צעד אחד metabolomics: פחמימות, חומצות אמינו אורגני לכמת בהליך יחיד

בהליך מטבולומי זה בשלב אחד, מכינים דגימות ביולוגיות לניתוח פחמימות, חומצות אורגניות וחומצות אמינו על ידי ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז בהליך יחיד. הדגימות מטופלות תחילה באנזים אוראז להסרת אוריאה. השלב השני של ההליך הוא ייבוש הדגימות בנוכחות חומר ניקוי המורכב משני רכיבים נדיפים, טריאתלון, אמוניום וטרי פלואורו אצטט.

לאחר מכן נגזרת של הרכיבים על ידי טרימתילציה. ולבסוף, ניתוח על ידי כרומטוגרפיה של גז, עץ ספקטרומטריית מסה, כימות אוטומטי של פחמימות, חומצות אורגניות וחומצות אמינו, איזול, גליצין וסוכרי אמינו מאפשר אישור ומעקב אחר רוב ההפרעות הגנטיות שנמצאו בבדיקת יילודים ועוד 38% מההפרעות שאינן נבדקות כיום על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם. שלום, אני ג'ים שומייקר במעבדה לסקר מטבולי באוניברסיטת סנט לואיס.

אני כאן כדי להדגים מטבולומיקה חד-שלבית, שיטה לניתוח נוזלים ביולוגיים עבור מטבוליטים מתווכים מבלי להפריד חומצות, בסיסים ותרכובות ניטרליות. זה מאפשר לעקוב אחר בדיקת יילודים במפרט מסה טנדם בהליך יחיד המאפשר לנתח חומצות אורגניות, חומצות אמינו, פחמימות, נגזרות פחמימות וגליצין ACell הכל בשלב אחד. התוצאה של זה היא שבגרף מאחוריי, אתה יכול לראות שהאבחונים באדום יכולים להיעשות באמצעות מטבולומיקה של צעד אחד, אבל לא היו נקלטים בבדיקת יילודים הנוכחית על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם.

אז בואו נתחיל את ההדגמה. כדי להתחיל בהליך זה, יש לדחוף את דגימת השתן לאמבטיית מים של 37 מעלות צלזיוס. אם המיכל המקורי נפגע, הוצא דגימה למיכל חדש.

קח כמות גדולה של דגימה ואחסן אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגה חרוטי מסומן כגיבוי. לאחר מכן, מדדו ורשמו את הצפיפות האופטית של הדגימה על ידי הנחת כמה טיפות שתן ברפרקטומטר הידני. לאחר מדידת הצפיפות האופטית, סנן את הדגימה דרך מסנן 0.2 מיקרון.

מדוד את נפח הדגימה בהתאם לצפיפות האופטית שנמדדה לפני הסינון. עבור ערכים בין 1 ל- 1.009, השתמש במיליליטר אחד של דגימה עבור ערכים בין 1.01 ל- 1.019. השתמש ב-0.5 מיליליטר דגימה ולערכים בין 1.02 ל-1.05, שלב 0.25 מיליליטר דגימה עם 0.25 מיליליטר מים.

העבר את הנפח שצוין לבקבוקון תגובתי שכבר מכיל את התקנים הפנימיים המסומנים באיזוטופים המפורטים בטבלה המוצגת כאן. התקנים כוללים קריאטין, חומצה מתיל-מלונית, לקטט, פירובט, גליצין, סינוס פניל אלנין, שמן הקשה, גליצין, אוראט, גלוקוז חומצה SEBA, אינוזיטול וטריפטופן. לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של 7.5 יחידות לתמיסת מיקרוליטר של אוראז.

יש לשטוף את הדגימה ולאטום מתחת לפחמן דו חמצני דרך מחיצה אינרטית. החזק את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך הוספת עוד גז פחמן דו חמצני במרווחים של 15 דקות כדי לשמור על הלחץ בסוף הדגירה של 30 דקות ב-20 מיקרוליטר יותר מתמיסת האוראז. שטפו את הבקבוקון בפחמן דו חמצני ושמרו על הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות.

לאחר השלמת הטיפול באוראז, יש להמשיך ישירות לייבוש ולגזור את הדגימה מיד לאחר הטיפול באוראז. ב -500 מיקרוליטר של 30 עד 70 אצטון לתמיסת מתנול. לדגימות, החלף את מחיצת הגומי במחיצה מצופה טפלון.

מצננים את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הסר מוצקים על ידי צנטריפוגה ב-1500 סל"ד למשך 10 דקות, ולאחר מכן פרק את הסופינאט לבקבוקון תגובתי נקי של 2.0 סמ"ק. כעת הוסיפו טרי אמוניום, טרי פלואורו אצטט או T-E-A-T-F-A, שהוא הזרז לטרימתילציה עבור דגימות מיליליטר אחת ב-20 מיקרוליטר, ועבור דגימות של 0.5 מיליליטר או פחות ב-40 מיקרוליטר.

