Name: 특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 배우세요 미생물 오염원 추적을 위한 비용 효율적인 정량 PCR 방법을 사용하여 물 샘플에서 인간, 돼지, 소 특이 DNA 바이러스를 정량화하는 기술을 익히세요. 이 방법은 환경 미생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 부분적으로 유럽 연합 (EU) 연구 프레임 워크 7 투자 프로젝트 (계약 번호 513648) VIROBATHE, VIROCLIME (계약 번호 243923로, 스페인 정부 &quot;정부의 드 Educación Y Ciencia&quot;(프로젝트 AGL2008-05275-C01/ALI)에 의해 지원되었다 )과 물의 카탈루냐어 기관, Agència Catalana DE L&#39; Aigua (ACA), Departament 드 제어 내가 Millora dels Ecosistemes 수상하여. 개발 연구 기간 동안 마르타 Rusiñol는 카탈루냐어 정부 &quot;AGAUR&quot;(FI - DGR)의 동료했다.

1. 바이러스 입자의 농도는 물 샘플에 존재 <ol><li> 수집 및 물 샘플의 컨디셔닝 <ol><li> 2의 최소 프로세스 제어와 같은 평면 하단에 하나 추가 샘플과 플라스틱 용기에 시료 당 10 L의 복제 수집합니다. 마지막 예제는 바이러스 입자의 알려진 양의 마약을하고 컨트롤로 사용됩니다. 참고 :이 아군 샘플 특별한 별도의 자료를 (병, 튜브 등)을 권장합니다. </li><li> conductimeter의 교정을 확인하고 필요한 경우 재조정. 한 개는 플라스틱 10 L 컨테이너에서 이전에 충분한 전도성으로 조정 수돗물을 (1.6 아래 참조)를 사용하여 부정적인 컨트롤을 준비합니다. </li><li> 아군 샘플 : 샘플로 제어 바이러스의 표준 볼륨 (물 10 L 당 약 10 5 게놈 사본) 추가합니다. 피하 splashing 및 에어로졸에 감동하여 섞는다. 긍정적인 컨트롤은 아데노 바이러스 s의 드문 변형으로 이루어져 수HAdV - 35 또는 MS2 같은 박테리오 파지로 uch. </li><li> 샘플 정지 재료 (모래 또는 기타 자료)의 높은 수량을 제시하는 경우 15 분 동안 퇴적물을하자. 새 용기에 물을 전송합니다. </li><li> 1 N HCL의 추가에 의해 3.5 (± 0.1)로 물 시료의 산도를 조정합니다. 이 단계는 바이러스의 농도 중요하므로 산도가 제대로 조정되어 있는지 확인하십시오. HCL을 추가하는 동안 활발한 교반에 의해 철저하게 물을 섞는다. (참고 : 산도 3.5 추가 1 M NaOH보다 낮은 경우). </li><li> 전도율을 조정하십시오. 예제 1,500 μS / cm 이상의 전도성이있는 경우이 단계가 필요하지 않습니다. 전도율이 1,500 μS / cm flocculated 재료의 형성 (flocs)가 보증하지 않습니다보다 낮은 경우 있도록 인공 바다 소금 (시그마)의 추가로 1,500 μS / cm로 전도율을 조정합니다. 바다 소금을 추가하는 동안 교반하여 적극적으로 섞는다. </li><li> 뿐만 아니라 이전과 컨디셔닝 후 샘플의 산도를 기록S는 HCL의 볼륨 사용. 전도율도 산도 조정 후 기록한다. 항상 신선한 HCL 솔루션 산도 미터 및 conductimeter 전극을 소독, 10 % 나트륨 tiosulphate 솔루션 dechlorinate 그리고 마지막으로 증류수로 씻어. </li></ol></li><li> 사전 flocculated 1% 무지방 우유의 준비 (PSM) <ol><li> 산도 미터 및 conductimeter의 교정을 확인하고 필요한 경우 재조정. </li><li> 1 L 인공 해수에 10g 무지방 우유 분말 (Difco)를 용해하여 사전 flocculated 무지방 우유 솔루션 (1 % PSM, W / V)를 준비 (dechlorinated 수돗물과 압력솥 1 L에 인공 바다 소금의 33.3 g을 용해)과 신중하게 1N HCL로 3.5 산도를 조정. flocs가 표시되어야합니다. 