PMN에 대한 박테리아 세포외 단백질 매개 세포 독성에 대한 분석

단량체 S 및 F 성분을 포함하는 로이코시딘(기공 형성 독소)을 분비하는 병원성 박테리아인 황색포도상구균 배양을 예로 들어 보겠습니다.

세포를 펠릿화하고 상청액을 연속적으로 희석합니다. 류코시딘 함유 상청액을 다형핵 백혈구 또는 PMN이 있는 마이크로플레이트로 옮기고 배양합니다.

S 성분은 PMN의 특정 막관통 수용체에 결합한 후 F 성분과 헤테로올리고머화하여 세포막에 삽입되어 기공을 형성합니다.

기공은 세포내 칼륨 이온의 감소를 일으켜 NLR 계열 피린 도메인 함유 3 또는 NLRP3 단백질을 활성화합니다.

NLRP3는 프로-카스파제-1을 모집하여 인플라마좀을 형성하는 카스파제 모집 도메인 또는 ASC를 포함하는 세포사멸 관련 반점 유사 단백질에 결합합니다.

자동 단백질 분해는 프로-카스파제-1을 활성 카스파제-1로 전환하여 세포 사멸을 유발합니다.

정의된 간격으로 셀을 수집합니다. 손상된 막을 통해 죽은 세포에 들어가 DNA에 결합하여 형광을 방출하는 요오드화 프로피듐 또는 PI를 추가합니다.

유세포 분석을 사용하여 PI 염색 세포를 정량화하여 류코시딘 농도와 배양 시간 모두의 세포독성 효과를 평가합니다.

S. aureus를 실험 전날 섭씨 37도로 설정된 진동 인큐베이터를 사용하여 적절한 배지에서 밤새 배양합니다. S. aureus는 신선한 배지로 하룻밤 박테리아 배양을 1 내지 100 희석하여 계대배양합니다. 박테리아가 초기 정지 성장 단계에 도달할 때까지 흔들면서 섭씨 37도에서 배양합니다. 5시간 동안 성장한 후, 계代배양 S. aureus 1 밀리리터를 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 5000g에서 원심분리합니다.

원심분리 후 상청액을 흡인합니다. 흡인된 상청액을 0.22미크론 주사기 필터를 통해 새로운 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 통과시키고 얼음 위에 놓습니다. 황색포도상구균 배양에 사용되는 얼음처럼 차가운 배지로 상청액을 연속적으로 희석합니다. 앞서 설명한 대로 PMN과 얼음이 포함된 96웰 플레이트의 개별 웰에 음성 및 양성 대조군을 위한 상청액 샘플 또는 배지 단독을 부드럽게 추가합니다.

상청액과 우물을 분배시키기 위해 플레이트를 부드럽게 흔들고 섭씨 37도에서 배양합니다. 원하는 시간에 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 얼음 위에 놓습니다. 1마이크로리터의 요오드화 프로피듐을 함유한 얼음처럼 차가운 DPBS 300마이크로리터를 각 유세포 분석 튜브에 추가합니다. 샘플을 얼음 위의 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 양성 대조군 웰의 경우, 유세포 분석 튜브로 옮기기 전에 샘플에 20마이크로리터의 10% Triton X를 추가합니다. 유세포 분석을 사용하여 중독된 PMN의 요오드화 프로피듐 염색을 분석합니다.