특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법

특정 인간 및 동물 바이러스를 이용한 미생물 오염원 추적의 비용 효율적인 방법입니다. 본 연구에서는 미생물 오염원 추적 도구로 제안된 인간, 돼지, 소의 DNA 바이러스, 아데노바이러스 및 폴리오마바이러스를 정량적으로 분석하기 위해 quantitative PCR을 사용하여, 수중의 분변-소변 오염 또는 질산염 오염원을 식별하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 연구진은 탈지분유를 이용한 유기 응집법으로 10 liter 수질 시료에서 바이러스를 농축하고, 침전물로부터 바이러스 핵산을 추출하며, quantitative PCR을 사용하여 인간, 소 또는 돼지의 DNA 바이러스를 정량화하는 프로토콜을 개발하였습니다.

비타민의 미생물 오염은 중대한 건강 위험을 초래하는 것으로 잘 알려져 있으며, 따라서 오염원을 파악하는 것이 필요합니다. 본 연구에서는 매우 널리 퍼져 있는 DNA 바이러스를 미생물 오염원 추적 도구로 사용할 것을 제안하였습니다. 선택된 바이러스는 아데노바이러스(adenoviruses)와 폴리오마바이러스(polyomaviruses)입니다.

해당 바이러스들은 연중 내내 모든 지리적 영역에서 지속적으로 배출되고 있으며, 이는 이전 연구들을 통해 확인되었습니다. 본 연구진은 수중 바이러스의 견고하고 저렴한 농축법을 개발하였으며, 돼지 아데노바이러스 및 소 폴리오마바이러스의 정량을 위한 qPCR 분석법을 개발해 왔습니다.

또한, QPCR로 테스트한 인간 아데노바이러스와 NGC 폴리오마바이러스를 수중의 인간 오염 표지자로 사용합니다. 수질 시료 수집 단계에서는, 수질 시료당 10리터씩 4회 반복하여 바닥이 평평한 플라스틱 용기에 수집하며, 공정 제어용으로 추가 시료 1개를 더 수집합니다. 이 마지막 시료에는 대조군으로 사용되는 기지의 양의 바이러스 입자를 접종합니다.

추가적인 10리터 플라스틱 용기 하나에 수돗물을 담아 실험실 내 음성 대조군을 준비합니다. 시료에 부유물, 모래 및 기타 물질이 다량 포함되어 있는 경우, 15분 동안 침전시킨 후 물을 새 용기로 옮깁니다. 유기 응집을 통한 바이러스 농축.

낮거나 중간 정도의 오염도를 가진 수질 샘플에서 바이러스를 검출하려면, 최소 수 리터의 물에 포함된 바이러스를 훨씬 더 작은 부피로 농축해야 합니다. 농축 과정에는 10L 수질 샘플의 산성화, 탈지분유를 이용한 응집, 응집물의 중력 침강, 그리고 10mL 인산 완충액에 침전물을 수집하는 단계가 포함됩니다. 이 과정을 시작하기 위해, 인공 해수에 탈지분유를 녹인 용액을 준비하며, 이를 위해 탈지분유 분말 10g을 인공 해수 1L에 용해시킨 후 염산을 사용하여 pH를 3.5로 정밀하게 조정합니다. 그러면 응집물이 육안으로 확인되어야 합니다.

용액은 사용 직전에 준비하거나 4°C에서 24시간 동안 보관하십시오. 수질 시료를 교반하고 시료의 전도도를 측정합니다. 전도도가 1.5 millisiemens 미만이면 해염을 첨가합니다.

염산을 첨가하여 수질 시료의 pH를 3.5로 조정합니다. 전처리 전후의 시료 pH와 사용된 염산의 부피를 기록하십시오. 전기전도도 또한 함께 기록해야 합니다.

pH를 조절한 후, 10 L의 물 시료에 1% 탈지분유 100 mL를 첨가하고 8~10시간 동안 교반하여 바이러스가 플록(flock)에 흡착되도록 합니다. 공정 제어용으로 사용되는 스파이크 시료의 경우, 대조군 바이러스의 표준 부피(예: 1 mL)를 시료에 첨가합니다. 교반을 중단하고 8~10시간 동안 중력에 의해 플록이 침전되도록 둡니다.

보통 다음 날인 16시간 후에 침전물을 수집할 수 있습니다. 이를 위해 연동 펌프를 사용하여 상층액을 제거하십시오. 플록(flocks)이 포함된 침전물 약 500 milliliters를 원심분리 병에 수집하십시오.

pH 3.5의 탈지분유 희석액을 추가하여 튜브의 무게 균형을 맞춘 후, 고속 원심분리기를 사용하여 4°C에서 8,000 Gs로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 멈추자마자 원심분리 튜브를 주의해서 꺼냅니다. 상층액을 매우 조심스럽게 따라내어 버립니다.