24 H. 4에서 사용되거나 저장되는 직전 솔루션 ° C를 준비 dechlorination 물 100 ML 당 10 % tiosulphate 솔루션 1 ML을 사용합니다. </li></ol></li><li> 바이러스 입자의 응집 물 샘플에 존재<ol><li> 10 - L 물 샘플 1 %의 PSM 100 ML을 추가합니다. </li><li> 바이러스가 flocs에 adsorb 수 있도록 80-10 H에 대한 샘플을 저어. 80-10 H. 후 스위치 - 오프 감동에 타이머를 사용하여 </li><li> 교반을 중지하고 80-10 H.에 대한 중력에 의해 flocs 퇴적물을하자 </li></ol></li><li> flocs를 수집하고 다시 용해. 원심 분리 <ol><li> 연동 펌프 플라스틱 튜브에 연결된 플라스틱 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 제거합니다. 아군 샘플 뜨는는 병으로 수집되어야하며 내부 절차에 따라 소독. 모든 경우에서 펠릿를 수집하지 않도록 조심해. </li><li> 원심 분리기 병에 flocs (약 500 ML)와 침전물를 수집합니다. </li><li> PSM의 산도 3.5의 추가에 의해 냄비 균형을. </li><li> 4 30 분 8,000 XG에서 고속 원심 분리기에 냄비를 원심 ° C. 즉시 원심이 중지로 조심스럽게 원심에서 원심의 냄비를 제거합니다. </li><li> 매우 gently에서 기름을 붓고 뜨는 폐기하십시오. 전염성 물질에 대한 적절한 조치를 따르십시오. </li><li> 각각의 원심 분리기 병의 펠렛을 해산하기 위해 인산 버퍼 7 ML을 추가합니다. </li><li> flocs가 해산되고 나면, 측정 및 10 ML의 총 볼륨에 도달 인산 버퍼를 추가합니다. </li><li> vortexing하여 바이러스 집중을 Homogenize와 -80에서 냉동해야 깨끗한 microtubes로 10 ML을 배포 ° C 더 분석이 필요까지. </li></ol></li></ol> 2. 핵산 추출 <ol><li> 제조 업체 지침에 따라 QIAamp 바이러스성 RNA 미니 키트와 핵산 추출을 수행합니다. 이 키트는 자동 플랫폼 (예 : Qiacube, Qiagen 등)의 사용이 가능합니다. </li></ol> 3. 인간 adenoviruses (HAdV), JC의 polyomaviruses (JCPyV), 돼지의의 adenoviruses (PAdV)와 소 polyomaviruses의 양적 PCR (BPyV) <ol><li> 샘플의 게놈 사본 부량 <ol><li> 준비TaqMan 환경 PCR 마스터 믹스 2X을 (Biosystems 응용)를 사용하여 깨끗한 별도의 영역에 qPCR 믹스. 반응은 광학 접착제 커버로 덮여 96 잘 광 반응 플레이트에서 열립니다. 마스터 믹스의 농도는 primers와 프로브는 표 1에 설명되어 있습니다. </li><li> 일단 믹스가 나누어지는의 15μl 잘 (3.2 참조) 컨트롤을 포함하여 각에, 준비되었습니다. 타겟 또한 이후에 반응에 대한 전체 볼륨 (15μl 믹스 + 10μl 샘플 또는 표준) 25μl 것입니다. </li><li> 별도의 영역에 샘플 (10μl)에서 핵산 extractions을 추가합니다. 중복된 각 샘플의 물을 정화에 직접 10 배로 희석 실행합니다. 접착제 커버의 일부로 샘플을 포함하고있는 우물을 커버, 다음 단계에 대한 커버의 다른 부분을 유지. </li><li> 세중의 10 0-10 6 GC/10μl에서 DNA 표준 정지 (10μl)의 dilutions를 추가하고 전용 스탠 사용 micropipette를 사용하여dard의 DNA. 