Name: 복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 생쥐 복막 비만세포 격리 및 배양 프로토콜과 Fura-2 칼슘 이미징, 베타-헥소사미니다당 분석을 통한 기능 특성화 방법. 이 기술은 면역세포 활성화 및 신호전달 연구에 활용됩니다.

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저자 돛대 세포 준비와 재배 기술 지원에 대 한 줄리아 Geminn를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 Transregional 공동 연구 센터 (TR-SFB) 152에 의해 지원 되었다.

모든 동물 절차 관리 및 실험실 동물 (카를스루에 지역 위원회에 의해 승인)의 사용에 대 한 독일 입법 지침에 따라 수행 했다.
1. PMC 고립과 재배 복 게에 의해
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>얼음</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>10 mL 주사기</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>27 G 바늘</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20 G 바늘</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>스티로폼 블록 및 핀</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>컬렉션 튜브 (50ml 플라스틱 원심 관)</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>70% 에탄올</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>RPMI 매체 (냉장 하 고 얼음에 보관 중)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol><li><ol><li></li><li> </li><li><li><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li><ol><li></li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></ol></li></ol></li></ol><ol><li></li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li><ol><li></li><li></li><li> </li><li></li><li></li><li><li></li><li><li><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li><li><ol><li></li><li></li><li></li></ol></li><li></ol></li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> </li><li></li><li><li><li><li><li></li><li></li><li></li><li><li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57222/57222eq1.jpg"> </li></ol>

<ol><li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+mast+cells%3A+negative%2C+as+well+as+positive%2C+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li>
<li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li>
<li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li>
<li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7508174">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li>
<li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+%22tunable%22+effector+and+immunoregulatory+cells%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li>
<li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+Ca%282%2B%29+signaling+in+mast+cells%3A+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li>
<li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li>
<li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150(2014).</li>
<li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-specific+Cre%2FloxP-mediated+recombination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li>
<li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+cell-derived+mast+cells%3A+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3838314">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li>
<li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li>
<li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li>
<li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H%281%29-antihistamines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li>
<li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li>
<li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366(2017).</li>
<li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li>
<li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li>
<li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2531691">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li>
<li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+mediators%3A+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

MC 모델 MC degranulation, chemotaxis, 접착, 또한 세포내 신호 변환 통로 MC 활성화에 명료로 공부를 성공적으로 사용할 수 있습니다. 일부 연구 자들은 불멸 하 게 선 (LAD2 HMC1) 등 인간의 MCs 사용 인간의 MCs 모델, 코드에서 파생 된 조상 세포 (CD133 +)와 주변 혈액 조상 세포 (CD34 +) 혈액. 다른 선호 하는 설치류와 같은 불후의 명작 MC 모델 (쥐 basophilic 백혈병 RBL-2 H 3 MC 선) 또는 기본 교양 (마우스 뼈 골 수 유래 MCs BMMCs, PMCs) 모델. 수많은 "녹아웃" 마우스 모델, 특정 유전자와 인코딩된 단백질의 생리 기능 탐험에 골드 표준 접근에에서 엠씨 기능 분석 murine 기본 MCs는 사용할 수 있습니다. 충분 한 선택도 및 힘을 위한 약리 도구의 적자 MC 활성화18여 신호 변환의 메커니즘의 조사를 위해 특히 귀중 한이 방법을 만듭니다. 성숙한 형태 및 높은 세분성을 전시 하는 결합 ...

