Name: 분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 ELISpot을 이용하여 인간 혈액에서 항체 분비 B 세포를 분리 및 정량화하는 방법을. 단일 세포 수준에서 면역 반응을 분석하여 백신 효능 연구에 활용할 수 있습니다.

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본 연구는 대만 행정원(Executive Yuan)의 과학기술부(Ministry of Science and Technology)의 연구 보조금(NSC99-2320-B-002-011)의 지원을 받았다. 국립 대만 대학교 의과대학 제1코어 실험실의 유세포 분석 및 분류 코어에서 제공하는 탁월한 서비스에 감사드립니다.

인간의 말초 혈액은 동의서에서 건강한 기증자로부터 얻을 수 있어야하며, 혈액 샘플의 사용은 개별 기관 생명 윤리위원회에 의해 설립 승인 가이드 라인을 준수해야합니다. 본 연구에서는 프로토콜은 국립 대만 대학 병원의 내부 검토위원회 (프로토콜 번호 201307019RINB)에 의해 승인되었다 유동 세포 계측법 (그림 1)과 ELISPOT 분석 (그림 3)의 결과의 데모 인간의 혈액을 사용합니다. 1. 분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화 <ol><li> K 2 EDTA (1.5-2.0 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 15 ML의 튜브로 (팔꿈치에 cubital 포사 앞쪽에) 중간 cubital 정맥에서 혈액 ~ 10 ㎖를 그리고 즉시 튜브를 응고를 방지하기 위해 여러 번 반전 형성. </li><li> 적혈구가 (RBC)의 버퍼 (150 mM의 NH 4 CL, 10 mM의 KHCO 3, 1 mM의 EDTA를 용해 (121 ° C, 15 분) 오토 클레이브의 35 mL를 넣고, 페이지신선한 혈액 샘플 (≥ 3 함유 튜브 H 7.4) : 1 부피 / 부피)을 더 이상 5 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다. 주 : 튜브를 통해 빛의 전송의 모양은 RBC 용해의 완료를 나타냅니다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 펠렛 색 흰색 있는지 확인하십시오. </li><li> 10 멸균 된 인산 완충 식염수 mL로 펠렛을 재현 탁 (PBS, 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 나 2 HPO 4, 1.47 mM의 KH 2 PO 4, 산도 7.4) 단계 1.3에서와 같이 원심 분리기. </li><li> 상등액을 버리고 ㎖의 RPMI 1640 배지 (첨가제 : 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.25 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 및 2 mM L- 글루타민) 10 펠렛을 재현 탁 다음과는 판형 10 cm 배양 접시에 세포 (접시 당 혈액 10 ㎖). 30 분 동안 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기에서 접시를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 배양 접시를 몇 번 소용돌이 및 배치15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 배지 (서스펜션 세포). 배양 접시에 부착 세포 (주로 대 식세포)를 폐기하십시오. </li><li> 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> RPMI 1640 배지 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁. 혈구 또는 자동 셀 카운터 셀 수를 계산합니다. 주 : 절연 백혈구의 생존 정상적으로 트리 판 블루 배제에 의해 90 %보다 크다. </li><li> 단계 1.7에서와 같이 원심 분리기 (5)의 농도로 차가운 PBS 완충액 (0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA)의 ~ 200 μL의 세포를 재현 탁 - 10 × 106 세포 / ㎖. </li><li> 106 세포 당 (B 세포를 음성 선별 용) 혈액 세포에 특정 비오틴 화 항 - 인간 구간 칵테일 5 μL를 넣고, 30 분 21 얼음 위에서 배양한다. 참고 : 항 - 인간 Ab의 칵테일은 적어도 CD2 (또는 CD3), CD14 및 CD16 특정 애비를 포함해야합니다. </li><li> 10 배를 초과하는 볼륨 추가멸균 PBS의 세포를 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리하고, 상등액을 폐기한다. </li><li> 동일 스트렙 타비 딘 - 복합 마이크로 비드의 양 펠릿에 (10 6 세포 당 5 μL)을 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에서 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 튜브에 PBS 버퍼 2 ML을 추가합니다. </li><li> 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 8 분 동안 실온에서 품어. 