플라스미드 DNA를 파괴하고 각 사용 후에 micropipette를 청소하는 UV 방사선을 갖춘 지역의 표준을 추가하는 것이 좋습니다 좋습니다. 사전 컷 접착제 커버와 기준을 포함​​하고있는 우물을 커버. 참고 : 게놈 사본의 부량에 사용되는 표준 정지를 준비하기 위해서는 대상 지역은 DNA 플라스미드 및 선형에 복제해야합니다. 다음 주소에서 당신은 qPCR에 사용되는 플라스미드 DNA를 템플릿을 사용하여 표준 곡선을 만드는 방법에 대한 자세한 절차를 발견할 것이다 : <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li> 적절한 매개 변수를 (접착제 커버하고 각 잘 등에서 전체 볼륨의 사용을 고려) 선택 적절한 시스템에 qPCR을 수행합니다. 95시 10 분 대한 AmpliTaq 골드의 다음 활성화 ° C, 증폭의 40주기 다음과 같이 수행됩니다 : 95 ° C 15의그리고 HAdV, JCPyV 및 BPyV, 및 95에 15의 60 ° C에서 1 분 ° C, 55에서 20 ° C와 60 ° 20 PAdV를위한 C. </li><li> 반응이 완료되면, 같은 장비의 사용자 매뉴얼에 설명되어있는 저장 데이터와 결과를 사용합니다. DNA의 금액은 필요할 때 희석 계수를 수정 후 얻은 데이터의 평균으로 정의됩니다. </li></ol></li><li> 컨트롤 <ol><li> 긍정과 부정 컨트롤을 사용합니다. 검정은 혼합이 형광을 생산하지 않는 증명하기 위해 하나 이상의 비 템플릿 컨트롤 (NTC)를 포함해야합니다. 공부 샘플에 존재 억제제에 의한 잠재 효소 억제를 평가하기 위해 긍정적인 공정 제어를 실행하는 것이 좋습니다 좋습니다. </li><li> 표준 DNA와 프로세스 제어의 두 가지 dilutions의 qPCR assays의 기록 결과를. assays의 감도와 효율성에 관한 품질 관리 (QC) 프로그램에 대한 제어 차트를 준비하는 결과를 사용합니다. </li></ol></li><li> 의 확인결과 <ol><li> 긍정적인 결과는 더욱 긴장의 뉴클레오 티드 시퀀스에 대한 추가 데이터를 생산, amplicons의 중첩된 - PCR 및 염기 순서를 1,5,6,7,9,12를 감지를 사용하여 확인할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 절차 설명에 따라 인간과 동물의 바이러스가 감지되어 있고 해수욕장 바다, 해수와 강물 2,3의 계량. 대표 예를 들어, nitrates의 높은 수준을 보여주고 지역에서 지하수 샘플이 오염의 근원을 정의하는 평가했다. 만 리터 물 샘플은 스페인에서 동북아 지역의 시골 지역에 4 개의 우물에서 수집되었다. 다섯 공정 제어로 사용 인간 아데노 바이러스 2 씨앗을 각각 잘되는 한 복제에 수집된 복제합니다. 샘플은 그림 1에 나타내는 프로토콜에 따라 처리했다. 넷 (값 7.7을 의미 PAdV에 대한 긍정적인 결과를 보여주 공부 네 개의 사이트 중 하나에서 분석 복제샘플링 사이트를 둘러싸고있는 지역에서 돼지 slurries의 존재과 관련이있을 것이며 지하수에 nitrates (표 2)의 소스로 지저분한 돼지의 오염을 지원 4x10이 GC / L). 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 물 속에 바이러스의 감지 및 부량 절차. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> primers와 qPCR의 assays에 대한 프로브의 표 1. 농도. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="표 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 3"> 표 2. 감지 및 지하수 샘플에서 동물과 인간의 adenoviruses과 polyomaviruses의 부량. 의 N 번호 분석 복제 긍정의 % 비율 복제 (-) 이외의 발견