MCs 타고 난과 획득 면역 반응 동안에 저명한 역할을 한다. 특히, MCs 병원 균, 기생충, 박테리아 등의 살해에 참여 하 고 또한 잠재적으로 유독한 내 인 성 펩 티 드 또는 구성 요소 (검토 Galli 외. 20081참조)에 대 한 venoms의 저하. 타고 난 및 적응형 면역에 MCs의 생리 적 역할 열띤된 논쟁의 주제 이다. 따라서, 다른 MC 불충분 한 마우스 모델을 사용 하 여 수행 하는 연구에서 수많은 데이터 불일치 알레르기2넘어 MCs의 면역 기능의 체계적인 재평가 필요 합니다. 성숙한 MCs 조직 및 피부, 폐, 창 자, 등 장기에 지역화 주로 고 있다 일반적으로 혈액에 작은 숫자에만. MCs MC 창시자, 등 조 혈 선구자에서 파생 하 고 그들의 차별화 및 거의 모든 vascularized 조직1는 microenvironments에서 성숙. 선택적으로 T-세포 파생 요소 인터 루 킨 (IL)-3에 그들의 조 혈 창시자3에서 생존, 확산, 그리고 마우스 MCs의 만능 인구의 승진 시킨다. 줄기 세포 요소 (SCF) 구조 세포 조직에 의해 생산 되 고 MC 개발, 생존, 마이그레이션, 및 기능4에서 중요 한 역할. 개별 MCs의 속성은 그들의 능력을 합성 하 고 다양 한 프로 테아 제 또는 proteoglycans 저장에 따라 달라질 수 있습니다. 마우스에 소위 결합 조직 형 MCs는 그들의 해부학 지역화, 형태학, 헤 파 린 및 프로 테아 제5의 내용에 따라 점 막 MCs에서 구별 된다.
MCs의 증가 무료 cytosolic 캘리포니아2 + ([캘리포니아2 +]난)은 필수 degranulation 및 eicosanoids의 생산을 위한 뿐만 아니라 cytokines의 합성과 항 원에 대 한 응답에서 녹음 방송 요인의 활성화 및 다양 한 secretagogues6. 이러한 자극의 주요 다운스트림 목표 hydrolyzes diacylglycerol (DAG) 및 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate phospholipase C, 이다. DAG는 단백질 키 니 아 제 C를 활성화 하 고 IP3 바인딩과 그물에서 캘리포니아2 + 이온을 출시 하였습니다. 이러한 저장소의 고갈 캘리포니아2 + 원형질 막 캘리포니아2 + 채널, 저장 운영된 칼슘 항목 (SOCE)로 이어지는 통해 유입을 활성화 합니다. 이 과정은 캘리포니아2 +의 상호 작용을 통해 되 살려-센서, stromal 상호 작용 분자-1 (Stim1), Orai17 뿐만 아니라 일시적인 수용 체 잠재력 정식 (TRPC) 채널의 활성화를 통해 떠다니고 그물에 (자세한 리뷰 참조 Freichel 그 외 여러분 단백질 20148) 원형질 막에.
공부 하는 여러 약물이 채널의 생리 적인 역할 (채널 차단제의 응용 프로그램) 또는 유전 접근 일반적으로 사용 됩니다. 후자의 경우, 단백질 발현의 억제 mRNA (최저)를 대상으로 하 여 이루어집니다 또는 genomic DNA 코딩 기 공 채널 (녹아웃)의 소 단위를 형성 하는 exon의 전역 또는 조직 관련9 삭제 편집. 이 채널에 대 한 충분 한 특이성으로 차단기의 가용성은 제한 됩니다. 또한, 최저 접근 필요, 예를 사용 하 여 그 유효성의 주의 제어., 서쪽 오 점 분석, 그리고 많은 경우에 대상된 채널 단백질을 위한 특정 항 체의 불가능에 의해 방해 된다. 따라서, 녹아웃 마우스 모델의 사용은 여전히 이러한 분석에 대 한 황금 표준으로 간주 됩니다. 엠씨 기능 조사에 대 한 선호 체 외에 모델은 격리 된 비보 전 완전히 성숙한 인구로 서 수 있는 PMCs의 재배 (에서 예를 들어 생체 외에서 MCs 차별 반대., 골 수 세포)10 . 골 수 파생 된 MCs (BMMCs), 또한 일반적으로 엠씨 기능에서 생체 외에서FcεRI와 베타-hexosaminidase 자극을 공부 하는 데 사용 되는 비교 릴리스는 8-fold 고 약에 증가 PMCs, 각각. 이 문서에서는, 우리 격리 하는 방법 및 재배 murine PMCs의 2 주 높은 수가 순수 결합 조직 배양의 MCs, 추가 분석에 대 한 충분 한 입력을 얻을 수 있는 설명 합니다.
개발 및 인코딩된 유전자 칼슘 표시기의 응용 프로그램에서 최근 진행에도 불구 하 고 그들의 사용은 여전히 제한 대상 세포에 유전자의 납품에 어려움에 의해 특히, 기본 교양된 MCs 같은 고도로 전문화 된 세포에서. 또한, 형광 지표 측정을 위해 [캘리포니아2 +]나 의이 그룹은 아직 높은 동적 범위와 비율 염료가 없다. 이러한 이유로, 비율 [캘리포니아2 +]나 측정에 대 한 선호 하는 방법 아직도 형광 염료 "Fura-2"11의 사용 이다.
현재, 가장 일반적으로 사용 되는 접근 MC 활성화의 평가 degranulation β-hexosaminidase 활동의 측정 이다. Β-hexosaminidase, 알레르기 중재자, MCs12에서 일정 비율에 히 스타 민을 공동 출시는 MC과 립 구성 요소 중 하나입니다. Β-hexosaminidase 쉽게 그리고 정확 하 게 측정할 수 microplate 색도계 분석 실험에서 쉽게 감지 colorigenic 제품의 측정 수량을 생산 하는 특정 기질과의 반응을 통해. 이 문서에서는, PMCs degranulation 다양 한 자극에 대 한 응답에서의 분석에 대 한이 기술의 응용 프로그램이 보고 됩니다.
높은 선호도 plasmalemmal IgE 수용 체 (FcɛRI)의 집계 MCs에 주변 세포 외 공간에 분 비과 립 콘텐츠 출시로 이어지는 다양 한 세포내 신호 전달 경로 활성화 합니다. 특정 항 원 뿐만 아니라 다른 많은 자극 immunomodulatory 중재자, 보완 anaphylatoxins 등의 다양 한 배열을 풀어 MCs를 활성화할 수 있습니다 (예., C3a와 C5a)13, vasoconstrictor 펩 티 드 endothelin 1 (ET1)14 , 잘 수많은 양이온 물질 및 pseudoallergic 반응을 자극 하는 약물 (예., icatibant) MRGPRX216에 바인딩하여15 . MRGPR 유도 MCs degranulation에 관련 된 세포내 신호 통로 저조한 FcɛRI 중재 세포내 신호; 비교 특징 이러한 경로 단지 수용 체 식별16후17 지난 몇 년 동안 집중적으로 공부를 시작 했다. 크게, 원형질 막 이온 채널 칼슘 항목 뒤에 MRGPRX2 자극에에서 관련 된 이해 남아 있다. 따라서, 현재 문서는 또한 세포내 칼슘 신호에 초점을 맞추고 및 MCs의 degranulation MRGPR 촉진제와 자극.