갈색 마이크로 비드 서서히 옆의 자석 (22)에 튜브 벽에 부착된다. </li><li> 자기 스탠드에 남아있는 관으로, 조심스럽게 새로운 멸균 15 ML의 튜브 (22)에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 반복 1.16-1.14 단계를하고, 손길이 닿지 않은 B 세포를 포함하는 두 개의 상층 액을 결합한다. 마이크로 비드를 폐기하십시오. </li><li> 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> 하류 실험 RPMI 1640 배지에 펠렛을 재현 탁. 참고 : 일반적으로 1-5 × 10 5 B 세포의 지혜HA 말초 혈액 10 mL의 95 % 이상의 순도가 23을 분리 할 수있다. </li></ol> 격리 된 B 세포 2. 정제 및 메모리의 분리 및 나이브 B 세포 <ol><li> 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정한다. </li><li> 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리 및 RT 후 차가운 PBS 완충액 100 μL의 세포를 재현 탁. </li><li> 추가 1 - 10 6 세포 당 바이오틴 CD27 단클론 항체 μg의 2를 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 5 분 동안 600 XG에 튜브와 원심 분리기에 PBS 버퍼의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 PBS 버퍼 50 μL의 세포를 재현 탁. </li><li> 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 세포 - (2 μg의 / 10 6 세포 1) 스트렙 타비 딘 자기 마이크로 비즈의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 잘 혼합하고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 튜브에 PBS 버퍼의 3 mL의 - (2)를 추가합니다. </li><li> 놓고자기 스탠드에 관하고 갈색 마이크로 비드를 자석에 가까운 측에 부착 할 수 있도록 8 분 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 자기 받침대의 관을 조심스럽게 새로운 멸균 튜브로 상청액 분획을 전송. 순진한 B 세포 -이 부분은 풍부한 CD27가 포함되어 있습니다. </li><li> 마이크로 비드를 포함하는 튜브에 5 mL를 추가하고 부드럽게 마이크로 비드를 재현 탁 (즉, CD27 + 메모리 B 세포의 농축 비율) 24 ~ 25. </li><li> 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 하류 실험 RPMI 1640 배지와 펠렛을 재현 탁. 주 : 일반적으로, ~ 30 - B 세포의 60 %는 건강한 공여체 (7), 25-26의 한 PBMC로부터의 CD27 + 메모리 셀들로 정제 할 수있다. </li></ol> 나이브 B 세포, 메모리 B 세포 및 PB들 /의 PC의 컬렉션에 대한 정렬 3. 셀 <ol><li> 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하는 hemocytome를 이용하여 세포 수를 결정터 또는 자동 세포 계수기. </li><li> 5 mL의 폴리스티렌 튜브에서 107 mL 당 농도에 차가운 PBS 완충액으로 세포를 재현 탁. </li><li> 1 추가 - 10 6 셀 당 인간 IgG의 2 μg의 및은 FC 블록 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 1 μg의 각 추가 항 CD19를-APC (클론 : HIB19), 항 CD27-eFluor450 (클론 : O323), 및 항 CD38-PE (클론 : HIT2) 10 6 세포 당; 잘 혼합하고 30 분 4, 27 얼음에 품어. </li><li> 단계 3.4의 마지막 5 분에서, 상업 7 aminoactinomycin의 D (7-AAD)의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 600 XG에 튜브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 PBS의 2 ML을 추가합니다. </li><li> 15 ㎖의 튜브 용액 당 5 × 107 세포 - 1의 농도 (2 % BSA, 2 mM의 EDTA로 멸균 PBS) 정렬 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> 세포 덩어리를 제거하기 위해 나일론 메쉬 셀 스트레이너 (40 ㎛의 공극 크기)를 통해 세포를 필터. </li><li> 유동 세포 계측 정렬하여 세포를 분리바이올렛 (405 ㎚), 청색 (488 nm의)과 빨간색 (640 ㎚) : 어 세 가지 레이저를 장착. 참고 : 3 색이 세포 계측법 27-28 흐름을 위해 혼자 블루 레이저 충분하다. </li><li> 정렬 세 나이브 B 세포의 동시 수집을 위해 (5 ㎖ RPMI 매질 포함) 15-㎖의 튜브 (CD19 + CD27 -)로 세포, 기억 세포 (CD19 + CD27 +) 및 PB들 / PC를 (CD19 + CD27 + / 하이 CD38의 +) 3-4, 28. 