<ol><li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li>
<li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li>
<li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li>
<li>de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li>
<li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li>
<li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li>
<li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Z.+Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li>
</ol>

두 개의 특허 출원이 PAdV과 BPyV의 부량을위한 프로토콜의 지적 재산권을 보호하기 위해 2009 년 제기했다.

<html> 재현성, 신뢰성, 간단하고 비용 효율 : 설명 절차는 일상적인 환경과 공중 보건 실험실의 피팅 방법에 대한 조건을 충족합니다. 프로토콜은 간단하다, 그러나 그것은 신중하게 따라야합니다. 응집에 대한 교반 시간이 크게 (예를 들어 미만 5 시간) 감소 경우가대로 인공 해수 염분의 요청 농도를 추가하지 않고 샘플의 낮은 전도성이 크게 바이러스의 회복을 줄일 것입니다. 현재 적용 산악 표준시 도구는 일반적으로 분자 기술을 기반으로합니다. 다른 그룹에 의해 개발 연구 필요에 따라 현재 사용 매개 변수 밖으로 (즉, 박테리아 유전자)가 아무도 구체적으로 없다는 것을 보여주었다. 따라서 이러한 매개 변수의 조합의 사용은 물이 기관 8,11의 배설물로 오염의 근원의 효율적인 추적을위한 최적의 근사치로 제안되었습니다. 최근 jove_content &quot;&gt;, 대부분의 경우 임상 증상의 부재로 지속적인 감염을 생산 선택한 DNA 바이러스의 연구 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 고속 원심 분리기 (8,000 XG) </td><td> Berckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 아벤티 J - 20XP </td><td></td></tr><tr><td> 산도 미터, 온도계 및 conductimeter </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 튜브 1백-2백센티미터 길이 </td><td> Deltalab </td><td> 350,059 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 일회용 pipettes 졸업 </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 10-15 ML (Eppendorf, 팔콘, 등) 살균 플라스틱 튜브 </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기의 냄비 (500 ML) </td><td> 피셔 과학 </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> 자기 stirrers 및 자석 (당샘플) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 10,510 </td><td></td></tr><tr><td> 자기 stirrers의 사용을 허용하는 평면 바닥 데 유리 또는 플라스틱 용기 </td><td> Deltalab </td><td> 191,642 </td><td></td></tr><tr><td> 뜨는 (또는 물 제트 진공 펌프)를 제거 연동 펌프 </td><td> 왓슨 - Marlow </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> 타이머 스위치 - 오프 80-10시간 후 감동에 </td><td> Deltalab </td><td> 900,400 </td><td></td></tr><tr><td> 염산 (1N과 0.1N) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 (1N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> 인공 해수 바다 소금 </td><td> 시그마 </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> 무지방 우유 (SM) </td><td> Difco </td><td> 232,100 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 산도 75 </td><td></td><td></td><td> 1시 2분 V / V 살균 나 2 HPO 4 0,2 M과 산도 7.5에 아니 2 PO 4 0,2 M </td></tr><tr><td> Thiosulphate </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> 물에 10 % 용액을 만들어 </td></tr><tr><td> QIAamp 바이러스성 RNA 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 52,904 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 광 반응 플레이트 (500 세대) </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> 광학 접착제 커버 (100 세대) </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,311,971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan 환경 PCR 마스터 믹스 2 배 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,396,838 </td><td></td></tr></tbody></table>