<table><tbody><tr><td>RPMI 미디엄</td><td>써모 사이언티픽</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>시그마-알드리치</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>써모 사이언티픽</td><td>R92157</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R& D 시스템</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>PMC2115</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2272</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>안티-DNP-항체&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8406</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>화합물 48/80&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2313</td><td></td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-&beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9376</td><td></td></tr><tr><td>CoverWell 이미징 챔버</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL635051</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plate, V-shaped bottom&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>96-Well 플레이트, 평평한 바닥</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter 플레이트 리더 "i-control" 소프트웨어&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Nano Quant, 인피니트 M200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>플랫 바닥 플레이트&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 플라스틱 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>문화 플라스크 (25 cm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>69160</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 안경 라운드; &oslash; 25 mm; No. 1</td><td>Menzel</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>반전 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td><td>Zeiss</td><td>440260-9900</td><td></td></tr><tr><td>HC 필터 세트 Fura 2&nbsp;</td><td>AHF</td><td>H76-521</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>단색 광원</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr><tr><td>이미징 획득 프로그램</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision 4.8.2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>중력 공급 용액 응용 시스템</td><td>맞춤형</td><td>4채널</td><td></td></tr><tr><td>15mL 플라스틱 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>벤치 원심분리기</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R</td><td></td></tr></tbody></table>

