Name: 효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 학습하세요 ELISPOT 분석을 통해 특정 항원에 대한 T세포 면역 반응을 정량적으로 검출하는 방법을. 미생물 표적 식별과 적응 면역 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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연구 자원, 보건 국립 연구소를위한 국립 센터에서 밴더빌트 CTSA 부여 한 UL1 RR024975에 의해 부분적으로 지원. 이 작품은 NIH R01 HL 83839에 의해 투자되었다; R01 AI 65,744합니다.

다음과 같은 프로토콜을 위해, 우리는 관심의 세포로 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)를 사용합니다. 그러나,이 프로토콜은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다. 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 분석을 수행합니다. 1 일 : 플레이트와 셀의 준비 <ol><li> ELISPOT 플레이트를 타고 후드에서 엽니다. </li><li> 가능한 경우, 별도로 하나의 잘 pipetting가 수용되어 다채널 pipettor를 사용 1X PBS 150 μL와 접시에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 저수지의 패키지를 꺼내서 후드에서 엽니다. </li><li> 2 μg / ML 캡처 항체의 안티 - 인간 인터페론 - γ, 11 1X PBS의 MLS. 추가 잘 와동. 저수지에 항체 믹스를 전송합니다. </li><li> 각 잘 다중 채널을 사용에 코팅 용액 100 μL를 놓습니다. </li><li> parafilm의 접시를 넣어. </li><li> 하룻밤 냉장고에 접시를 놓습니다. 번호판 주간 좋다. 엄지의 규칙은 우물에 액체가 남아 아직도있다면 접시가 사용될 수있다는 것입니다. </li></ol> 셀 준비 PBMCs가 신선면 37 세포를 포함하고 밤새 품어 ° C를 5 % CO 2. PBMC에 대한 세포의 해동하는 것이 필요하다, 액체 질소에 저장됩니다. 다음과 같이 프로토콜은 다음과 같습니다 : <ol><li> 37 거의 완전히 해동 때까지 ° C의 물을 욕조에있는 세포의 cryovial을 해동. </li><li> 즉시 R10 미디어 5 ML에 resuspend. </li><li> 225 X G.에서 5 분 스핀 </li><li> R10 미디어 5 ML 다시 Resuspend와 trypan 파랑을 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> R10 미디어 2 X 10 6 세포 / ML에 집중을 가져와. </li><li> ° C와 5 % CO 2 37 하룻밤 휴식. </li></ol> 일 2 : 설정 - 업 플레이트 <ol><li> 표본 식별 번호, 잘 조건 및 날짜와 함께 레이블 플레이트 뚜껑. </li><li> 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 살균 1X PBS 150 μL와 접시 6 번 씻으십시오. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오. 이것은 접시의 우물은 보라색 회전시킬 수 있습니다. </li><li> 각 잘하는 R20 100 μL를 추가합니다. </li><li> 37 판 ° C 1 시간을 품어. </li><li> 접시 잠복기지만, 하룻밤 푹 있던 세포를 계산합니다. </li><li> 5 분 1,500 RPM의 세포 현탁액을 스핀. 뜨는을 가만히 따르다하고 R10 미디어 1mL 당 1X10 6 세포의 최종 농도가되도록 펠렛을 resuspend. </li><li> 1 시간 부화 후, 제거 R20 덤프 및 얼룩 방법을 사용합니다. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오. </li><li> 각 잘하는 세포 솔루션을 100 μL를 (10 5 셀)을 추가합니다. 중복의 해당 우물에 적절한 펩티드 및 / 또는 항원을 추가합니다. 새로운 피펫 팁 당신이 펩타이드 작업 솔루션에 갈 때마다 사용하십시오. 일반 펩타이드 농도는 10-40 μg / ML입니다. 펩티드가 다르므로, 각 수사관이 최적의 결과를 얻을 펩티드를 적정하다해야합니다. </li><li> 부정적인 제어 우물에서 유일한 세포를 (없음 펩티드) 추가 </li><li> 긍정적인 제어 우물에서 phytohemagglutinin을 (; 10 μg / ML, 시그마 PHA)을 추가합니다. </li><li> 37 밤새 품어 ° C 5 % CO 2와 (과 ~ 18 시간). </li></ol> 3 일 : 플레이트 개발 <ol><li> 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 150 μL 1xPBS와 접시 6 번 씻으십시오. </li><li> 멀티채널 pipettor를 사용하여 판의 각 잘 ~ 100 μL PBS를 추가합니다. </li><li> 15 분 냉장고에 접시를 넣어. </li><li> 냉장고에서 꺼내 접시를 타고 조직 문화 후드에 놓으십시오. </li><li> 비오틴 항체 솔루션을 준비 <ul><li> 11mL PBS에 0.​​5 μg / 비오틴 항체의 ML을 (mAB 7 B6 - 1) 추가합니다. </li><li> 잘 섞어 소용돌이 솔루션입니다. </li><li> 다채널을 사용하여 솔루션을 추가할 계획하면 저수지에 잔. </li></ul></li><li> 휴지통으로 그것을 flicking하여 PBS를 폐기하십시오. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오. </li><li> 각 우물에 솔루션을 100 μL를 놓습니다. </li><li> 한 시간 만이라도 실내 온도에서 조직 문화 후드에 금속판을 품어. </li><li> 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 150μL 1xPBS와 접시 6 번 씻으십시오. 당신이 Streptavidin 항체를 준비 때까지 6 번째 세척에서 접시에 PBS를 두십시오. </li><li> Streptavidin 항체를 준비합니다. <ul><li> 11mL PBS (1:2000 희석) 5.5 μ 리터 Streptavidin 항체 (Streptavidin - 알프)를 추가합니다. </li><li> 잘 섞어 소용돌이 솔루션입니다. </li><li> 다채널을 사용하여 솔루션을 추가할 계획하면 저수지에 잔. </li></ul></li><li> 우물에 남아있는 PBS를 삭제하고 번호판을 가릴. </li><li> 각 잘하는 Streptavidin 솔루션을 100 μL를 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 실온에서 조직 문화 후드에 금속판을 품어. </li><li> 접시 PBS는 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여, 6 번 씻으십시오. 당신이 컬러 솔루션을 만들 때까지 6 번째 세척에서 접시에 PBS를 두십시오. </li><li> 어둠 속에서 작동합니다. 알칼리성 인산 가수 분해 효소 기판 솔루션 (알카라인 인산 가수 분해 효소 기판 키트 IV BCIP / NBT) 준비 : <ul><li> 기판 시약 1-11 ML 트리스 버퍼 잘 와동 4 방울을 추가합니다. 트리스 버퍼 잘 소용돌이에 기판 시약이 4 방울을 추가합니다. 트리스 버퍼 잘 소용돌이에 기판 시약 3 4 방울을 추가합니다. </li></ul></li><li> 나머지 PBS를 무시하고 번호판을 가릴. </li><li> 다채널을 사용하여 접시의 각각 잘 수있는 색상의 솔루션을 100 μL를 추가합니다. </li><li> 색상 5~10분가 개발 후 불을 켭니다. </li><li> 명소 보라색을 설정하는 시작하고 매우 어두운 때까지 색상 시약은 접시에 남아 수 있습니다. 이것은 5에서 20 분 거리에 걸릴 것입니다. 이렇게하면 높은 배경을 일으킬 수 있기 때문에 너무 오래에서 기판 솔루션을 떠나지 않도록주의하십시오. </li><li> 수돗물로 ELISPOT 판에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 한 시간이나 야간을 위해 건조에 둡니다. </li><li> 수동 또는 ELISPOT 플레이트 리더와 플레이트를 참조하십시오. </li><li> 가벼운 노출 멀리 상자에 접시를 저장합니다. </li></ol> 대표 결과 : ELISPOT는 미생물 항원에 대한 면역 반응을 quantitate하도록 설계되었습니다. 각 지점의 관심 시토킨 표현, 단일 세포 응답을 나타냅니다. 장소는 수동으로 또는 ELISPOT 플레이트 판독기를 사용하여 계산하실 수 있습니다. ELISPOT가 올바르게 수행되었는지 평가는 관심의 시토킨의 배경 제작에 대한 부정적인 제어 조사로 시작한다. 약간의 배경 (보라색 색상)이있을 수 있지만 부정적인 제어 우물에서 하나는, 아무 반점을 볼 수있을 거라고 기대합니다. 일반적으로 잘 따라 오 명소 평균 이하가되어야합니다. 긍정적인 제어 우물은 반응이 제대로 수행되었는지 확인하고, 전지 antigenic의 자극에 반응하는. 긍정적인 제어 우물에서는 관광 명소 (Fig1)의 합류로 인해 깊은 보라색 배경을 보여야하는데. 없음 흰색 배경에 조금이 있어야합니다. 긍정적인 제어 및 대조군 샘플 적절한있다면, 하나는 다음 관심의 항원을 포함하고있는 우물을 계산하실 수 있습니다. "suboptimal"결과는 높은 배경 (우물은 자주색), 아니 명소 또는 거의 명소, 빈 센터, 저조한 정의 반점 또는 합류 관광 명소로 반영됩니다. 문제 해결 팁 목록 (표 1) 제공됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. ELISPOT 판의 대표. 각각의 플레이트는 긍정적인 컨트롤, 대조군 두 우물에 최소한의 관심 실시 펩티드를 포함해야합니다. 딥 퍼플 색상, 합류 세포 거의 모든 흰색 배경이 당신이 볼 수 있듯이 C9, C10, D9과 D10은 긍정적인 제어 우물입니다. 부정적인 제어 우물은 G11, G12, H11 및 H12 있습니다. 이 우물은 보라색 배경과 예상 없음 명소가 없습니다. 명소 G7, G8, H7 및 H8은 미생물의 펩티드로 세포 반응을 설명하고, 자주색 반점이 관심 시토킨을 표현하는 하나의 세포 응답을 나타냅니다. 표 1 <table border="1"><tbody><tr><td> 관찰 </td><td> 가능한 문제 </td><td> 가능한 솔루션 </td></tr><tr><td> 하이 배경 </td><td> 1. 막 양쪽 제대로 씻어 없습니다 2. 너무 많은 세포의 secreting의 시토킨 3. 플레이트가 제대로 건조되지 4. 개발 판 이상 </td><td> 1. 컬러 개발 이전과 이후 증류수와 함께 막의 양면을 씻으십시오. 시약은 접시의 바닥으로 세포막을 통해 누설 수 있으며, 씻어하지 않을 경우 이들은 높은 배경을 일으킬 수 있습니다. 2. 물론 당 세포의 수를 감소, 이것은 최적화가 필요합니다 3. 읽기 전에 접시 이상 건조 4. 