주의 : 단계 4에 기재된 바와 같이 분류 및 나이브 기억 B 세포를 배양 할 수있다. </li></ol> 나이브 B 세포 - 고립 된 인간의 CD19 + B 세포, CD19 + CD27 + 메모리 B 세포와 CD19 + CD27의 체외 분화 4. <ol><li> 단계 1.19, 2.10, 2.11 및 3.10로 정제하여 세포를 이용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 결정한다. </li><li> RPMI 1640 배지로 세포를 재현 탁1의 농도에서 -는 ml 당 10 × 105은 12 웰 플레이트로 나누어지는. </li><li> / mL의 18, 29 5 μg의 / 10 6 세포에서의 CpG (ODN 2006)를 추가합니다. </li><li> 배양 5 일간 5 % CO 2, 37 ° C의 배양기에서 세포. </li><li> 물론 각각의 세포를 수확 15 ML의 튜브에 개별적으로 배치, 각 튜브에 PBS의 5 mL를 넣어 5 분 동안 600 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. </li><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. RPMI 1640 배지로 용액에 10 × 105 - (1)의 농도로 세포를 재현 탁. </li></ol> 5. ELISPOT 분석 <ol><li> 30 초 동안 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 증류수 35 % 에탄올의 30 μL를 추가한다. 참고 : 피펫 팅 할 때, 항상 우물에서 막를 만지지 마십시오. </li><li> 에탄올을 제거하기 위해 ELISPOT 판을 반전. </li><li> 각 웰에 150 μL 멸균 DDH 2 O의 넣고 배양5 분간 RT에서 그들을 잔류 에탄올을 세척하는 단계; 3 분 동안 실온에서 멸균 PBS의 세척에 따릅니다. 참고 : 5.3-5.1이 판의 제조에 따라 선택 될 수있다 단계. </li><li> 넣어 5 μg의 / mL의 클론 F (AB &#39;) 항 - 인간 IG (IgG의 + IgM의 +의 IgA)의 2 조각 50 μL 4 ° C에서 하룻밤을 품어 (PBS로) ELISPOT 플레이트의 각 웰에와 (선호) 또는 2 시간 11 37 ° C를. 참고 : 사용할 때까지 파라 필름과 판의 가장자리를 밀봉합니다. </li><li> 3 분마다 RT에서 두 번, 언 바운드 복근을 제거 각 웰에 PBS 200 μL를 추가하고,이를 배양 접시를 반전. </li><li> 잘 차단 각각 5 % BSA (또는 RPMI 1640 배지)를 PBS 200 μL를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 이들을 배양한다. </li><li> 차단 버퍼를 제거하기 위해 번호판을 반전. 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오. </li><li> 각 웰에 RPMI 1640 배지 100 μL를 추가하고 37 ° C에서 그들을 품어. </li><li> 준비된 세포를 시드하는 경우, RPMI 1640 배지를 제거하기 위해 반전 플레이트. </li><li> 종자 100 μL (5 × 104) 50 μL (2.5 × 104)과의 웰에 25 μL의 셀 (1.25 × 104) (단계 1.19, 2.10, 2.11, 3.10에서 4.6) ELISPOT 판. RPMI 1640 배지로, / 잘 150 μL에 볼륨을 가지고. 참고 : 세포를 도금 하나 또는 두 개의 2 배 연속 희석의 최소 권장합니다. </li><li> 14 시간 18-8 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어. 배양 중에 플레이트를 이동하지 마십시오. </li><li> 세포 및 RPMI 1640 배지를 제거하는 번호판을 반전. </li><li> 3 분 동안 실온에서 때마다 5 회 (0.05 % 트윈 20과 PBS) 200 μL / 잘 PBS-T의를 추가하고 그들에게 품어. 5 회 세척 각 사이의 세척 완충액을 제거하기 위해 판을 전환. </li><li> 염소 항 - 인간 IgG-알칼리성 포스파타제 (AP), Fcγ 특정 애비를 추가 (IgG를 감지, 1 : 5,000 PBS-T에서) 또는 염소 항 - 인간 IgM의-AP, Fcμ 단편 특정 애비 (IgM의 검출, 1 : PBS-T 5,000) 지정된 우물에와 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오. </li><li> 50 μL / 웰의 bromochloroindolyl 인산 니트로 블루 테트라 졸륨 (BCIP / NBT) 기질 용액을 추가합니다. 15 분 - 퍼플 색의 반점은 보통 5에 나타납니다. </li><li> 관광 명소의 과도한 개발을 방지하기 위해 100 μL / 잘 DDH 2 O를 추가합니다. </li><li> 모든 지점의 전체 개발 후 수돗물을 실행하는 접시를 씻어. </li><li> 판의 암거를 제거하고 어둠 속에서 공기 건조 할 수 있습니다. </li><li> 이미지 획득 / 분석 부 (예를 들면, 자동 또는 수동으로 스캐너 해부 현미경을 통해)로 자동 플레이트 판독기를 사용하여 스폿을 카운트. 주 : 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 저장하고 나중에 분석 될 수있다. </li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계를 선언하지 않습니다.