특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

환경의 미생물 오염 중요한 건강 위험을 나타냅니다. 고전 세균 배설물 지표는 상당한 한계를 가지고 나타났습니다, 바이러스 오염의 원인에 대한 정보를 제공하지 않는 많은 불활 ​​성화 과정 및 표준 배설물 지표에 더 저항하고 있습니다. 물 분자 assays에서 바이러스의 농도에 대한 비용 효율적인 방법의 개발은 배설물 오염의 지표와 같은 미생물의 소스 추적 (MST) 도구와 같은 바이러스의 적용을 용이하게합니다. Adenoviruses 및 polyomaviruses 인간을 포함한 척추 특정 수종을 감염 DNA 바이러스이며 지속적으로 배설물 및 / 또는 공부를 모든 분야에서 지역 소변에서 배설됩니다. 이전 연구에서 우리는 인간 adenoviruses (HAdV)과 인간의 배설물로 오염의 인덱스로 정량 PCR (qPCR)에 의해 JC의 polyomaviruses (JCPyV)의 부량을 제안했습니다. 최근, 우리는 포의 특정 부량에 대한 qPCR의 assays을 개발했습니다cine의 adenoviruses (PAdV) 및 테스트 튜브 당 10-10 게놈 사본 감성과 오염의 동물 배설물 마커로 소 polyomaviruses (BPyV). 본 연구에서는, 우리는 이러한 도구를 사용하여 물 샘플의 오염의 원인을 확인하기 위해 따라야하는 절차를 제시한다. 대표 결과 예를 들어, nitrates의 높은 수준을 보여주고 지하수의 바이러스의 분석이 나타납니다. 낮은 또는 적당히 오염된 바다에서 바이러스가 탐지되면 훨씬 작은 볼륨, 보통 시리즈의 두 농도 단계를 포함하는 프로 시저에 물을 적어도 몇 리터에서 바이러스의 농도를 필요로합니다. 이 다소 성가신 과정 및 바이러스 recoveries에서 관찰 다양성은 크게 물 샘플을 다수의 동시 처리를 방해. 우리가 이전 studie에서 개발한 한 단계 프로토콜을 적용 두 단계 절차로 인해 발생하는 병목 현상을 제거하기 위해의 및 수상 매트릭스의 다양한 적용. 열 리터 물 샘플의 산성화, 무지방 우유에 의해 응집, flocculated 물질의 중력 침강, 침전과 원심 분리를 수집, 10 ML 인산 버퍼에있는 침전물의 resuspension를 : 프로 시저가 포함됩니다. 바이러스 집중은 바이러스 핵산과 특정 adenoviruses과 관심 polyomaviruses qPCR에 의한 계량 아르의 추출에 사용됩니다. 샘플 높은 번호는 동시에이 저렴한 비용으로 집중 방법을 사용하여 분석 수 있습니다. 절차는 입욕 물, 해수 및 하천 물의 분석에 적용이 연구에서 우리는 지하수 샘플을 분석 결과를 제시했습니다. 이 높은 처리량 정량 방법, 신뢰할 수있는 간단하고, 비용 효과적입니다.

연구는 산악 표준시 도구로 제안 인간 / 돼지의 / 소 DNA 바이러스, adenoviruses과 polyomaviruses의 특정 부량에 대한 qPCR을 사용하여 물속에서 nitrates에 의해 배설물 / 소변 오염 또는 오염의 소스의 식별을위한 비용 효율적인 방법을 설명합니다.

환경의 미생물 오염은 중대한 건강 위험을 나타냅니다. 전통적인 박테리아 분변 지표는 상당한...