개발 시간을 단축 </td></tr><tr><td> 관광 명​​소 없음 / 거의 명소 없음 </td><td> 1. secreting의 시토킨 / 관심의 단백질 충분하지 세포의 2. 세포가 제대로 자극되도록 3. 내 말 좀 incubated하지 세포충분히 긴 사연 또는 흥분제에 응답하는 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 4. 부적 절한 컬러 개발 5. 충분한 기본 또는 보조하지 항체 </td><td> 1. 세포의 수를 늘립니다. 이것은 최적화가 필요합니다 2. 당신이 시토킨 / 관심 단백질의 표현을 유도합니다 알고 흥분제 - 또한 긍정적인 자극의 컨트롤을 사용 3. 세포 배양 시간을 늘리거나 간접적 방법 (자극과 사전 치료 전지)를 사용 4. 오버헤드 현미경으로 컬러 개발을 모니터링하고 개발 시약이 올바르게 저장되었습니다 활동을 잃었하지 않도록 5. 기본 및 / 또는 보조 항체의 농도가 증가해야합니다. 이것은 최적화가 필요합니다. </td></tr><tr><td> 빈 영역 </td><td> 1. 막 미리 처리하지 2. 막 어떤 단계에서 밖으로 건조했다 3. 세포는 unevenly 배포 </td><td> 1. 확인 막은 충분히 70 %의 에탄올 (모든 점막이 너무 귀하의 공급 업체에 확인하지 않아도)와 pretreated 있습니다. 나중에 PBS 배와 잘 씻으십시오 2. 막 건조되지 않도록 3. 당신이 우물 밖으로 pipetting 전에 좋은 동종 세포 현탁액을 가지고 부드럽게 세포를 섞어 확인 </td></tr><tr><td> 빈 센터 </td><td> 1. 세탁 피해 </td><td> 1. 자동 와셔 (또는 pipetting)에 유량이 너무 높은 수 있습니다. 보다 부드러운 세척 절차를 필요 </td></tr><tr><td> 잘못된 반응 </td><td> 1. 차 항체 집계 2. 아직 막에 셀 3. 세포 배양 오염 </td><td> 1. 보조 항체를 필터 2. 모든 세포가 이차 항체 부화하기 전에 PBS 트윈 20과 멤브레인에서 세탁 있도록. 멤브레인 왼쪽 세포는 불규칙한 모양의 반점를 제공합니다 3. 살균 및 가능한 한 깨끗한 등 시약 보관하십시오. 당신의 세포 배양 기술은 무균 있는지 확인하십시오. 미디어 부정적인 컨트롤을 실행하여 잘못된 반응 있는지 확인합니다. 판 운동, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">제대로 정의 명소를 참조하십시오</a> </td></tr><tr><td> 콘플루앙 명소 </td><td> 1. 불쌍한 코팅, 너무 많은 항체 2. 연장 세포 배양 3. 세포가 과잉 자극 </td><td> 1. 기본 항체 농도를 줄입니다 2. 더 이상 세포가 incubated 있으며, 더 시토킨 / 단백질들이 분비됩니다. 이것은 합병과 분간이 될 시작합니다 더 큰 장소가 발생합니다. 3. 세포 배양 단계 배양 시간을 줄일 수 있습니다. 이상 - 자극이 시토킨 / 세포에 의해 분비되는 단백질이 많이 발생합니다. 이것은 합병과 분간이 될 시작합니다 장소를 생산합니다. 시간이 짧은 금액에 대한 문화 미디어 또는 문화에 자극의 양을 줄이기 </td></tr><tr><td> 저조한 정의 명소 </td><td> 1. 멤브레인 아니라 사전 처리는 (귀하의 세포막이 필요한 경우, 공급 업체에 문의하십시오) 2. 세포 배양 중에 플레이트의 움직임 </td><td> 1. 막은 에탄올 또는이 퍼지, 저조한 정의 명소가 발생할 수 있습니다 사전 취급해야합니다. 독자가 이들을 구별하는 것은 어려운 것입니다 2. 이사 세포가 두 개 이상의 자리를 만들 수 있으므로 접시 세포 배양 중에 이동하는 것을 허용하지 않습니다. 가능한 부화하는 동안 공개되지 않습니다 전용 배양기를 사용하는 경우. 세포를 추가한 후 번호판을 탭하지 마십시오 </td></tr><tr><td> 긍정적인 제어 우물이 낮습니다 </td><td> 1. Underdevelopment가 - 실내 온도로 이동되지 않은 Streptavidin - 알프 및 / 또는 BCIP / NBT 솔루션을 사용하여 결과 수 있습니다 </td><td> 1. 우물에 추가하기 전에 실내 온도에 시약 가져와 </td></tr><tr><td> 명소 밀도는 어려운 그들을 계량 수 있습니다 </td><td> 1. 너무 많은 세포가 우물에 추가되었습니다 </td><td> 1. 뚜렷한 반점 형성집니다 세포의 최적의 수를 결정하는 세포의 dilutions (예 : 1, 물론 당 × 10 6, 5 × 10 5, 1 × 10 5, 5 X 10 4, 1 X 10 4 세포)를 만들 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li>
<li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li>
<li>Kim, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li>
<li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li>
<li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li>
<li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li>
<li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+differentiated%2C+resting+gn-specific+memory+CD8%2B+T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li>
<li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