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 degranulation 분석 실험

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

돛대 세포 (MCs), 면역 체계의 일환으로 여러 병원 균에 대 한 호스트를 방어 하 고 알레르기 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생 합니다. IgE 바인딩된 높은 선호도 IgE 수용 체 (FcεRI), 뿐만 아니라 다른 여러 가지 수용 체의 자극 표면의 cross-linking를 통해 MCs의 활성화 시작 무료 세포내 캘리포니아2 + 레벨의 상승 ([캘리포니아2 +]난) 그는 염증 및 알레르기 중재자의 출시를 촉진합니다. 분자 성분이 신호 경로에 관련 된 식별은 엠씨 기능의 규칙을 이해 하는 데 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 murine 결합 조직 유형 복 막 게 하 여 MCs의 고립과 복 MCs (PMCs)의 재배에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법론에 의해 다양 한 녹아웃 마우스 모델에서 MCs의 문화 MC 신호 경로에 관련 된 단백질의 식별에 유용한 접근 방식을 나타냅니다. 또한, 우리 또한 단일 셀 Fura-2는 신뢰할 수 있는 Ca2 + MCs. 형광 기반 모니터링 [캘리포니아2 +]내가 신호의 정량화에 대 한 중요 한 기술으로 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 일반적으로 사용 하는 접근 캘리포니아2 + 신호 이벤트, MC 활성화에 대 한 최대 중요성 이다 칼슘 저장소 운영 항목을 포함 하 여 공부 합니다. MC degranulation의 분석에 대 한 β-hexosaminidase 자료 분석 결과 설명합니다. 모든 3 개의 다른 분 비 하위 집합에 대해 MCs. β-hexosaminidase에서 설명한 degranulation 마커 colorigenic 기판에와 그것의 반응에 의해 쉽게 정해질 수 β-hexosaminidase 문화 매체에 발표의 양을 간주 됩니다 한 결정 플레이트 색도계 분석 이 높은 재현 기술은 비용 효율적인 고 특수 장비를 요구 한다. 전반적으로, 제공 된 프로토콜 높은 수확량을 보여줍니다 일반적인 MC 표면 마커를 표현 하는 MCs의 MCs의 일반적인 형태학 및 phenotypic 기능을 표시 하 고 캘리포니아2 +-secretagogues에 대 한 높은 재현성 응답 시연 이미징 및 degranulation 분석 실험입니다.

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여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