각 원심분리 병의 펠렛을 최종 부피 10 milliliter의 인산염 완충액에 녹여 바이러스의 핵산 추출 및 정량을 수행합니다. 바이러스 농축액은 바이러스 핵산 추출에 사용되며, 대상이 되는 특정 아데노바이러스 및 폴리오마바이러스는 A-Q-P-C-R로 정량합니다. key amp viral RNA mini kit를 사용하여 핵산 추출을 수행합니다.

140 µL의 바이러스 농축액에 포함된 바이러스의 용해는 수동으로 수행하며, 총 핵산을 80 µL로 추출합니다. 이 키트는 Key cube와 같은 자동화 플랫폼에서의 사용이 가능합니다.

다음 단계는 바이러스 게놈의 정량 분석입니다. TaqMan 프로브를 이용한 정량 PCR을 통해 샘플 내 복제 수를 측정하며, 인간 아데노바이러스, JC 폴리오마 바이러스 및 소 폴리오마 바이러스는 동일한 96-웰 플레이트에서 정량할 수 있습니다. 모든 바이러스가 동일한 증폭 사이클을 사용하므로, 표적 바이러스의 정량을 위해 돼지 아데노바이러스는 별도의 독립된 플레이트에서 테스트해야 합니다.

깨끗하게 분리된 구역에서 quantitative PCR 믹스를 준비하십시오. 믹스 준비가 완료되면 대조군을 포함하여 각 웰에 15 µL씩 분주하십시오. 별도의 구역에서 샘플에서 추출한 핵산을 10 µL씩 첨가하십시오. 각 샘플에 대해 직접 분석과 정제수에 10배 희석한 분석을 중복으로 수행하십시오. 타겟 첨가 후 반응 1회당 총 부피는 믹스 15 µL와 샘플 또는 표준물질 10 µL를 합쳐 25 µL가 됩니다. 샘플이 들어있는 웰을 접착식 커버의 일부로 덮으십시오.

커버의 나머지 부분은 다음 단계를 위해 남겨두십시오. DNA 표준 현탁액의 희석 과정입니다. 10 µL의 10¹부터 10⁶ genome copies까지를 3반복으로 분주하며, 표준 DNA 커버 전용 마이크로피펫을 사용하여 분주하십시오.

접착식 커버를 미리 절개한 표준물질 포함 웰들의 모습입니다. 이 그림은 96웰 플레이트 내의 표준물질 현탁액 샘플 및 대조군의 배치를 보여줍니다.

적절한 시스템에서 QPCR을 수행하며, amplitude gold를 10분 동안 활성화한 후 적절한 파라미터를 선택하십시오. 반응이 완료되면 95°C에서 40 사이클의 증폭을 수행합니다. 데이터와 결과는 사용한 장비의 사용자 매뉴얼에 설명된 대로 저장하십시오.

DNA 양은 필요한 경우 희석 배수를 보정한 후 얻은 데이터의 중앙값으로 정의합니다. 돼지 아데노바이러스(porcine adenoviruses) 정량화를 위해 얻은 증폭 플롯과 표준 곡선은 0.999의 상관 계수를 나타냈습니다. 해당 절차에 따른 허용 가능한 기울기 값의 범위는 -3.1에서 -3.6 사이입니다.

오염원을 정의하기 위해 질산염 수치가 높은 지역의 지하수 샘플에서 기재된 인간 및 동물 바이러스를 테스트하였습니다. 분석된 4회의 반복 실험 결과, porcine adenovirus의 평균값이 L당 10⁻² 유전체 복제본 기준 7.74로 양성 반응을 보였으며, 이는 샘플링 지점 주변 지역의 돼지 슬러리 존재와 관련이 있으며 지하수에 돼지 분변 오염이 존재함을 입증합니다. 테스트한 어떤 샘플에서도 인간에 의한 오염은 나타나지 않았습니다.

바이러스학적 데이터는 nested PCR 및 시퀀싱 분석을 통해 확인되었습니다.결론. 본 연구에서 우리는 지하수 시료를 분석한 결과를 제시하였으며, 인간 또는 소의 오염이 없는 상태에서 돼지 유래의 오염이 있음을 나타냈습니다. 또한 이 절차는 해수욕장 물, 바닷물 및 강물 분석에도 적용되었습니다.

본 논문에서는 이러한 도구들을 지하수의 오염원 식별에 적용하는 절차를 제시하며, 환경 내 오염원을 탐지하기 위한 개발된 방법들의 적용 가능성 사례로 고농도의 질산염이 검출된 사례를 소개합니다.