ELISPOT 분석은 인간의 면역 반응을 모니터링하는 가장 중요하고 널리 사용 assays의 하나로서 등장과 다른 종의 다양한 있습니다. ELISPOT 분석과 함께, 면역 세포 주파수는 세포 집단의 확장이나 조작없이 단일 세포 수준에서 측정할 수 있습니다. ELISPOT 분석 널리 감염증, 암, 알레르기 및 면역 질환 등 다양한 질병의 항원 특정 면역 반응을 조사하기 위해 적용되었습니다. 이 분석의 응용 프로그램은 크게 항원 특정 세포의 부량 중요한이나 항생제 치료 1 일 이전이나 이후 결핵 등 다양한 질병 상태에서 특정 항원에 대한 면역 반응의 비교는 연구에 적용되었습니다. 그러나, 최근의 보고서는이 같은 분석은 ascitic 유체, 대뇌 척수 또는 bronchoalveolar 세척과 같은 절연 재료 세포 내에서 항원에 특정한 T 세포의 주파수를 감지하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 성 - 한 김 동부 표준시. 알. 복부 결핵 의심 환자에서 PBMCs에서 ELISPOT 분석을 사용하여, 적극적인...

미디어 A. 준비 <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="자료"> 트리스 버퍼의 B. 준비 <ol><li> 1 L의 비커에 ddH 2 O 800 ML을 추가합니다. </li><li> 트리스의 12g를 측정하여 비커에 추가할 수 있습니다. </li><li> 비커에 : 마그네슘 염화 hexahydrate의 0.12 g (6H 2 O MgCl 2) 추가합니다. </li><li> 자동 교반 접시에 자석 교반 막대로 저어. </li><li> 일단 9.5에 대한 솔루션은 산도, 해산. </li><li> 1000mL로를 데리고, 비커에 ddH 2 O 200 ML을 추가합니다. </li><li> 0.22 μm의 필터와 솔루션을 필터링합니다. </li></ol> ELISPOT 분석에 필요한 C. 재료 : <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="재료 B">

