분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

이 ELISpot 방법론의 전반적인 목표는 혈액에서 인간 항체 분비 B 세포를 정량화할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 B 세포의 면역학 및 백신 연구에 대한 생물 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 수준에서 항체 분비 B 세포를 검출하고 측정할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Tsung-Chih Tseng입니다. 정중 큐비탈 정맥에서 10ml의 혈액 샘플을 채취하여 칼륨 보충 EDTA가 포함된 15ml 튜브에 넣은 직후 튜브를 여러 번 뒤집어 혈전 형성을 방지합니다. 그런 다음 35ml의 오토클레이브 적혈구 용해 완충액을 세포에 추가하여 실온에서 5분 동안 배양합니다.

튜브를 통해 빛이 관찰되면 혈액을 원심분리하고 흰색 펠릿의 존재를 확인합니다. 10ml의 오토클레이브 PBS로 잔류 용해 완충액을 제거하고 10ml의 RPMI 1640 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 10cm 배양 접시에 세포를 플레이트하여 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 이산화탄소 5%

그런 다음 배양 접시를 부드럽게 몇 번 휘젓고 떠 다니는 세포를 플라스틱 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 원심분리로 2회 세척한 후, 200마이크로리터의 차가운 PBS 완충액에 ml당 6개 세포 농도의 5-10배로 펠릿을 다시 현탁시키고 6번째 세포의 1/10/1당 혈액 세포에 특이적인 5마이크로리터의 비오틴화된 항인간 항체 칵테일을 첨가합니다. 얼음에서 30분 배양 후, 10배 이상의 멸균 PBS로 세포를 세척하고 얼음에서 30분 배양을 위해 6개 세포의 1/10당 5마이크로리터의 스트렙타비딘 접합 마이크로 비드에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

배양이 끝나면 PBS 완충액 2ml를 세포에 추가하고 튜브를 실온에서 8분 동안 자기 스탠드에 놓습니다. 마이크로 비드가 튜브 벽에 부착되면 상층액을 새 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮기고 세포에 PBS 완충액 2ml를 더 추가합니다. 두 번째 상등액 채취 후, 원심분리를 통해 풀링된 세포를 수집하고 세포를 ml당 7개 세포 농도의 1/10 곱하기 농도로 5ml 폴리스티렌 튜브와 새로운 PBS 완충액으로 이동합니다.

비특이적 차단을 전처리 한 후, 6개 세포의 1/10 곱하기당 각 선택 항체 1마이크로그램을 얼음에서 30분 동안 배양하기 위해 부드럽게 혼합하여 튜브에 추가합니다. 배양의 마지막 5분 동안 5마이크로리터의 7-AAD를 세포에 추가합니다. 그런 다음 원심분리하기 전에 2밀리리터의 신선한 PBS를 세포와 와류에 첨가합니다.

펠릿을 1밀리리터당 7개 세포 농도의 10분의 1에서 5배로 새 분류 버퍼에 다시 현탁시키고 40미크론 세포 여과기를 통해 세포를 새로운 5리터 폴리스티렌 튜브로 여과합니다. 그런 다음 유세포 분석을 통해 세포를 5ml의 새로운 RPI 배지가 들어 있는 3개의 15ml 튜브로 분류하여 비접촉 B 세포, 기억 B 세포 및 형질아세포 세포를 수집합니다. 모든 세포를 수확한 후, 새로운 RPMI 배지에서 밀리리터당 5번째 세포 농도의 1-10배로 12웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 서브셋을 파종합니다.

다음으로, 세포 배양 인큐베이터에서 5일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 웰당 1밀리리터당 6번째 세포의 1/10 곱하기 5마이크로그램의 CPG ODN 2006으로 B 세포를 활성화합니다. 활성화가 끝나면 30마이크로리터의 35% 에탄올과 증류수를 ELISpot 플레이트의 각 웰에 30초 동안 추가합니다. 그런 다음 각 웰의 에탄올을 150마이크로리터의 오토클레이브 이중 증류수로 교체하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양하여 잔류 에탄올을 제거합니다.

PBS 세척을 수행한 후 각 웰에 항인간 IG의 다클론 FAB2 단편 50마이크로리터를 추가합니다. 방금 시연한 대로 PBS로 접시를 두 번 씻습니다. BSA가 함유된 200마이크로리터의 신선한 PBS로 각 웰의 비특이적 결합을 실온에서 2시간 동안 차단합니다.

또 다른 PBS 세척 시리즈 후, 섭씨 37도에서 100마이크로리터의 신선한 RPMI 1640 배지에 웰을 배양합니다. 그런 다음 각 ELISpot 웰의 배지를 적절한 수의 활성화된 B 세포로 교체합니다. 새 RPMI 배지를 사용하여 각 웰의 최종 부피를 150마이크로리터로 가져온 다음 ELISpot 플레이트를 8-14시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.

배양 기간이 끝나면 배지를 버리고 200 마이크로 리터의 PBS와 tween20으로 웰을 세척하여 3 분 동안 5 회 세척합니다. 마지막 세척 후 해당 웰에 적절한 검출 항체를 추가하고 어둠 속에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다른 PBS 세척 시리즈 후 실온에서 5-15분 동안 각 웰에 50마이크로리터의 BCIPMBT 기질을 추가합니다.

보라색 반점이 나타나면 우물당 100마이크로리터의 이중 증류수로 반응을 중지하고 흐르는 수돗물로 플레이트를 헹굽니다. 그런 다음 빛으로부터 보호되는 ELISpot 멤브레인을 자연 건조합니다. 이 기증자 PBMC 샘플에서 적혈구 용해 및 부착 세포 고갈 후 림프구의 약 10%가 CD19 양성 B 세포였습니다.

B 세포 구획에서 세포의 약 50%는 CD27 음성 비진 B 세포였고 50%는 기억 B 세포를 발현하는 CD27이었습니다. 정제된 인간 B 세포와 CD19+CD27+를 5일 동안 CPG 처리하면 일반적으로 50-200개의 IgM 및 10-50개의 IgG 항체 분비 세포가 1배에서 10배에서 4번째로 활성화된 B 세포가 생성됩니다. 이 ELISpot 기법을 숙달하면 제대로 수행한다면 3시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시작하기 전에 항체 분비 세포를 검출하기 위한 적절한 포획 시약으로 장소를 코딩하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 백신학 분야의 연구자들이 대규모 임상시험 및 종단 추적 조사에서 백신 효능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 혈액에서 인간 B 세포를 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

분화를 위해 naive B cell과 memory B cell을 분리하고 ELISpot 에세이를 수행하여 항체 분비 세포를 검증합니다. 사람의 혈액을 다루는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.