복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아^{2 +}의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

이러한 방법은 면역 세포 활성화 및 매개체 방출에 중요한 이온 채널과 같은 흥분성 세포에 대한 세포 내 신호 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 상대적인 단순성과 많은 수의 세포를 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 비만 세포에서 Fura-2 칼슘 이미징을 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 Kathrin Ohlenschlager가 시연할 것입니다.

이 절차를 시작하려면 안락사된 쥐에 70% 에탄올을 뿌리고 핀을 사용하여 등쪽이 아래를 향하도록 폼 블록에 고정합니다. 뭉툭한 가위를 사용하여 마우스의 복부 위의 피부를 제거하고 복막강이 손상되지 않도록 합니다. 다음으로, 27 게이지 바늘을 복막에 조심스럽게 삽입하여 7ml의 얼음처럼 차가운 RPMI 배지를 복막강에 주입합니다.

어떤 장기도 천공하지 말고 부고환 지방 부위의 반점을 사용하여 장기 천공의 위험을 줄이십시오. 주사 후 마우스를 1분 동안 흔들어 복막 세포를 RMPI 배지로 분리합니다. 내부 장기가 손상되고 복막강이 혈액으로 오염되는 것을 방지하기 위해 마우스를 너무 세게 흔들지 마십시오.

그런 다음 새로운 20게이지 캐뉼라를 장착하여 주사기를 재사용하십시오. 폼 블록을 기울이고 벤치를 부드럽게 두드려 내부 장기를 한쪽으로 이동하여 다른 쪽에서 중간 흡인을 더 쉽게 할 수 있습니다. 그런 다음 20게이지 바늘을 베벨업으로 삽입하여 복부에서 나오는 액체를 부드럽고 천천히 흡인하여 내부 장기가 막히지 않도록 합니다.

가능한 한 많은 액체를 모으십시오. 그런 다음 주사기에서 바늘을 제거하고 수집된 세포 현탁액을 얼음 위의 수집 튜브에 옮깁니다. 샘플 폐기amp혈액 오염이 보이는 경우 튜브.

클린 셀 현탁액으로 300g에서 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 멸균 후드 아래에서 상층액을 흡인합니다. 샘플 펠릿을 차가운 PMC 배지에 다시 현탁시키고 세포 현탁액을 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.

그런 다음 성장 인자 IL-3 및 SCF를 각각 밀리리터당 10나노그램 및 밀리리터당 30나노그램의 최종 농도에 추가합니다. 다음 절차까지 섭씨 37도에서 약 48시간 동안 세포를 배양합니다. 12일에서 15일까지, 형질(plasmalemmal) IgE 수용체의 자극을 이용한 실험이 계획되어 있는 경우, 표준 배양 배지에서 IgE 항-DNP 밀리리터당 300나노그램으로 세포를 하룻밤 동안 전처리한다.

Fura-2 이미징을 준비하기 위해 Fura-2, AM 원액을 칼슘 HBSS의 최종 농도인 5마이크로몰로 희석하여 로딩 버퍼를 준비합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 로딩 버퍼를 500마이크로리터의 PMC 셀 현탁액과 혼합합니다. 혼합물을 이미징 챔버에 피펫팅하고 어두운 곳에서 실온에서 20-30분 동안 세포를 배양합니다.

자극 프로토콜에 따라 다양한 솔루션으로 gravity-fed application system을 설정합니다. 다음으로, 도립 현미경의 스테이지에 애플리케이션 시스템을 장착합니다. 40X 고구경 오일 이멀젼 대물렌즈에 이멀젼 오일을 한 방울 떨어뜨려 준비합니다.

로드된 셀이 있는 이미징 챔버를 애플리케이션 시스템에 배치하고 녹화 중 움직임을 방지하기 위해 고정합니다. 그런 다음 투과광을 켜고 세포에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 생리학적 획득 모드에서 이미징 획득 프로그램을 시작합니다.

설정 창을 열고 초점과 최적의 획득 시간을 조정합니다. 참조 그림을 이미지화하고 셀을 ROI로 표시합니다. 셀이 없는 영역에 마지막 ROI를 표시하고 배경으로 정의합니다.

그런 다음 설정을 완료하고 5초 수집 속도로 측정을 시작합니다. 다음으로, 실험 설계에 따라 적절한 주기 번호에서 솔루션을 추가합니다. 항원에 의한 세포 내 칼슘 농도 상승을 측정하려면 주기 20 후에 주사기-2 용액을 적용하고 주기 150 후에 기록을 중지합니다.

