효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

이 절차의 전반적인 목표는 관심 항원에 대한 T 세포 반응을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 포획 항체를 사용한 코딩으로 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 관심 세포와 항원을 추가한 다음 하룻밤 동안 배양하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 검출 항체를 추가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 기질 시약으로 플레이트를 개발하고 스폿을 분석하는 것입니다. 궁극적으로 스폿 형성 단위의 분석을 통해 관심 있는 사이토카인을 선택한 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Dr.Ki Richter이고 밴더빌트 대학교 Dr.Wonder Drake 실험실의 전염병 부서 연구 강사입니다. 오늘 우리는 효소 결합 면역 스폿 분석법으로도 알려진 Ellie Spot 기술을 시연하고 있습니다. 닥터 이스파한 챔버스(Dr. Isfahan chambers)와 티파니 콘(Tiffany Cone)이 오늘 이 기술을 시연할 예정입니다.

세포 배양 표준을 유지하려면 후드의 멸균 상태에서 조작을 수행하고 동맹 스폿 플레이트를 열고 PBS로 세 번 세척합니다. PBS에서 포획 항체의 코팅 용액을 준비합니다. 편의를 위해 볼텍싱으로 잘 섞습니다.

항체 용액을 다중 채널용 저장소로 옮기고, 피펫터를 주입하고 100마이크로리터의 코팅 용액을 각각 분취합니다. 접시를 퍼필로 잘 밀봉하고 냉장고에 하룻밤 동안 두십시오. 이 항체 코팅 플레이트는 몇 주 동안 사용할 수 있습니다.

경험 법칙에 따르면 우물에 액체가 아직 남아 있는 경우 플레이트를 사용할 수 있습니다. 이 분석을 위해 세포를 준비하기 위해 새로 분리한 말초 혈액 단핵 세포를 생존율을 위해 trien blue로 염색하고 계수합니다: 10개의 배지에서 pbmc를 밀리리터당 200만 개의 세포로 플레이트화하고 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 실험을 추적하기 위해 Ali spot plate 뚜껑에 검체 식별 번호, 웰 상태 및 날짜를 표시하십시오.

dump and blot 방법을 사용하여 멸균 PBS로 플레이트를 6번 세척합니다. 덤핑하는 동안 접시가 튀지 않도록 주의하십시오., 접시의 우물이 보라색으로 변할 수 있습니다. 각 웰에 20개의 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.

플레이트가 배양하는 동안 밤새 쉬었던 세포를 세십시오. 원심분리로 pbmc를 수확합니다. 상층액을 디캔팅하고 펠릿을 10개의 배지에 밀리리터당 100만 개의 세포 농도로 재현탁시킵니다.

ally spot plate를 1시간 동안 배양한 후 dump and blot 방법을 사용하여 R 20 매체를 제거합니다. 덤핑하는 동안 플레이트가 튀지 않도록 주의하세요. 각각에 100마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다.

해당 테스트 웰에 펩타이드와 항원을 첨가하여 실험 설계를 잘 따르십시오. 항상 펩타이드가 없는 세포의 음성 대조군과 피토 헤마글루티닌이 첨가된 양성 대조군 웰을 포함하십시오. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 밤새 접시를 배양합니다.

덤프 앤 블롯 방법을 사용하여 150마이크로리터의 XPBS로 플레이트를 6번 세척합니다. 플레이트의 각 웰에 PBS 100마이크로리터를 넣고 플레이트를 냉장고에 넣거나 실온에서 15분 동안 보관합니다. 한편, PBS에서 비오틴 항체 용액을 준비합니다.

냉장고에서 ALI 스폿 플레이트를 꺼내 PBS를 쓰레기통에 넣어 버립니다. 비오틴 항체 용액을 각 웰에 분취액을 투입하는 동안 플레이트가 튀지 않도록 주의하고 조직 배양 후드에서 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막 세척 시 dump and blot 방법을 사용하여 PBS로 플레이트를 6번 세척합니다.

이제 PBS를 접시에 남겨 두십시오. PBS에서 STREPTAVIDIN 항체 용액을 준비하여 용액이 혼합되도록 와류로 만듭니다. 웰에서 마지막 PBS 세척을 버리고 ALI 스폿 플레이트를 플로팅합니다.

각 웰에 스트렙타비딘 항체 용액을 추가하고 조직 배양 후드의 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 과잉 trevain 항체를 제거하기 위하여는, 마지막 세척에 하치장과 오점 방법을 사용하여 PBS로 판을 6 번 세척하고, 판에 PBS를 지도하십시오. B-C-I-P-M-B-T 알칼리성 포스파타제 기질 용액의 광 감도를 감안할 때.

알칼리성 인산가수분해효소 기질 키트 지침에서 제조업체가 설명한 대로 줄기 용액을 준비할 때 어두운 곳에서 작업하고 웰에서 남은 PBS를 버리고 ly spot plate를 닦아냅니다. 각 웰에 기질 용액을 추가하고 조명을 켭니다. 5분에서 10분 동안 색이 변한 후 반점이 보라색으로 변하기 시작하고 상당히 어두워질 때까지 시약을 접시에 그대로 두십시오.

이 작업은 최대 20분이 소요됩니다. Ali Spot 플레이트를 수돗물로 세 번 씻고 자연 건조시킵니다. 각 플레이트에는 양성 대조군, 음성 대조군 및 관심 펩타이드가 포함되어 있으며 최소한으로 중복으로 수행됩니다.

positive control well은 짙은 자주색이며 세포의 합류 층을 반영하며 흰색 배경은 거의 없습니다. 음성 대조군 우물에는 보라색 배경이 없으며 예상대로 반점이 없습니다. 테스트 샘플 웰은 여기에서 미생물 펩타이드에 대한 세포 반응을 보여줍니다.

보라색 반점은 LA 반점 기법을 수행할 때 관심 있는 사이토카인을 발현하는 단일 반응 세포를 나타냅니다. 피펫 팁으로 멤브레인에 구멍을 뚫거나 접시가 건조되지 않도록 주의하십시오.