분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화 일반적으로 적혈구 효율적으로 파열 및 용해 버퍼 (단계 1.2)에 의해 삭제 될 수 있습니다. 세포 생존율은 염화 암모늄에 의해 영향을받을 수 있습니다로는 5 분 이상 더 이상 RBC 용해 버퍼 PBMC를 품어하지 않는 것이 중요합니다. 대안 적으로, 적혈구 및 혈소판 동시에 다음의 프로토콜에 의해 제거 될 수있다. 산 스트로스 구연산 (ACD) 완충액으로 신선한 전혈 믹스 (39 mM의 시트르산, 75 mM의 시트르산 나트륨, 135 mM의 덱 스트로스하여 pH 7.4) 9 부피비 : 1, 혈액에 버퍼. 실온에서 10 분 동안 250 XG에 원심 분리기. 분리를 나타내는 층의 형성에주의를 기울이십시오. 기음과 혈소판 및 혈소판이 풍부한 혈장 (노란색)를 포함하는 상위 계층을 버린다. PBMC를 포함 된 인터페이스에 얇은 중간 층을 제거 (전합니다 .e., 버피 코트를)....

B 세포는 체액 면역의 발달에서 중요한 역할을한다. 그들은 초기 골수에서 개발 발전 용 나이브 비장으로서 림프 조직으로 이전 할 수 B 세포, 림프절, 및 편도로 혈류를 입력한다. 의 Ag 조우되면 어떤 나이브 B 세포는 배 중심 B 세포는 기억 B 세포 plasmablasts (PBS) / 혈장 세포 (PCS)로 분화 할 수 림프 여포로 이동한다. 대부분 PB들 / PC는 혈류로 송신하는 동안 거의 결국 장수의 PC (1)로 단말 분화를 거치도록 골수에 존재. 순환 B 세포는 이종이며, 정상 상태에서, PB들 / PC는 말초 혈액 2 드물다. 계통 특정 표면 마커의 사용 가능성의 결과로, 유동 세포 계측법 말초 혈액 내의 B 세포의 서브 세트의 식별 및 특성화를위한 대중적인 방법이되었다. 흐름 cytometr의 확장 응용 프로그램Y는 고순도의 분리 및 B 세포의 서브 세트 각각의 분리를 허용하는 셀 소터 기능의 추가이다. 인간 순환 B 세포는 일반적으로 세 가지 주요 부분 집단으로 분류 다양한 발달 단계에있는 특정 표면 수용체의 발현에 근거 : 기억 세포 (CD19 + CD27 + CD38 -) 나이브 B 세포 (- - CD38 CD19 + CD27) 및 PB들 / PC를 (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (그림 1). 본래 순진한 B 세포는 Ag로 발생하지 않았습니다. 그러나, 그들은 + CD27 + IgM의 기억 세포로 분화 될 수있다. 나이브 B 세포는 B 세포 항원 수용체 (BCR) -associated 분자 (예를 들어, CD19, CD20 및 CD22) 그들의 면역 레퍼토리 5 이질적 표현에서 균일하지만. CD27 + 기억 세포의 대부분은 CD27로 분화 될 수있다+ / 하이 CD38 + PB들 / PC를 6. 또한, 기억 세포 PBS를 / PC는 폴리 클로 날이고 발달 및 기능 4-7 이질성을 나타낸다. 순환 PB들 / PC는 일반적으로 수명이 짧은하고 CD138을 표현하지 않지만, 골수에 정착 만든 사람들은 말기 차별화하고 수명이 긴 될 것입니다. 말기 차별화 된 PC는 CD138을 표현하고 그 표면 8 CD27 분자를 하향 조절한다. PB들과 PC 모두 복근을 분비 할 수 있기 때문에, 많은 경우에 그들은 집합의 ASC로 표시된다. 대조적으로, 항원에 노출 된 적이없는 B 세포 나 기억 세포도 복근 9-10의 상당한 양을 생산할 수있다. 적절한 배양 조건 (6), 11-15에 위치 할 때 십일 - 절연 경우 역시, 양쪽 나이브 메모리 B 세포는 3의 ASC로 분화 될 수있다. 사실,의 ASC는 그 직접 고립 된 프랑스와 CD27과 CD38의 체외 분화 공유 유사한 표면 표현에서 파생 된톰 말초 혈액 (6). 또한, 시험관 내에서 분화의 ASC는 PB들 / 6 PC의 순환 유사한 표면 CD20의 낮은 레벨을 표현한다. 문화 유래의 ASC 모든 수명이 짧은 있지만, 그들은 기능적 능력과 체액 성 면역에 기여 할 수 있음을 나타냅니다 복근을 분비 할 수 있습니다. 지금까지와 가장 일반적으로 적용되는 방법은 체액 성 면역 반응에 대한 기능 정보를 획득하여 ELISA 및 ELISPOT 모두이다. ELISA 96 웰 플레이트 기반 분석이며, 자주 혈청 AG-특정 복근 및 기타 분석 (예, 사이토 카인)의 역가를 측정하는데 사용된다. 