특정 바이러스 게놈 염기서열을 검출하기 위한 Nested-PCR

중첩된 중합효소 연쇄 반응인 중첩된 PCR은 특정 유전자 서열을 선택적으로 증폭할 수 있습니다.

표적 바이러스 서열을 검출하려면 적절한 완충액에 표적 바이러스 서열, dNTP 및 내열성 DNA 중합효소를 포함하는 더 큰 DNA 영역을 보완하는 외부 프라이머를 포함하는 마스터 믹스로 시작합니다.

바이러스에 감염된 세포에서 추출한 이중 가닥 바이러스 DNA를 이 혼합물에 첨가합니다. 튜브를 열순환기로 옮깁니다. 첫 번째 PCR 주기를 실행합니다.

변성 중에 이중 가닥 DNA는 두 개의 단일 가닥 주형을 생성합니다. 적절한 어닐링 온도에서 외부 프라이머는 해당 표적 서열에 결합합니다. 나중에 DNA 중합효소는 dNTP를 사용하여 프라이머를 확장하여 증폭된 DNA 내의 특정 서열을 포함하는 큰 앰플리콘을 생성합니다.

이 앰플리콘을 새 튜브로 옮깁니다. 더 큰 증폭된 DNA 내에서 더 작고 더 특이적인 서열을 표적으로 하는 내부 또는 중첩된 프라이머를 포함하는 신선한 마스터 믹스로 보충하십시오. 두 번째 PCR을 실행합니다.

두 번째 PCR 동안 DNA 가닥이 변성됩니다. 변성 후, 중첩된 프라이머는 단일 가닥 주형의 표적 부위에 결합한 후 중합효소 매개 프라이머 확장이 이어집니다.

두 번째 PCR 주기를 여러 번 반복하여 표적 바이러스 서열을 독점적으로 증폭합니다.

PCR 산물을 분석하여 더 작은 앰플리콘을 시각화하여 특정 바이러스 서열의 존재를 확인합니다.

필요한 시약을 회수하여 사용할 준비가 될 때까지 클린룸의 얼음 위에 보관하십시오. 준비가 되면 시약을 해동하고 소용돌이치십시오. 다음으로, 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 각 샘플에 대해 48마이크로리터의 1차 PCR 혼합물을 준비하고 반응 혼합물을 0.2밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다.

템플릿실의 PCR 워크스테이션에서 cDNA의 2마이크로리터 샘플을 1차 PCR 믹스에 추가합니다. 양성 대조군으로 2마이크로리터의 CVS-11 cDNA를 포함하고 음성 대조군으로 2마이크로리터의 이중 증류수를 포함합니다. 그런 다음 밀봉된 튜브를 PCR 열 순환기로 옮기고 텍스트 프로토콜의 표 3에 나열된 매개변수를 사용하여 순환합니다.

시작하려면 텍스트 프로토콜의 표 4에 설명된 대로 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 각 샘플에 대해 48마이크로리터의 2차 PCR 혼합물을 준비하고 반응 혼합물을 0.2밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다. 2차 PCR 믹스에 2마이크로리터의 1차 PCR 산물을 추가합니다. 이 PCR 라운드의 음성 대조군으로 이중 증류수를 포함합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 표 3에 나열된 매개변수를 사용하여 PCR 열 순환을 수행합니다.