효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

이 실험 절차의 전반적인 목적은 관심 항원에 대한 T세포 반응을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 포획 항체로 코팅함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 세포와 관심 항원을 첨가한 후 하룻밤 동안 배양하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 검출 항체를 첨가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 기질 시약으로 플레이트를 발색시키고 스팟을 분석하는 것입니다. 최종적으로, 스팟 형성 단위의 분석을 통해 관심 있는 사이토카인을 선택하여 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 밴더빌트 대학교 감염병 분과 Wonder Drake 박사 연구실의 연구 강사 Ki Richter 박사입니다. 오늘은 효소 결합 면역 스폿 분석법으로도 알려진 ELISpot 기술을 시연하겠습니다. 오늘은 Isfahan Chambers 박사와 Tiffany Cone이 이 기술을 시연할 예정입니다.

세포 배양 표준을 유지하기 위해, 후드 내 무균 상태에서 조작을 수행하고, ally spot plate를 열어 PBS로 3회 세척하십시오. PBS에 포획 항체를 사용하여 코팅 용액을 준비하십시오. 편의를 위해 볼텍싱하여 잘 섞어줍니다.

항체 용액을 멀티채널 피펫용 리저버로 옮긴 후, 각 웰에 코팅 용액 100 µL씩 분주합니다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하여 냉장고에 하룻밤 동안 보관하십시오. 이렇게 항체가 코팅된 플레이트는 수 주 동안 사용할 수 있습니다.

일반적으로 웰에 액체가 남아 있는 경우 플레이트를 사용할 수 있습니다. 이 분석을 위해 세포를 준비하려면, 새로 분리한 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells)를 trypan blue로 염색하여 생존율을 확인하고 세포 수를 측정하십시오. PBMC를 10 mL 배지에 mL당 2 million cells 농도로 분주하고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 실험 내용을 기록하기 위해, Ali spot 플레이트 뚜껑에 검체 식별 번호, 웰 조건 및 날짜를 기입하십시오.

멸균된 PBS를 이용하여 dump and blot 방식으로 플레이트를 6회 세척합니다. 세척액을 버릴 때 플레이트에 튀지 않도록 주의하십시오. 액체가 튀면 플레이트의 웰이 보라색으로 변할 수 있습니다. 각 웰에 20 µL의 배지를 추가하고 37 °C에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.

플레이트를 배양하는 동안, 하룻밤 동안 휴지시킨 세포 수를 측정합니다. 원심 분리를 통해 pbmc를 수확합니다. 상층액을 따라내고 펠렛을 10배 농축 배지에 1 mL당 100만 개의 세포 농도가 되도록 재현탁합니다.

ally spot plate를 1시간 동안 배양한 후, 덤프 앤 블롯(dump and blot) 방식으로 R 20 배지를 제거합니다. 배지를 비울 때 플레이트에 액체가 튀지 않도록 주의하십시오. 각 웰에 세포 현탁액 100 µL를 첨가합니다.

해당하는 테스트 웰에 펩타이드와 항원을 추가하여 실험 설계를 수행합니다. 항상 펩타이드를 추가하지 않은 세포의 음성 대조군과 phyto hemagglutinin을 추가한 양성 대조군 웰을 포함하십시오. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

덤프 앤 블롯(dump and blot) 방법을 사용하여 1 XPBS 150 µL로 플레이트를 6회 세척합니다. 플레이트의 각 웰에 PBS 100 µL를 첨가하고, 플레이트를 냉장고 또는 상온에서 15분 동안 둡니다. 그동안 PBS 내의 비오틴 항체 용액을 준비합니다.

냉장고에서 ALI 스팟 플레이트를 꺼내고 PBS를 폐기물 통에 털어내어 제거합니다. 플레이트에 용액이 튀지 않도록 주의하며, 각 웰에 비오틴 항체 용액 일정량을 분주하고 조직 배양 후드 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 플레이트를 6회 세척하며, 마지막 세척 시에는 덤프 앤 블롯(dump and blot) 방식을 사용합니다.

이제 플레이트에 PBS를 그대로 둡니다. PBS로 STREPTAVIDIN 항체 용액을 준비하고, 용액이 잘 섞이도록 볼텍싱하십시오. 웰에서 마지막 PBS 세척액을 제거하고 ALI 스팟 플레이트를 도식화합니다.

각 웰에 streptavidin 항체 용액을 첨가하고, 조직 배양 후드 내의 상온에서 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 과량의 streptavidin 항체를 제거하기 위해 PBS로 플레이트를 6회 세척하며, 마지막 세척 시에는 덤프 및 블롯(dump and blot) 방법을 사용하고 플레이트에 PBS를 남겨둡니다. B-C-I-P-M-B-T 알칼리성 인산분해효소 기질 용액의 빛 민감성을 고려하십시오.

알칼라인 포스파타아제 기질 키트 지침서의 제조사 설명대로 염색 용액을 준비할 때는 암실에서 작업하십시오. 웰에 남아 있는 PBS를 제거하고 ly spot 플레이트를 닦아냅니다. 각 웰에 기질 용액을 넣고 조명을 켭니다. 5~10분 동안 색상을 발색시킨 후, 스팟이 보라색으로 변하고 상당히 진해질 때까지 시약을 플레이트에 그대로 둡니다.

이 과정은 최대 20분 정도 소요됩니다. Ali 스팟 플레이트를 수돗물로 3회 세척한 후 공기 중에서 건조시키십시오. 각 플레이트에는 양성 대조군, 음성 대조군 및 최소 2회 반복 실험을 수행한 목적 펩타이드가 포함되어 있습니다.

양성 대조군 웰은 짙은 보라색을 띠며, 이는 세포가 밀집된 층을 형성하고 흰색 배경이 거의 없음을 나타냅니다. 음성 대조군 웰은 예상대로 보라색 배경이나 반점이 나타나지 않습니다. 테스트 샘플 웰은 미생물 펩타이드에 대한 세포 반응을 보여줍니다.

보라색 반점은 LA spot 기법을 수행할 때 관심 사이토카인을 발현하는 단일 반응성 세포를 나타냅니다. 피펫 팁으로 멤브레인을 찌르거나 플레이트가 마르지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 배경 신호가 높게 나타날 수 있습니다.