그것은 편리하고 확장 가능합니다. ELISA는 액체 시료 (16)에, 절대치 또는 혈청과 같은 다른 물질의 존재를 검출하기 위해 고상 효소 분석을 사용하도록 설계된다. 혈청의 ELISA를 판독 널리 신체의 면역 반응을 나타내는 데 사용되었다. 재 취득에 필요한 도구ELISA 분석에서 adouts는 분광 마이크로 플레이트 리더입니다. 독자는 일반적으로 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) - 컨쥬 게이트 검출 복근 특정 기판 (17)의 반응으로부터 생성 된 최종 생성물의 광학 밀도 (OD)를 결정할 수있다. 체액 성 면역 반응을보고와 관련하여, ELISA에 의해 결정 혈청 구간 레벨은 본문에서의 ASC의 집단했지만 개별없는 성능을 나타낸다. 또한, ELISA 계정으로 복근을 분비하지 않는 메모리 B 세포에 의해 참여를 취할 수 없습니다. ELISA와 마찬가지로, ELISPOT은 검출 및 말초 혈액 샘플 17 ~ 18에서 면역 반응을 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법이다. ELISPOT는 샌드위치 ELISA에 관한 기술이다. 그것에서, 세포는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 단기 배양 용 96 웰 마이크로 플레이트의 막 역행 웰에 배치된다. ELISPOT 분석은 마이크로 및 developin에 웨스턴 블로 팅을 수행하는 유사g 각 웰의 PVDF 막에있는 관광 명소입니다. 자동화 ELISPOT 리더 시스템 또는 수동 계산을위한 실체 현미경이 필요합니다. 면역 반응을 검출 ELISPOT에서의 가장 큰 장점의 ASC 및 사이토 카인을 분비하는 세포의 정량화는 뛰어난 감도이다. 그것은 각각 체액 성 및 세포 성 면역에 기능적 활동을보고합니다. 체액 성 면역 기능의 측정에는, ELISA 및 ELISPOT 열거의 ASC의 수에 의해 결정 혈청 구간 레벨들은 상관되어 있지만, 이들 두 분석으로부터의 데이터 판독 기능은 영향 19-20에서 약간의 차이가있다. ELISPOT의 가장 큰 장점은 방법의 감도입니다. 복근의 적절한 이소 타입의 알려진 양이 참조 용으로 포함되고 ELISA에 의해보고 된 혈청 구간 역가 수준 농도 판독으로 더 정량적으로 상대 구간 레벨을 나타내는, OD 판독으로 반 정량적으로 제시하거나한다. 반대로, ELISPOT의 결과이다 presente관심의 세포 풀의 ASC의 절대 수와 D (예를 들어, 분획 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 한 PBMC로부터 정제 된 B 세포). ELISPOT은 하나의 ASC를 감지 할 수 있지만, ELISA 전에 측정에 최적화 된 분석에 의존하는 농도에 도달의 ASC에서 Ab의 금액이 필요합니다. 따라서, ELISPOT은 정량 감도 ELISA에 분명 우수하다. 또한, ELISPOT은 활성화 기억 세포의 체외 분화의 ASC 정량화에 적합하다. 메모리 B 세포는 복근을 분비하지 않지만 활성화시의 ASC로 분화 할 수 있습니다; 그들은 따라서 ELISA에 의해 검출 된 혈청 복근에 기여가 없습니다. 따라서, ELISPOT 배양에서 활성화 후 기억 세포 순환의 면역 반응의 측정에있어서 선택의 방법이다. 이는 장기 체액 면역의 유지의 모니터링을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>10 mL 튜브</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>내독소가 없는</td></tr><tr><td>트리판 블루 0.5% 용액</td><td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag Human B 림프구 농축 세트</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>클론 O323</td></tr><tr><td>Streptavidin 자기 마이크로 비즈</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 팔콘 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>블루 나일론 메쉬 셀 스트레이너, 40 &mu; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>클론 HIB19</td></tr><tr><td>Anti-human CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>클론 O323</td></tr><tr><td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>클론 HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>클론 HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>클론 HI30</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td>클론 HI30</td></tr><tr><td>안티 마우스 / 마우스 / 인간 CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td><td>클론 LG.3A10</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>클론 L128</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>클론 LT19</td></tr><tr><td>항인간 CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>클론 LT19</td></tr><tr><td>안티휴먼 CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>클론 2H7</td></tr><tr><td>비오틴화 항인간 CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>클론 O323</td></tr><tr><td>비오틴화 항인간 CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>클론 O323</td></tr><tr><td>7-아미노악티노마이신 D (7-AAD)</td><td>BD 생명과학</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>B형 CpG</td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A of S. aureus Cowan(SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitogen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen 필터 플레이트, 0.45 &micro; m 기공 크기</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>소수성 PVDF 멤브레인이 있는 멸균 투명 96웰 필터 플레이트</td></tr><tr><td>BCIP/NBT 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT 단일 시약, 알칼리성 인산가수분해효소 기질</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG, Fc fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 염소 항인간 Ig (IgG + IgM + IgA)의 단편</td>Jackson <td>ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>염소 항인간 IgG-알칼리성 인산가수분해효소, Fc&gamma; 단편 특이적</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>염소 항인간 IgM-알칼리성 인산가수분해효소, Fc&micro; 단편 특이적</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-인간 IgG-과산화효소, Fc&gamma; 단편 특이적</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-인간 IgM-과산화효소, Fc&micro; 단편 특이적</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC 기판 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. ImmunoSpot 분석기</td><td>씨티엘</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 b 세포를 항체가 분비 : elispot을 체액 면역의 기능 판독으로