특정 인간 및 동물 바이러스를 이용한 미생물 오염원 추적의 비용 효율적인 방법입니다. 본 연구에서는 미생물 오염원 추적 도구로 제안된 인간, 돼지, 소의 DNA 바이러스, 아데노바이러스 및 폴리오마바이러스를 정량적으로 분석하기 위해 quantitative PCR을 사용하여, 수중의 분변-소변 오염 또는 질산염 오염원을 식별하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 연구진은 탈지분유를 이용한 유기 응집법으로 10 liter 수질 시료에서 바이러스를 농축하고, 침전물로부터 바이러스 핵산을 추출하며, quantitative PCR을 사용하여 인간, 소 또는 돼지의 DNA 바이러스를 정량화하는 프로토콜을 개발하였습니다.비타민의 미생물 오염은 중대한 건강 위험을 초래하는 것으로 잘 알려져 있으며, 따라서 오염원을 파악하는 것이 필요합니다. 본 연구에서는 매우 널리 퍼져 있는 DNA 바이러스를 미생물 오염원 추적 도구로 사용할 것을 제안하였습니다. 선택된 바이러스는 아데노바이러스(adenoviruses)와 폴리오마바이러스(polyomaviruses)입니다.해당 바이러스들은 연중 내내 모든 지리적 영역에서 지속적으로 배출되고 있으며, 이는 이전 연구들을 통해 확인되었습니다. 본 연구진은 수중 바이러스의 견고하고 저렴한 농축법을 개발하였으며, 돼지 아데노바이러스 및 소 폴리오마바이러스의 정량을 위한 qPCR 분석법을 개발해 왔습니다.또한, QPCR로 테스트한 인간 아데노바이러스와 NGC 폴리오마바이러스를 수중의 인간 오염 표지자로 사용합니다. 수질 시료 수집 단계에서는, 수질 시료당 10리터씩 4회 반복하여 바닥이 평평한 플라스틱 용기에 수집하며, 공정 제어용으로 추가 시료 1개를 더 수집합니다. 이 마지막 시료에는 대조군으로 사용되는 기지의 양의 바이러스 입자를 접종합니다.추가적인 10리터 플라스틱 용기 하나에 수돗물을 담아 실험실 내 음성 대조군을 준비합니다. 시료에 부유물, 모래 및 기타 물질이 다량 포함되어 있는 경우, 15분 동안 침전시킨 후 물을 새 용기로 옮깁니다. 유기 응집을 통한 바이러스 농축.낮거나 중간 정도의 오염도를 가진 수질 샘플에서 바이러스를 검출하려면, 최소 수 리터의 물에 포함된 바이러스를 훨씬 더 작은 부피로 농축해야 합니다. 농축 과정에는 10L 수질 샘플의 산성화, 탈지분유를 이용한 응집, 응집물의 중력 침강, 그리고 10mL 인산 완충액에 침전물을 수집하는 단계가 포함됩니다. 이 과정을 시작하기 위해, 인공 해수에 탈지분유를 녹인 용액을 준비하며, 이를 위해 탈지분유 분말 10g을 인공 해수 1L에 용해시킨 후 염산을 사용하여 pH를 3.5로 정밀하게 조정합니다. 그러면 응집물이 육안으로 확인되어야 합니다.용액은 사용 직전에 준비하거나 4°C에서 24시간 동안 보관하십시오. 수질 시료를 교반하고 시료의 전도도를 측정합니다. 전도도가 1.5 millisiemens 미만이면 해염을 첨가합니다.염산을 첨가하여 수질 시료의 pH를 3.5로 조정합니다. 전처리 전후의 시료 pH와 사용된 염산의 부피를 기록하십시오. 전기전도도 또한 함께 기록해야 합니다.pH를 조절한 후, 10 L의 물 시료에 1% 탈지분유 100 mL를 첨가하고 8~10시간 동안 교반하여 바이러스가 플록(flock)에 흡착되도록 합니다. 공정 제어용으로 사용되는 스파이크 시료의 경우, 대조군 바이러스의 표준 부피(예: 1 mL)를 시료에 첨가합니다. 교반을 중단하고 8~10시간 동안 중력에 의해 플록이 침전되도록 둡니다.보통 다음 날인 16시간 후에 침전물을 수집할 수 있습니다. 이를 위해 연동 펌프를 사용하여 상층액을 제거하십시오. 플록(flocks)이 포함된 침전물 약 500 milliliters를 원심분리 병에 수집하십시오.pH 3.5의 탈지분유 희석액을 추가하여 튜브의 무게 균형을 맞춘 후, 고속 원심분리기를 사용하여 4°C에서 8,000 Gs로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 멈추자마자 원심분리 튜브를 주의해서 꺼냅니다. 상층액을 매우 조심스럽게 따라내어 버립니다.각 원심분리 병의 펠렛을 최종 부피 10 milliliter의 인산염 완충액에 녹여 바이러스의 핵산 추출 및 정량을 수행합니다. 