브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 Micromirror 장치와 패턴 Photostimulation

이 절차의 전반적인 목표는 빛의 복잡한 시간적 및 공간적 패턴을 제어하여 뉴런을 자극하는 데 사용하는 것입니다. 이는 먼저 광학 현미경 경로 내의 적절한 공액 이미지 평면에 DMD 칩을 배치함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 레이저와 같은 강한 광원을 사용하여 DMD를 적절하게 조사하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 가간섭성 조명으로 인한 스펙클 현상을 제거하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 DMD 칩을 제어하기 위한 그래픽 사용자 인터페이스를 통합하는 것입니다. 궁극적으로, DMD 시스템을 이용한 케이지 신경전달물질의 다중 부위 용해를 통해 이전에는 달성하기 어려웠던 실험들을 이제는 비교적 쉽게 완료할 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 메릴랜드 대학교 신경과 Chaman Tang 박사님 연구실의 Michael Mohammed입니다. 오늘은 광학 현미경에서 복잡한 제거 패턴을 생성하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 수상돌기 통합을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 본 프로토콜에서는 실험 신경과학을 위한 디지털 마이크로 미러 장치(DMD) 조명 시스템의 작동 방법을 시연합니다. DMD는 표면에 수십만 개의 미세한 가동 미러가 직사각형 배열로 배치된 광학 반도체 칩으로, 각 미러의 위치는 이미지의 픽셀에 대응합니다.

각 거울은 두 가지 방향 사이에서 기울기를 개별적으로 제어할 수 있습니다. off 방향일 때 빛은 시료 조명의 광축에서 벗어난 방향으로 진행합니다. on 방향일 때 빛은 광축을 따라 진행합니다.

DMD는 매우 강한 UV 광원을 견딜 수 있고, 켜진 픽셀과 꺼진 픽셀 간의 높은 대비비를 생성하며, 두 상태 사이를 수십 마이크로초 내에 전환할 수 있어 용해(lysis)에 매우 적합합니다. 바이오메디컬 연구 분야에서 DMD의 적용은 이미지 조작 소프트웨어 및 하드웨어의 광범위한 사용과 이미지 디스플레이 분야의 상업적 관심 덕분에 더욱 촉진되었습니다. 모듈형 구성 요소들은 Texas Instruments에서 DLP discovery kit로 판매되고 있으며, 이는 DMD를 현미경 시스템에 적응시키기 위한 지원 전자 드라이버를 제공합니다.

현미경 광학에 관한 기본 개념을 이해해야 합니다. 기본적인 현대식 형광 현미경은 이미징 경로와 조명 경로로 구성됩니다. 이는 대물렌즈, 필터 큐브, 그리고 이미징 경로와 조명 경로를 위한 두 개의 서로 다른 튜브 렌즈로 이루어져 있습니다.

이 현미경은 시료 이미지 평면과 공액(conjugate) 관계에 있는 위치들을 갖도록 설계되었으며, 시료 평면에서 초점이 맞은 물체는 이러한 공액 이미지 평면에서도 초점이 맞은 상태로 나타납니다. 이 개념의 당연한 결과로, 공액 이미지 평면에서 생성된 모든 밝은 이미지는 시료 이미지 평면 위에도 선명하게 투영됩니다. 이러한 전략은 컴퓨터로 생성된 조명 패턴을 시료에 투영하는 데 사용됩니다.

레이저 빔은 공액 이미지 평면에 위치한 DMD 칩의 마이크로 미러로 구현된 패턴을 조명하는 매우 밝은 광원 역할을 합니다. DMD 조명 시스템의 설계는 가시광선 파장의 빛을 사용하는 광유전학 실험에 쓰이는 여기광에 따라 달라집니다. 조명된 패턴은 카메라 경로를 통해 전달될 수 있습니다.

따라서 DMD 칩을 듀얼 카메라 포트 모듈의 두 카메라 포트 중 하나에 간단히 장착할 수 있습니다. 반대로, 케이지 화합물(caged compounds)의 용해와 같이 UV 범위의 빛을 사용하는 실험의 경우, 빛을 에피 조명 경로(epi illumination path)를 통해 가져와야 하며 더 접근하기 쉬운 공액 이미지 평면(conjugate image plane)을 생성해야 합니다. 이는 이미징 튜브 렌즈가 UV 투과용으로 설계되지 않았기 때문입니다.

대신에, 조명 튜브 렌즈가 UV 투과를 위해 사용되며 이미지 형성에 적절한 역할을 수행합니다. DMD의 각 마이크로 미러는 칩 평면을 기준으로 +12도와 -12도 기울기 사이를 전환할 수 있습니다. 컴퓨터로부터 받는 디지털 입력에 따라, 회전축은 각 미러의 대각선 모서리를 따라 칩의 직사각형 측면과 45도 각도를 이룹니다.

거울 기울기의 방향은 칩 전면의 한쪽 모서리에 있는 금색 삼각형으로 표시되어 있습니다. 마이크로 거울의 기울기는 입사 조명 빔의 피치와 방위각의 정렬을 결정합니다. DMD에 조명을 비추려면 먼저 조명 빔의 피치를 DMD 칩의 수직축에서 24도 되도록 설정하고, 방위각을 거울 회전축과 수직이 되도록 설정하십시오.

