는 광학 시스템 해상도의 보정 과정이 제시되어 있습니다.형광 타겟을 통해 측정된 최소 스폿 크기를 보여줍니다. 유효한 생리학적 해상도는 광자극의 함수로서 전류 흐름의 진폭으로 측정됩니다. 여기의 스폿 위치에서는, 2 µm 직경의 수지상 돌기 분지 인접 부위에서 케이지드 글루타메이트를 광분해하였습니다.스폿을 이동시킴에 따라, 해당 부위에 직교하여 서로 다른 강도의 광자극에 대한 전기적 반응을 나타내었습니다. 분석 강도의 함수로 나타낸 전압 고정 반응을 보여줍니다.분산 수지상 돌기 자극은 DMD 기반 시스템을 사용하여 쉽게 구현할 수 있습니다. 여기서는 두 수지상 돌기 분지 상의 원형으로 표시된 광자극 지점의 수를 늘려 입력 강도를 변화시켰습니다. 공간적 합산은 분지점에서 비선형적으로 나타날 수 있습니다.두 개의 도어 분지로 들어오는 입력 진폭이 증가함에 따라 초선형성(super linearity)이 점차 증가합니다. 이러한 결과는 수지상 돌기 분기점에서의 합산이 비선형 방식으로 이루어짐을 명확히 보여줍니다. 이러한 초선형성은 전압 개폐 채널보다는 주로 NMDA 수용체에 의해 매개됩니다.이는 두 가지 NMDA 길항제인 APV와 MK 801의 적용을 통해 입증될 수 있으며, 이들은 비선형 동작을 상당 부분 제거합니다. 지금까지 신경 조직의 패턴 광자극을 위한 DMD 기반 시스템의 기본 설계 및 작동 방식을 살펴보았습니다. 이 시스템은 광유전학 실험에 사용되는 가시광선 자극에 맞게 조정하여 사용할 수 있습니다.이 장치는 단일 광자 용해(single photon lysis)에 사용되는 근자외선(near UV) 광원에도 적응 가능합니다. 이 절차를 수행할 때, 400 nm 미만의 파장 광원을 사용하고 대부분의 사용자가 에피 조명 경로(epi illumination path)를 통과시키는 경우, 조명 빔을 수 도(degree) 이내로 정밀하게 정렬하는 것이 매우 중요하며, 간섭성 광원(coherent light)을 사용하는 경우에는 스펙클(speckling) 현상을 효과적으로 제거해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 이것으로 모두 끝났습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Bioengineering

생명공학

본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석​​ 할 수 있습니다.

레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

이 동영상은 기능적 신경근 접합부를 평가하는 방법을 보여줍니다. 근육 조직과 운동 뉴런을 포함하는 생물반응기와 형광 현미경을 사용하여 뉴런의 빛에 민감한 채널을 자극하여 전기 신호를 생성하여 근섬유 수축을 일으킵니다.

동시 광 자극 및 비디오 녹화를 통한 기능적 신경근 접합부 평가

출처: Kato, D. et. al., Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy(이광자 홀로그램 현미경을 사용한 신경 활동의 평가 및 조작). J. Vis. Exp. (2022)이 비디오는 홀로그램 현미경을 사용하여 광유전학과 결합된 이광자 이미징 기술을 보여줍니다. 공간 광 변조기를 사용하는 이 기술은 최소한의 광손상으로 적색광에 민감한 단백질과 칼슘 이미징을 표현하는 정밀한 신경 자극을 가능하게 합니다. 이 접근 방식은 신경망의 기능적 연결성 및 구성에 대한 통찰력을 제공합니다.

마우스 모델의 신경 활동과 연결성을 연구하기 위한 이광자 홀로그램 현미경 검사

준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을...

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

시 냅 스 전류 초파리 3 탈피 애벌레 neuromuscular 접속점에 시각화 된 시 냅 스 boutons에서 focally 기록 될 수 있습니다. 이 기술은 단일 시 냅 시스 bouton의 활동을 모니터링 수 있습니다.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

이 프로토콜은 흡광도 전압에 민감한 염료 및 포토다이오드 어레이를 사용하여 비 형이상무척추동물 종의 단일 세포 분해와 신경 인구 활성을 이미징하는 방법을 제시한다. 이 접근 방식을 통해 하루 동안 이미징 및 분석을 추구할 수 있는 빠른 워크플로우가 가능합니다.

비 트랜스제닉 무척추 동물의 단일 신경 해상도를 가진 네트워크 역학을 기록하기위한 포토다이오드 기반 광학 이미징

우리는 비정상적인 신경 활동과 관련된 신경 정신 장애의 발병 기전을 밝히기 위해 높은 시공간 해상도를 사용하여 신경 활동을 시각화, 평가 및 조작할 수 있는 이광자 홀로그램 현미경을 개발했습니다.

이광자 홀로그램 현미경을 사용한 신경 활동의 평가 및 조작

우리는 많은 Caenorhabditis elegans 벌레의 유연한 화학적 및 다중 모드 자극과 동시 신경 활동의 기록 방법을 제시합니다. 이 방법은 미세 유체 공학, 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어, 감독 자동화 데이터 분석을 사용하여 적응, 시간적 억제 및 자극 누화와 같은 신경 현상을 측정할 수 있습니다.

여러 개의 작은 유기체에서 자동화된 다중 모드 자극 및 동시 신경 기록

마이크로미터 규모의 3D 프린팅을 통해 신경 세포 배양을 위한 고분자 장치의 신속한 프로토타이핑이 가능합니다. 원리 증명으로, 뉴런 사이의 구조적 연결은 신경돌기 성장에 영향을 미치는 장벽과 채널을 만들어 제한되었으며, 이러한 조작의 기능적 결과는 세포 외 전기 생리학에 의해 관찰되었습니다.

2광자 중합 마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치의 3D 프린팅

배우세요 디지털 마이크로미러 장치를 이용한 복잡한 빛 패턴 제어로 신경 세포를 자극하는 방법을. 이 기술은 수상돌기 가지점에서의 비선형 통합 연구에 활용됩니다.

브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 Micromirror 장치와 패턴 Photostimulation

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