효소 링크된 immunospot 분석 (elispot) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

적응성 면역은 세포 내 병원균의 통관하는 중요한 구성 요소입니다. 인간이 반응을 감지하고 계량하는 능력은 중요한 진단 도구입니다. 효소 링크된 immunospot 분석 (ELISPOT)는 등 HIV 감염, 이식있는 사람으로 immunosuppressed 인구 및 스테로이드 사용을 포함한 미생물의 항원, 세포 면역에 대한 답변을 식별하는 능력에 대한 인기를 얻고있다. 이 분석은 면역 특정 미생물 항원에 대한 반응뿐만 아니라, 이러한 반응은 성격 Th1 또는 Th2 경우에는 구별을 계량하는 능력이 있습니다. ELISPOT은 염증의 사이트에 국한되지 않습니다. 그것은 주변 혈액뿐만 아니라 bronchoalveolar 세척, 대뇌 척수, 그리고 복수와 같은 적극적인 참여의 사이트 내에서 면역 반응에 대한 평가 능력에 다재 다능한 것입니다. 단일 또는 여러 항원에 대한 면역 반응의 검색이 가능합니다뿐만 아니라, 미생물 단백질 내의 특정 epitopes. 이 분석은 시간이 지남에 따라 면역 반응의 검출뿐만 아니라 호스트 T 세포에 의해 인식 항원의 구분을 용이하게합니다. 듀얼 컬러 ELISPOT assays의 두 크린 시토킨의 동시 표현의 검색이 가능합니다. 이 기술에 대한 최근의 애플 리케이션 extrapulmonary 결핵의 진단뿐만 아니라 면역 질환 감염성 항원의 공헌에 대한 조사를 포함합니다.