정밀한 빔 정렬은 효율적인 작동을 위해 매우 중요합니다. 용해 실험의 경우, 신속한 언케이징(uncaging)에 필요한 고강도 집속 빔을 생성하기 위해 레이저 광원을 사용하십시오.

여기에서는 준연속 다이오드 펌핑 고체 주파수 3배 ND:YAG 레이저가 사용됩니다. 레이저 출력의 아주 일부분만 실제로 시료에 전달되므로 상대적으로 고출력의 레이저를 사용하십시오. DMD 시스템을 사용할 때는 레이저 출력을 멀티모드 파이버로 유도하여, DMD를 조사하기 위해 올바른 축을 따라 쉽게 위치시키고 방향을 잡을 수 있도록 함으로써 코히런트 조명으로 인해 발생하는 스펙클 문제를 해결하십시오. 광섬유를 통해 빛을 투과시킵니다.

광섬유는 약 40 kilohertz로 진동하도록 구동되는 피조 전기 광섬유 스트레처(pazo electric fiber stretcher)에 감겨 있습니다. 이러한 광섬유의 미세한 신축은 각 광 자극 펄스의 밀리초 지속 시간 동안 스펙클 패턴을 여러 번 이동시키기에 충분하며, 이를 통해 스펙클 현상을 효과적으로 제거합니다. 마지막으로, 광섬유의 출력단은 UV 현미경 대물렌즈와 정렬되어 DMD를 조사하며, 개별 DMD 미러를 이미징 CCD 카메라의 특정 픽셀과 상관시키는 DMD 이미지 소프트웨어를 사용하여 CCD 픽셀과 DMD를 코레지스터(coregister)하도록 작성되었습니다.

소프트웨어 내의 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 사용자는 컴퓨터 마우스를 사용하여 CCD 이미지의 특정 영역에 해당하는 DMD 미러 방향을 지정할 수 있습니다. 컴퓨터 화면에 표시된 이미지 위로 커서를 이동하여 광자극 위치를 태그하고, 태그된 관심 영역을 클릭하여 빛 전달 패턴 저장소를 프로그래밍하십시오. 컴퓨터 화면에 일련의 개별 이미지로 표시되는 패턴은 각 공간 패턴에 대한 레이저 펄스 타이밍을 소프트웨어에 프로그래밍합니다.

이는 데이터 수집 프로그램인 P clamp와 통합됩니다. 마지막으로, 데이터 수집 프로그램을 사용하여 DMD 전자 장치의 타이밍, 레이저 게이팅, 그리고 대상 뉴런으로부터의 패치 클램프 전기 신호 수집을 조정하십시오. 여기서는 광학 시스템 해상도의 보정 과정이 제시되어 있습니다.

형광 타겟을 통해 측정된 최소 스폿 크기를 보여줍니다. 유효한 생리학적 해상도는 광자극의 함수로서 전류 흐름의 진폭으로 측정됩니다. 여기의 스폿 위치에서는, 2 µm 직경의 수지상 돌기 분지 인접 부위에서 케이지드 글루타메이트를 광분해하였습니다.

스폿을 이동시킴에 따라, 해당 부위에 직교하여 서로 다른 강도의 광자극에 대한 전기적 반응을 나타내었습니다. 분석 강도의 함수로 나타낸 전압 고정 반응을 보여줍니다.

분산 수지상 돌기 자극은 DMD 기반 시스템을 사용하여 쉽게 구현할 수 있습니다. 여기서는 두 수지상 돌기 분지 상의 원형으로 표시된 광자극 지점의 수를 늘려 입력 강도를 변화시켰습니다. 공간적 합산은 분지점에서 비선형적으로 나타날 수 있습니다.

두 개의 도어 분지로 들어오는 입력 진폭이 증가함에 따라 초선형성(super linearity)이 점차 증가합니다. 이러한 결과는 수지상 돌기 분기점에서의 합산이 비선형 방식으로 이루어짐을 명확히 보여줍니다. 이러한 초선형성은 전압 개폐 채널보다는 주로 NMDA 수용체에 의해 매개됩니다.

이는 두 가지 NMDA 길항제인 APV와 MK 801의 적용을 통해 입증될 수 있으며, 이들은 비선형 동작을 상당 부분 제거합니다. 지금까지 신경 조직의 패턴 광자극을 위한 DMD 기반 시스템의 기본 설계 및 작동 방식을 살펴보았습니다. 이 시스템은 광유전학 실험에 사용되는 가시광선 자극에 맞게 조정하여 사용할 수 있습니다.

이 장치는 단일 광자 용해(single photon lysis)에 사용되는 근자외선(near UV) 광원에도 적응 가능합니다. 이 절차를 수행할 때, 400 nm 미만의 파장 광원을 사용하고 대부분의 사용자가 에피 조명 경로(epi illumination path)를 통과시키는 경우, 조명 빔을 수 도(degree) 이내로 정밀하게 정렬하는 것이 매우 중요하며, 간섭성 광원(coherent light)을 사용하는 경우에는 스펙클(speckling) 현상을 효과적으로 제거해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 이것으로 모두 끝났습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.