바이러스 농축액은 바이러스 핵산 추출에 사용되며, 대상이 되는 특정 아데노바이러스 및 폴리오마바이러스는 A-Q-P-C-R로 정량합니다. key amp viral RNA mini kit를 사용하여 핵산 추출을 수행합니다.140 µL의 바이러스 농축액에 포함된 바이러스의 용해는 수동으로 수행하며, 총 핵산을 80 µL로 추출합니다. 이 키트는 Key cube와 같은 자동화 플랫폼에서의 사용이 가능합니다.다음 단계는 바이러스 게놈의 정량 분석입니다. TaqMan 프로브를 이용한 정량 PCR을 통해 샘플 내 복제 수를 측정하며, 인간 아데노바이러스, JC 폴리오마 바이러스 및 소 폴리오마 바이러스는 동일한 96-웰 플레이트에서 정량할 수 있습니다. 모든 바이러스가 동일한 증폭 사이클을 사용하므로, 표적 바이러스의 정량을 위해 돼지 아데노바이러스는 별도의 독립된 플레이트에서 테스트해야 합니다.깨끗하게 분리된 구역에서 quantitative PCR 믹스를 준비하십시오. 믹스 준비가 완료되면 대조군을 포함하여 각 웰에 15 µL씩 분주하십시오. 별도의 구역에서 샘플에서 추출한 핵산을 10 µL씩 첨가하십시오. 각 샘플에 대해 직접 분석과 정제수에 10배 희석한 분석을 중복으로 수행하십시오. 타겟 첨가 후 반응 1회당 총 부피는 믹스 15 µL와 샘플 또는 표준물질 10 µL를 합쳐 25 µL가 됩니다. 샘플이 들어있는 웰을 접착식 커버의 일부로 덮으십시오.커버의 나머지 부분은 다음 단계를 위해 남겨두십시오. DNA 표준 현탁액의 희석 과정입니다. 10 µL의 10¹부터 10⁶ genome copies까지를 3반복으로 분주하며, 표준 DNA 커버 전용 마이크로피펫을 사용하여 분주하십시오.접착식 커버를 미리 절개한 표준물질 포함 웰들의 모습입니다. 이 그림은 96웰 플레이트 내의 표준물질 현탁액 샘플 및 대조군의 배치를 보여줍니다.적절한 시스템에서 QPCR을 수행하며, amplitude gold를 10분 동안 활성화한 후 적절한 파라미터를 선택하십시오. 반응이 완료되면 95°C에서 40 사이클의 증폭을 수행합니다. 데이터와 결과는 사용한 장비의 사용자 매뉴얼에 설명된 대로 저장하십시오.DNA 양은 필요한 경우 희석 배수를 보정한 후 얻은 데이터의 중앙값으로 정의합니다. 돼지 아데노바이러스(porcine adenoviruses) 정량화를 위해 얻은 증폭 플롯과 표준 곡선은 0.999의 상관 계수를 나타냈습니다. 해당 절차에 따른 허용 가능한 기울기 값의 범위는 -3.1에서 -3.6 사이입니다.오염원을 정의하기 위해 질산염 수치가 높은 지역의 지하수 샘플에서 기재된 인간 및 동물 바이러스를 테스트하였습니다. 분석된 4회의 반복 실험 결과, porcine adenovirus의 평균값이 L당 10⁻² 유전체 복제본 기준 7.74로 양성 반응을 보였으며, 이는 샘플링 지점 주변 지역의 돼지 슬러리 존재와 관련이 있으며 지하수에 돼지 분변 오염이 존재함을 입증합니다. 테스트한 어떤 샘플에서도 인간에 의한 오염은 나타나지 않았습니다.바이러스학적 데이터는 nested PCR 및 시퀀싱 분석을 통해 확인되었습니다.결론. 본 연구에서 우리는 지하수 시료를 분석한 결과를 제시하였으며, 인간 또는 소의 오염이 없는 상태에서 돼지 유래의 오염이 있음을 나타냈습니다. 또한 이 절차는 해수욕장 물, 바닷물 및 강물 분석에도 적용되었습니다.본 논문에서는 이러한 도구들을 지하수의 오염원 식별에 적용하는 절차를 제시하며, 환경 내 오염원을 탐지하기 위한 개발된 방법들의 적용 가능성 사례로 고농도의 질산염이 검출된 사례를 소개합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Virochip 동시에 보존 순서 상동에 기초하여 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설의 바이러스를 검출하기위한 판 - 바이러스 microarray입니다. 여기 알려진 알려지지 않은 두 바이러스의 존재에 대한 임상 샘플을 분석 Virochip 분석을 실행하는 방법을 보여줍니다.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