특발성 질환에 적응 면역의 미생물 목표 식별은 효소 연결된 immunospot 분석을 사용하여 수행할 수 있습니다.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

적응 면역은 세포 내 병원균을 제거하는 데 중요한 구성 요소입니다. 인간에게서 이러한 반응을 검출하고 정량화하는 능력은 ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 관심 항원에 대한 T세포 반응을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 포획 항체로 코팅함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 세포와 관심 항원을 첨가한 후 하룻밤 동안 배양하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 검출 항체를 첨가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 기질 시약으로 플레이트를 발색시키고 스팟을 분석하는 것입니다. 최종적으로, 스팟 형성 단위의 분석을 통해 관심 있는 사이토카인을 선택하여 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 밴더빌트 대학교 감염병 분과 Wonder Drake 박사 연구실의 연구 강사 Ki Richter 박사입니다. 오늘은 효소 결합 면역 스폿 분석법으로도 알려진 ELISpot 기술을 시연하겠습니다. 오늘은 Isfahan Chambers 박사와 Tiffany Cone이 이 기술을 시연할 예정입니다.세포 배양 표준을 유지하기 위해, 후드 내 무균 상태에서 조작을 수행하고, ally spot plate를 열어 PBS로 3회 세척하십시오. PBS에 포획 항체를 사용하여 코팅 용액을 준비하십시오. 편의를 위해 볼텍싱하여 잘 섞어줍니다.항체 용액을 멀티채널 피펫용 리저버로 옮긴 후, 각 웰에 코팅 용액 100 µL씩 분주합니다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하여 냉장고에 하룻밤 동안 보관하십시오. 이렇게 항체가 코팅된 플레이트는 수 주 동안 사용할 수 있습니다.일반적으로 웰에 액체가 남아 있는 경우 플레이트를 사용할 수 있습니다. 이 분석을 위해 세포를 준비하려면, 새로 분리한 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells)를 trypan blue로 염색하여 생존율을 확인하고 세포 수를 측정하십시오. PBMC를 10 mL 배지에 mL당 2 million cells 농도로 분주하고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 실험 내용을 기록하기 위해, Ali spot 플레이트 뚜껑에 검체 식별 번호, 웰 조건 및 날짜를 기입하십시오.멸균된 PBS를 이용하여 dump and blot 방식으로 플레이트를 6회 세척합니다. 세척액을 버릴 때 플레이트에 튀지 않도록 주의하십시오. 액체가 튀면 플레이트의 웰이 보라색으로 변할 수 있습니다. 각 웰에 20 µL의 배지를 추가하고 37 °C에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.플레이트를 배양하는 동안, 하룻밤 동안 휴지시킨 세포 수를 측정합니다. 원심 분리를 통해 pbmc를 수확합니다. 상층액을 따라내고 펠렛을 10배 농축 배지에 1 mL당 100만 개의 세포 농도가 되도록 재현탁합니다.ally spot plate를 1시간 동안 배양한 후, 덤프 앤 블롯(dump and blot) 방식으로 R 20 배지를 제거합니다. 배지를 비울 때 플레이트에 액체가 튀지 않도록 주의하십시오. 각 웰에 세포 현탁액 100 µL를 첨가합니다.해당하는 테스트 웰에 펩타이드와 항원을 추가하여 실험 설계를 수행합니다. 항상 펩타이드를 추가하지 않은 세포의 음성 대조군과 phyto hemagglutinin을 추가한 양성 대조군 웰을 포함하십시오. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.덤프 앤 블롯(dump and blot) 방법을 사용하여 1 XPBS 150 µL로 플레이트를 6회 세척합니다. 플레이트의 각 웰에 PBS 100 µL를 첨가하고, 플레이트를 냉장고 또는 상온에서 15분 동안 둡니다. 그동안 PBS 내의 비오틴 항체 용액을 준비합니다.냉장고에서 ALI 스팟 플레이트를 꺼내고 PBS를 폐기물 통에 털어내어 제거합니다. 플레이트에 용액이 튀지 않도록 주의하며, 각 웰에 비오틴 항체 용액 일정량을 분주하고 조직 배양 후드 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 플레이트를 6회 세척하며, 마지막 세척 시에는 덤프 앤 블롯(dump and blot) 방식을 사용합니다.이제 플레이트에 PBS를 그대로 둡니다. PBS로 STREPTAVIDIN 항체 용액을 준비하고, 용액이 잘 섞이도록 볼텍싱하십시오. 웰에서 마지막 PBS 세척액을 제거하고 ALI 스팟 플레이트를 도식화합니다.각 웰에 streptavidin 항체 용액을 첨가하고, 조직 배양 후드 내의 상온에서 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 과량의 streptavidin 항체를 제거하기 위해 PBS로 플레이트를 6회 세척하며, 마지막 세척 시에는 덤프 및 블롯(dump and blot) 방법을 사용하고 플레이트에 PBS를 남겨둡니다. B-C-I-P-M-B-T 알칼리성 인산분해효소 기질 용액의 빛 민감성을 고려하십시오.알칼라인 포스파타아제 기질 키트 지침서의 제조사 설명대로 염색 용액을 준비할 때는 암실에서 작업하십시오. 웰에 남아 있는 PBS를 제거하고 ly spot 플레이트를 닦아냅니다. 각 웰에 기질 용액을 넣고 조명을 켭니다. 5~10분 동안 색상을 발색시킨 후, 스팟이 보라색으로 변하고 상당히 진해질 때까지 시약을 플레이트에 그대로 둡니다.이 과정은 최대 20분 정도 소요됩니다. Ali 스팟 플레이트를 수돗물로 3회 세척한 후 공기 중에서 건조시키십시오. 각 플레이트에는 양성 대조군, 음성 대조군 및 최소 2회 반복 실험을 수행한 목적 펩타이드가 포함되어 있습니다.양성 대조군 웰은 짙은 보라색을 띠며, 이는 세포가 밀집된 층을 형성하고 흰색 배경이 거의 없음을 나타냅니다. 음성 대조군 웰은 예상대로 보라색 배경이나 반점이 나타나지 않습니다. 테스트 샘플 웰은 미생물 펩타이드에 대한 세포 반응을 보여줍니다.보라색 반점은 LA spot 기법을 수행할 때 관심 사이토카인을 발현하는 단일 반응성 세포를 나타냅니다. 피펫 팁으로 멤브레인을 찌르거나 플레이트가 마르지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 배경 신호가 높게 나타날 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인유두종바이러스와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체의 T세포 에피토프를 규명하는 것은 혈중 T세포 수가 제한적이기 때문에 매우 어렵습니다. 본 영상에서는 매우 적은 수의 세포로부터 희귀 T세포를 분리하고 특성을 분석하는 방법을 설명합니다.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