מלאו ניטריל אצטו והניחו מתחת לזרם חנקן בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס עד להשגת נפח קבוע, מה שמצביע על כך שנותר רק T-E-A-T-F-A. הנסיעה אורכת כ-15 דקות. שוב, יש למלא אצטוניטריל ולהניח מתחת לזרם חנקן בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס עד להשגת נפח קבוע, וחוזרים על עצמם עד ארבע פעמים עד שנוצר משקעים.

זה לוקח בערך 10 דקות בכל פעם לאחר התייבשות, מניחים להתקרר כשתי דקות. ממלאים מתילן כלוריד, נזהרים מרתיחה וייבש. זה לוקח בערך ארבע דקות.

ממלאים עם מתילן כלוריד ומייבשים. עוד פעם. לאחר מכן, נגזר את המדגם.

הוסף 150 מיקרוליטר OFM, STFA לדגימות מיליליטר אחת ו -200 מיקרוליטר ל -0.5 מיליליטר או פחות. הדגימות מכסות תחת אטמוספירת חנקן ודוגרות ב-70 מעלות צלזיוס למשך שעה. בתום הדגירה של שעה, עבודה תחת אטמוספירת חנקן כדי להעביר את הדגימות למיקרו-בקבוקונים לניתוח על ספקטרומטר מסה של כרומטוגרף גז, נעשה שימוש כאן ב-Agilent 5 9 7 5 GCMS עם נימי DB חמישה.

עבור מפרט המסה, הגדר את המקור ל-230 מעלות צלזיוס, את המרובע ל-150 מעלות צלזיוס, ואת טווח מסת הסריקה ל-50 עד 650 A MU ב-2.46 סריקות לשנייה. עיכוב הממס הוא ב -3.5 דקות. טמפרטורות המכשיר הן 200 מעלות צלזיוס למזרק ו-250 מעלות צלזיוס.

עבור הממשק, כוונו את התנור ל-80 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואז רמפה ב-4 מעלות צלזיוס לדקה מ-80 עד 130 מעלות צלזיוס, לאחר מכן רמפה בשש מעלות צלזיוס לדקה בין 130 ל-200 מעלות צלזיוס, ולבסוף רמפה ב-12 מעלות צלזיוס לדקה מ-200 עד 285 מעלות צלזיוס והחזיקו למשך 10 דקות. הנח את בקבוקוני המיקרו המחזיקים את דגימות העין הנגזרות להזרקה אוטומטית על ידי ה-GCMS והתחל בניתוח. ספקטרום מייצג של דגימת שתן שנותחה על ידי GCMS לאחר טיפול באוראז מוצג כאן עם הפסגות המתאימות למטבוליטים חומצה פירו גלוטמית, ארבע חומצה אצטית הידרוקסי ציקלו, והוקינסון.

מטבוליטים אלה מעידים על הוקינס אנוריה, הפרעה גנטית נדירה. ניתן להקצות את כל הפסגות בספקטרום למטבוליטים ידועים ולכמת. התוצאות של בדיקות סקר ראשוניות ליילודים יכולות להיות לא ספציפיות.

עם זאת, הרמות הגבוהות של מטבוליטים של הוקינס UR בדגימת השתן שנותחה על ידי GCMS כפי שמוצג כאן, אישרו את האבחנה של טעות מולדת זו של מחלת חילוף החומרים. באמצעות אותה שיטת URIs, אובחנו טעויות מולדות ב-184 חולים. קרוב ל-40% מהאבחנות המוצגות באדום לא היו מתבצעות על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם הנפוצה בבדיקת יילודים.

אז זו ההדגמה שלנו כיצד לבצע מטבולומיקה בשלב אחד באמצעות שיטת אוראז כדי לנתח נוזלים ביולוגיים לפחמימות, חומצות אורגניות וחומצות אמינו, ואציל גליצין, הכל באותו הליך. חשוב לזכור שכאשר אתה מעריך את יעילות ההליך, ניתן להעריך את עיכול האוראז, ההתייבשות וסימולציה של טרימתיל. רק על ידי בדיקת נוכחותם של כל התקנים הפנימיים.

התקנים הפנימיים נבחרו בכוונה כדי להוכיח שלדוגמה, התייבשות הגיעה לשלמות, מכיוון שאם לא, הקריאטינין TRI TMS לא היה קיים בכמות המלאה. אז זו ההדגמה שלנו. אם אתה מעוניין בפקודות המאקרו והספריות שפיתחנו כדי לפרש הליך זה באמצעות chem station, אנא שלח לי דוא"ל לכתובת המוצגת על המסך שלך, ומידע נוסף על המעבדה שלנו ניתן למצוא בכתובת האתר שעל המסך שלך.

תודה רבה. זה ג'ים שומייקר.