화합물 48/80에 의한 세포 내 칼슘 농도 상승을 측정하려면 주기 20 후에 주사기-3 용액을 적용하고 주기 150 후에 기록을 중지합니다. SOCE에 의해 유발된 세포 내 칼슘 농도의 상승을 측정하려면 주기 10 후에 주사기-4 용액을 적용하고, 주기 70 후에 주사기-5 용액을 적용하고, 주기 120 후에 주사기-4 용액을 적용하고, 주기 150 후에 주사기-1 용액을 적용하고, 주기 220 후에 기록을 중지합니다. 수집 프로그램에서 Start Cutter, Mark All, Convert All, Physiology Measurements, OK, OK 버튼을 연속적으로 누른 다음 다시 OK를 누릅니다.

오프라인 분석을 위해 파일을 테이블과 이미지 스택으로 저장합니다. 베타-헥소사미니다아제 방출을 측정하려면 웰당 100마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 V-바닥 웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 25마이크로리터의 자극 또는 제어 용액을 추가합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 45분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 얼음 위에 5분 동안 올려 반응을 멈춥니다. 그런 다음 접시를 섭씨 4도에서 120g으로 4분 동안 원심분리합니다.

120마이크로리터의 상등액을 바닥이 평평한 96웰 플레이트에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 세포 펠릿을 만지지 않도록 주의하되 상층액을 완전히 흡인하십시오. 다음으로, 125마이크로리터의 용해 완충액을 세포 펠릿에 추가합니다.

세포 펠릿을 실온에서 5분 동안 배양하고 배양 후 반복적인 피펫팅으로 다시 현탁시킵니다. 25마이크로리터의 4밀리몰 pNAG 용액을 새로운 평평한 바닥 96웰 플레이트의 필요한 웰에 피펫팅합니다. 준비된 pNAG 용액에 각 상등액 25마이크로리터와 각 세포 용해물 25마이크로리터를 별도로 추가합니다.

반응 배치를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 반응을 중지시키기 위해 각 웰에 150 마이크로리터의 정지 용액을 피펫팅한다. 다음으로, 자동 배경 빼기를 위해 405나노미터의 마이크로 플레이트 리더와 참조 630나노미터로 플레이트 샘플 광 흡광도를 분석합니다.

획득 프로그램에서 참조 상자를 선택하고 흡광도 프로그램 요소 메뉴에서 자동 배경 빼기를 위해 630나노미터를 선택합니다. 베타-헥소사미니다아제 방출 분석은 형질(plasmalemmal) IgE 고친화성 수용체의 가교결합 또는 Mrg PRB2 수용체의 자극 시 탈과립화를 겪는 분리된 PMC의 능력을 테스트하기 위해 수행되었습니다. 세포를 V-bottom 96-well plate에 첨가하고 이 계획에 따라 섭씨 37도에서 45분 동안 자극했습니다.

원심분리 및 상등액 제거 후, 펠릿을 용해 시켰다. 그런 다음 개별 상등액 및 펠릿 용해물의 베타-헥소사미니다아제 함량을 섭씨 37도에서 1시간 배양 중 pNAG와의 반응으로 분석했습니다. 반응 생성물의 양을 비색으로 검출하고 방출된 베타-헥소사미니다아제의 비율을 계산했습니다.

자연 방출은 매우 낮았지만, 10마이크로몰 이오노마이신 및 밀리리터당 50마이크로그램의 화합물 48/80과 같은 강력한 탈과립 자극에 대한 반응은 각각 40%와 60% 이상이었습니다. DNP 자극에 대한 탈과립 반응은 밀리리터당 10 - 300 밀리그램의 농도 범위에서 용량에 따라 달랐습니다. 이러한 데이터는 함께 분리된 PMC의 양호한 기능 상태를 명확하게 나타냅니다.

이 기술을 사용하면 2주 이내에 복막에서 유래한 고순도의 쥐 성숙 결합 조직 비만 세포를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 박테리아 오염을 방지하기 위해 세포 분리 및 배양 중에 멸균 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 비만 세포의 칼슘 진입 경로와 관련된 추가 질문에 답하기 위해 전기생리학적 패치-클램프 이온 전류 측정과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 Fura-2 세포 내 칼슘 이미징 기술은 질량 세포 생리학 분야의 연구자들이 비만 세포 탈과립화의 칼슘 의존성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 비만 세포를 사용하여 Fura-2 칼슘 이미징 실험 및 베타-헥소사미니다아제 탈과립 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자외선으로 작업하는 것은 눈과 피부에 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 불필요한 노출을 피해야 한다는 것을 잊지 마십시오.