이 동영상은 항체를 분비하는 B 세포(ASC)의 기능을 평가하기 위해 ELISpot 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. ASC에 의해 분비된 항체는 효소 접합 IgG 또는 IgM 항체에 의해 검출되는 막 결합 다클론 항체 단편과 상호 작용합니다. 각 웰에서 생성된 착색된 반점은 특정 항체의 동형이 존재함을 나타내며, 이는 B 세포의 분비 활동과 관련이 있습니다.

ELISpot Assay를 사용한 항체 분비 B 세포의 기능 평가

이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

장기 배양 인터페론 γ 효소 - 결합 된 Immunospot 분석은 중앙 메모리 응답의 척도로서 사용하고 보호 항 미코 박테리아 백​​신 응답과 상관된다. 이 분석을 통해, 말초 혈액 단핵 세포는 마이코 박테리아 항원과 인터루킨 -2 14 일 동안 활성화, 분화 및 중앙 메모리 T 세포의 확장을 자극.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

기니 돼지 PBMCs에 대 한 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과 개발 전염병 연구이 관련성이 높은 모델 T 세포 응답의 특성을 수 있습니다. 우리는 DNA 백신의 피부 전달과와 관련 된 T 세포 응답을 측정 하는 분석 결과 적용 했습니다.

예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가

학습하세요 ELISPOT 분석을 통해 특정 항원에 대한 T세포 면역 반응을 정량적으로 검출하는 방법을. 미생물 표적 식별과 적응 면역 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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