이러한 방법은 면역 세포 활성화 및 매개체 방출에 중요한 이온 채널과 같은 흥분성 세포에 대한 세포 내 신호 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 상대적인 단순성과 많은 수의 세포를 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 비만 세포에서 Fura-2 칼슘 이미징을 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 Kathrin Ohlenschlager가 시연할 것입니다.이 절차를 시작하려면 안락사된 쥐에 70% 에탄올을 뿌리고 핀을 사용하여 등쪽이 아래를 향하도록 폼 블록에 고정합니다. 뭉툭한 가위를 사용하여 마우스의 복부 위의 피부를 제거하고 복막강이 손상되지 않도록 합니다. 다음으로, 27 게이지 바늘을 복막에 조심스럽게 삽입하여 7ml의 얼음처럼 차가운 RPMI 배지를 복막강에 주입합니다.어떤 장기도 천공하지 말고 부고환 지방 부위의 반점을 사용하여 장기 천공의 위험을 줄이십시오. 주사 후 마우스를 1분 동안 흔들어 복막 세포를 RMPI 배지로 분리합니다. 내부 장기가 손상되고 복막강이 혈액으로 오염되는 것을 방지하기 위해 마우스를 너무 세게 흔들지 마십시오.그런 다음 새로운 20게이지 캐뉼라를 장착하여 주사기를 재사용하십시오. 폼 블록을 기울이고 벤치를 부드럽게 두드려 내부 장기를 한쪽으로 이동하여 다른 쪽에서 중간 흡인을 더 쉽게 할 수 있습니다. 그런 다음 20게이지 바늘을 베벨업으로 삽입하여 복부에서 나오는 액체를 부드럽고 천천히 흡인하여 내부 장기가 막히지 않도록 합니다.가능한 한 많은 액체를 모으십시오. 그런 다음 주사기에서 바늘을 제거하고 수집된 세포 현탁액을 얼음 위의 수집 튜브에 옮깁니다. 샘플 폐기amp혈액 오염이 보이는 경우 튜브.클린 셀 현탁액으로 300g에서 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 멸균 후드 아래에서 상층액을 흡인합니다. 샘플 펠릿을 차가운 PMC 배지에 다시 현탁시키고 세포 현탁액을 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.그런 다음 성장 인자 IL-3 및 SCF를 각각 밀리리터당 10나노그램 및 밀리리터당 30나노그램의 최종 농도에 추가합니다. 다음 절차까지 섭씨 37도에서 약 48시간 동안 세포를 배양합니다. 12일에서 15일까지, 형질(plasmalemmal) IgE 수용체의 자극을 이용한 실험이 계획되어 있는 경우, 표준 배양 배지에서 IgE 항-DNP 밀리리터당 300나노그램으로 세포를 하룻밤 동안 전처리한다.Fura-2 이미징을 준비하기 위해 Fura-2, AM 원액을 칼슘 HBSS의 최종 농도인 5마이크로몰로 희석하여 로딩 버퍼를 준비합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 로딩 버퍼를 500마이크로리터의 PMC 셀 현탁액과 혼합합니다. 혼합물을 이미징 챔버에 피펫팅하고 어두운 곳에서 실온에서 20-30분 동안 세포를 배양합니다.자극 프로토콜에 따라 다양한 솔루션으로 gravity-fed application system을 설정합니다. 다음으로, 도립 현미경의 스테이지에 애플리케이션 시스템을 장착합니다. 40X 고구경 오일 이멀젼 대물렌즈에 이멀젼 오일을 한 방울 떨어뜨려 준비합니다.로드된 셀이 있는 이미징 챔버를 애플리케이션 시스템에 배치하고 녹화 중 움직임을 방지하기 위해 고정합니다. 그런 다음 투과광을 켜고 세포에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 생리학적 획득 모드에서 이미징 획득 프로그램을 시작합니다.설정 창을 열고 초점과 최적의 획득 시간을 조정합니다. 참조 그림을 이미지화하고 셀을 ROI로 표시합니다. 셀이 없는 영역에 마지막 ROI를 표시하고 배경으로 정의합니다.그런 다음 설정을 완료하고 5초 수집 속도로 측정을 시작합니다. 다음으로, 실험 설계에 따라 적절한 주기 번호에서 솔루션을 추가합니다. 항원에 의한 세포 내 칼슘 농도 상승을 측정하려면 주기 20 후에 주사기-2 용액을 적용하고 주기 150 후에 기록을 중지합니다.화합물 48/80에 의한 세포 내 칼슘 농도 상승을 측정하려면 주기 20 후에 주사기-3 용액을 적용하고 주기 150 후에 기록을 중지합니다. SOCE에 의해 유발된 세포 내 칼슘 농도의 상승을 측정하려면 주기 10 후에 주사기-4 용액을 적용하고, 주기 70 후에 주사기-5 용액을 적용하고, 주기 120 후에 주사기-4 용액을 적용하고, 주기 150 후에 주사기-1 용액을 적용하고, 주기 220 후에 기록을 중지합니다. 수집 프로그램에서 Start Cutter, Mark All, Convert All, Physiology Measurements, OK, OK 버튼을 연속적으로 누른 다음 다시 OK를 누릅니다.오프라인 분석을 위해 파일을 테이블과 이미지 스택으로 저장합니다. 베타-헥소사미니다아제 방출을 측정하려면 웰당 100마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 V-바닥 웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 25마이크로리터의 자극 또는 제어 용액을 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 45분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 얼음 위에 5분 동안 올려 반응을 멈춥니다. 그런 다음 접시를 섭씨 4도에서 120g으로 4분 동안 원심분리합니다.120마이크로리터의 상등액을 바닥이 평평한 96웰 플레이트에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 세포 펠릿을 만지지 않도록 주의하되 상층액을 완전히 흡인하십시오. 다음으로, 125마이크로리터의 용해 완충액을 세포 펠릿에 추가합니다.세포 펠릿을 실온에서 5분 동안 배양하고 배양 후 반복적인 피펫팅으로 다시 현탁시킵니다. 25마이크로리터의 4밀리몰 pNAG 용액을 새로운 평평한 바닥 96웰 플레이트의 필요한 웰에 피펫팅합니다. 준비된 pNAG 용액에 각 상등액 25마이크로리터와 각 세포 용해물 25마이크로리터를 별도로 추가합니다.반응 배치를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 반응을 중지시키기 위해 각 웰에 150 마이크로리터의 정지 용액을 피펫팅한다. 다음으로, 자동 배경 빼기를 위해 405나노미터의 마이크로 플레이트 리더와 참조 630나노미터로 플레이트 샘플 광 흡광도를 분석합니다.획득 프로그램에서 참조 상자를 선택하고 흡광도 프로그램 요소 메뉴에서 자동 배경 빼기를 위해 630나노미터를 선택합니다. 베타-헥소사미니다아제 방출 분석은 형질(plasmalemmal) IgE 고친화성 수용체의 가교결합 또는 Mrg PRB2 수용체의 자극 시 탈과립화를 겪는 분리된 PMC의 능력을 테스트하기 위해 수행되었습니다. 세포를 V-bottom 96-well plate에 첨가하고 이 계획에 따라 섭씨 37도에서 45분 동안 자극했습니다.원심분리 및 상등액 제거 후, 펠릿을 용해 시켰다. 그런 다음 개별 상등액 및 펠릿 용해물의 베타-헥소사미니다아제 함량을 섭씨 37도에서 1시간 배양 중 pNAG와의 반응으로 분석했습니다. 반응 생성물의 양을 비색으로 검출하고 방출된 베타-헥소사미니다아제의 비율을 계산했습니다.자연 방출은 매우 낮았지만, 10마이크로몰 이오노마이신 및 밀리리터당 50마이크로그램의 화합물 48/80과 같은 강력한 탈과립 자극에 대한 반응은 각각 40%와 60% 이상이었습니다. DNP 자극에 대한 탈과립 반응은 밀리리터당 10 - 300 밀리그램의 농도 범위에서 용량에 따라 달랐습니다. 이러한 데이터는 함께 분리된 PMC의 양호한 기능 상태를 명확하게 나타냅니다.이 기술을 사용하면 2주 이내에 복막에서 유래한 고순도의 쥐 성숙 결합 조직 비만 세포를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 박테리아 오염을 방지하기 위해 세포 분리 및 배양 중에 멸균 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 비만 세포의 칼슘 진입 경로와 관련된 추가 질문에 답하기 위해 전기생리학적 패치-클램프 이온 전류 측정과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 Fura-2 세포 내 칼슘 이미징 기술은 질량 세포 생리학 분야의 연구자들이 비만 세포 탈과립화의 칼슘 의존성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 비만 세포를 사용하여 Fura-2 칼슘 이미징 실험 및 베타-헥소사미니다아제 탈과립 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자외선으로 작업하는 것은 눈과 피부에 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 불필요한 노출을 피해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