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

체액 면역의 특징은 합성과 같은 병원체 항원은 (Ag), 특정 복근을 분비하고, 숙주 방어를 위해 사용되는 기능의 ASC를 생성하는 것이다. 개별의 체액 성 면역 반응의 기능적 상태의 정량, 혈청 복근 순환의 ASC는 모두 공통 기능 판독으로서 측정된다. 인간 말초 혈액 호스트 B 세포에 의해 유도 체액 성 면역 반응의 측정에 사용할 수있는 가장 편리하고 용이하게 접근 샘플이다. 의 ASC를 포함하여 고유 한 B 세포 하위 집합은, 유동 세포 계측법으로 정렬 혈통 특정 AB-접합 마이크로 비드 또는 셀을 통해 선택을 통해 말초 혈액에서 직접 분리 할 수있다. 또한, 정제 순진한 및 메모리 B 세포 활성화와 문화의 ASC로 분화 될 수있다. 구간 분비에 기여할의 ASC의 기능적 활동을 집광 효소 분석법 인 ELISPOT에 의해 정량화 될 수있다-linked immunoabsorbance 분석 (ELISA)과 웨스턴 블로 팅 기술은 단일 세포 수준에서 개인의 ASC의 열거를 활성화합니다. 실제로, ELISPOT 분석 점점 때문에 혈액 샘플을 다수의 취급 용이성 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 말초 혈에서 인간 B 세포를 분리하는 방법은 시험관 내에서의 ASC로 B 세포의 분화, 총 IgM-과의 IgG-의 ASC의 정량 ELISPOT 고용 여기에 설명 될 것이다.

PBMC를이 적혈구 및 부착 세포 (1.7-1.2 단계)의 고갈되었다. 세포의 분취 량 (2 × 106)의 말초 혈 (도 1)의 B 나이브 세포, 메모리 B 세포, PBS를 / PC를 모집단을 설명하기 위해 유세포 분석을 행 하였다. 이 공여자의 PBMC를, 상기 림프구의 약 10 %가 CD19 + B 세포이다. ㄴ 세포 구획에서 CD19 + CD27의 비율 - 나이브 B 세포는 약 50 %였다. 한편, CD19 + B 세포의 약 50 %가 25 ~ 26는 CD27 + B 세포의 메모리 (7)였다. 참고로, CD27 + B의 메모리 셀은 상기 IgD의 (4)를 포함하여 분리 될 수있다. 2, 30 ~ 31 ...