이 연구는 휴대용 RRT - PCR 시스템을 사용 야생 조류에서 조류 독감의 진단을 설명합니다. 방법은 확산 시나리오의 전형이 아닌 실험실 환경에서 야생 조류를 화면에 냉동 건조 시약을 활용합니다. 분자 도구의 사용은 신속한 진단을 위해 정확하고 민감한 대안을 제공합니다.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 - 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

synaptically 연결 뉴런을 추적하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 관심의 세포 인구가 유전자 정의 셀 유형에서 시냅스 입력을 받고 있는지 여부를 조사하기 위해 상류 세포의 TVA의 특이성을 사용합니다.

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나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

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음이온 교환 수 지 기반 방법, 바이러스의 충돌-기반 bioaerosol 샘플링 시연 액체에 적응 합니다. 다운스트림 분자 탐지와 결합 하면 메서드 bioaerosols에서 바이러스의 손쉬운 및 민감한 감지.

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여기에서 우리는 VirWaTest를 제시, 이는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법입니다.

VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

수많은 새로운 바이러스 유사 서열이 시퀀싱 기술의 광범위한 사용으로 인해 모기에서 발견되었습니다. 우리는 척추동물 및 모기 세포주를 사용하여 바이러스를 분리하고 증폭하는 효과적인 절차를 제공하며, 이는 모기 매개 및 모기 특이적 바이러스를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초가 될 수 있습니다.

현장에서 채취한 모기로부터 모기 관련 바이러스 분리

DNA 바이러스의 미량 검출을 위한 CRISPR/Cas12a 시스템과 재조합 중합효소 증폭을 결합한 프로토콜을 제시하고, 현장 진단 DNA 바이러스 검출을 위한 인공 지능 지원 분류를 통해 휴대용 스마트폰 현미경을 구축합니다.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM 및 딥러닝 기반의 DNA 바이러스 검출 시스템

여기에서는 나노포어 기술을 사용하여 광견병 바이러스(RABV) 게놈을 특성화하기 위한 빠르고 비용 효율적인 워크플로우를 제시합니다. 이 워크플로우는 지역 수준에서 유전체학 정보 감시를 지원하기 위한 것으로, 광견병 통제 조치를 안내하기 위해 순환하는 RABV 계통 및 지역 계통 발생 내 배치에 대한 정보를 제공합니다.

나노포어 기술을 사용한 광견병 바이러스의 신속한 특성 분석을 위한 전체 게놈 염기서열 분석

여기에서는 이중 리포터 유세포 분석 시스템을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2 결합 자기 마이크로스피어에 의해 포착된 온전한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 입자에서 두 개의 고유한 스파이크 단백질 에피토프를 동시에 검출하는 새로 개발된 다중 형광 면역분석법에 대해 설명합니다.

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

배우세요 미생물 오염원 추적을 위한 비용 효율적인 정량 PCR 방법을 사용하여 물 샘플에서 인간, 돼지, 소 특이 DNA 바이러스를 정량화하는 기술을 익히세요. 이 방법은 환경 미생물학 연구에 활용됩니다.

특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법

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