isolation-peritoneum-derived-mast-cells-their-functional

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마음에서 기능적 면역 세포를 분리를위한이 방법은 이러한 세포의 감소 반응의 결과로, 원치 않는 면역 세포 활성화의 원인이 collagenase의 소화의 종래의 방법에 대한 대안을 제공합니다. 격리 우리의 방법은 효소 소화와 관련된 문제를 피함으로써 기능 심장병 면역 세포를 산출.

심장 기능 면역 세포의 분리

이 동영상은 비만 세포의 탈과립 활성을 결정하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 비만 세포에서 방출되는 효소는 기질을 가수분해하고 착색된 생성물을 생성합니다. 비만 세포의 탈과립 활성은 세포 내 총 효소 함량으로 정규화된 세포 외부의 효소 방출 비율로 측정되었습니다.

표적 화학물질의 영향을 연구하기 위한 비만 세포 탈과립 분석

이 비디오는 성체 마우스의 복막강에서 성숙한 결합 조직형 비만 세포를 분리하기 위한 복막 세척 방법을 보여줍니다. 복막강에서 1차 면역 세포의 혼합물을 분리한 후, 적절한 배양 조건에서 비만 세포의 선택적 증식을 수행합니다.

쥐 복막강에서 일차 비만 세포를 분리하는 기술

비만 세포의 탈과립, 알레르기 중재자의 릴리스는, 알레르기, 천식, 및 기생충 방어에 중요합니다. 여기에 우리가 탈과립에 대한 약물 및 독성 물질의 영향을 평가하기위한 방법 1을 보여, 방법론은 최근 항균제 트리클로산 2의 강력한 억제 효과를 나타낸다 활용.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

우리는 체외 유래 마스트 세포의 생성을 위한 방법, 유방 세포 결핍 마우스로그들의 이식, 및 다른 해부학 적인 사이트에 이식된 유방 세포의 표현형, 숫자 및 분포의 분석을 기술합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 마스트 세포의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

이 프로토콜의 목표는 콜라게나제를 사용하여 조직의 효소 소화에 의해 결장의 라미나 프로피리아에 있는 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 세포의 효율적인 분리를 허용하여 단일 세포 현탁액을 생성하여 강력한 면역 세포 증식에 사용할 수 있습니다.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

MRGPRX2 수용체를 통해 비만 세포를 활성화할 수 있는 짧은 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 기술이 기재되어 있다. 관련 기술은 쉽고 저렴하며 다른 세포 수용체로 확장 될 수 있습니다.

엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

배우세요 생쥐 복막 비만세포 격리 및 배양 프로토콜과 Fura-2 칼슘 이미징, 베타-헥소사미니다당 분석을 통한 기능 특성화 방법. 이 기술은 면역세포 활성화 및 신호전달 연구에 활용됩니다.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아^{2 +}의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

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