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

본 ELISpot 방법론의 전반적인 목표는 혈액 내 인간 항체 분비 B 세포를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 B 세포의 면역학 및 백신 연구와 관련하여 바이오 의료 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 항체 분비 B 세포를 단일 세포 수준에서 검출하고 측정할 수 있다는 점입니다.시연은 저희 연구실의 대학원생인 Tsung-Chih Tseng이 진행하겠습니다. potassium이 첨가된 EDTA가 포함된 15 ml 튜브에 정중팔주정맥으로부터 10 ml의 혈액 샘플을 채취한 즉시, 혈전 형성을 방지하기 위해 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 그 후, 세포에 오토클레이브 멸균된 적혈구 용해 버퍼(red blood cell lysis buffer) 35 ml를 첨가하여 상온에서 5분 동안 배양합니다.튜브를 통해 빛이 보이면, 혈액을 원심분리하여 흰색 펠릿이 형성되었는지 확인하십시오. 10 ml의 멸균 PBS로 잔류 용해 버퍼를 제거하고, 펠릿을 10 ml의 RPMI 1640 배지에 다시 현탁하십시오. 세포를 10 cm 배양 접시에 분주하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 배양하십시오.그런 다음 배양 접시를 몇 번 부드럽게 흔들어 부유 세포를 플라스틱 15 ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 원심 분리를 통해 두 번 세척한 후, 200 µL의 차가운 PBS 완충액으로 펠렛을 10⁶ cells/ml 농도의 0.5~1배 수준으로 재현탁하고, 10⁵ cells당 5 µL의 혈구 세포 특이적 비오틴화 항인체 항체 칵테일을 첨가합니다. 얼음 위에서 30분간 배양한 후, 10배 과량의 멸균 PBS로 세포를 세척하고, 10⁵ cells당 5 µL의 스트렙타비딘 결합 마이크로비즈에 펠렛을 재현탁하여 얼음 위에서 30분간 배양합니다.배양이 끝나면 세포에 PBS 버퍼 2 ml를 첨가하고, 튜브를 자석 스탠드에 올려 실온에서 8분 동안 둡니다. 마이크로 비즈가 튜브 벽에 부착되면 상층액을 새 원추형 튜브로 조심스럽게 옮기고, 세포에 PBS 버퍼 2 ml를 추가로 첨가합니다. 두 번째 상층액 수집 후, 원심분리를 통해 모아진 세포를 회수하여 5 ml 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 세포 농도의 1/10 수준인 신선한 PBS 버퍼를 추가합니다.비특이적 블로킹을 수행한 후, 선택한 각 항체 1 µg을 세포 $6 \times 10^5$개가 담긴 튜브에 넣고 부드럽게 혼합하여 얼음 위에서 3

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

특발성 질환에 적응 면역의 미생물 목표 식별은 효소 연결된 immunospot 분석을 사용하여 수행할 수 있습니다.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

이 동영상에서는 non-B 세포 및 스트렙타비딘 접합 자성 마이크로비드에 특이적인 비오틴화 항체를 사용하여 인간 말초 혈액에서 B 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

인간 말초 혈액에서 B 세포의 분리 및 정제

이 비디오에서는 인간 말초 혈액 B 세포에서 naive B cell, memory B cell 및 plasmablast plasma cell subpopulation의 유세포 분석 기반 분류를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 서로 다른 B 세포 하위 집단은 B 세포 표면에서 발현된 CD19, CD27 및 CD38 수용체에 대한 형광단 기반 항체 결합에 따라 구별된 후 세포 분류를 기반으로 구별할 수 있습니다.

다양한 순환 B 세포 집단에 대한 유세포 분석 기반 세포 분류

이 동영상은 항체를 분비하는 B 세포(ASC)의 기능을 평가하기 위해 ELISpot 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. ASC에 의해 분비된 항체는 효소 접합 IgG 또는 IgM 항체에 의해 검출되는 막 결합 다클론 항체 단편과 상호 작용합니다. 각 웰에서 생성된 착색된 반점은 특정 항체의 동형이 존재함을 나타내며, 이는 B 세포의 분비 활동과 관련이 있습니다.

ELISpot Assay를 사용한 항체 분비 B 세포의 기능 평가

이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

전혈 기반 면역분석은 진단 및 연구 목적으로 항원 특이적 면역을 분석할 수 있는 간편하고 자원 효율적인 도구를 제공합니다. 이 기사는 소아 환자 및 소동물을 위한 소량 버전을 포함하여 진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 포괄적인 분석을 위해 이중 공동 자극을 갖춘 최적화된 전혈 기반 프로토콜을 제공합니다.

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

학습하세요 ELISpot을 이용하여 인간 혈액에서 항체 분비 B 세포를 분리 및 정량화하는 방법을. 단일 세포 수준에서 면역 반응을 분석하여 백신 효능 연구에 활용할 수 있습니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

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