셀을 별 모양으로 일곱 단계

이 절차의 전체적인 목표는 마우스 간에서 간 성상 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 소화 효소를 이용해 마우스 간에 두 차례 관류를 수행함으로써 이루어집니다. 관류 후, 다음 단계로 진행되는 인비트로(in vitro) 소화의 효율을 높이기 위해 간을 작은 조각으로 절단합니다.

마지막 단계로, 밀도 구배 원심분리를 통해 간 성상세포를 다른 간 세포 유형으로부터 분리합니다. 최종적으로 간 성상세포를 얻으며, 광학 및 면역형광 현미경을 통해 그 순도를 평가할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 연구실 대학원생인 Patrick Meyer가 진행하겠습니다. 마우스 간의 NC 2 관류를 준비하기 위해, 먼저 SC 1 버퍼와 효소 관류액을 37 °C 항온수조에서 가온하십시오.

다음으로, 연동 펌프를 설정하여 분당 6.5 milliliters의 층류가 흐르도록 하고, 펌프의 실리콘 튜브를 SC one 용액으로 평형화합니다. 이제 반사 소실을 통해 마취된 마우스가 깊게 진정되었는지 확인합니다. 그런 다음 마우스를 적절한 받침대 위에 배와 윗면이 위로 오도록 고정합니다.

가위와 핀셋을 사용하여 복부 피부를 세로로 절개하고 복막을 노출시킵니다. 복막을 조심스럽게 열고 간문맥을 노출시키기 위해 장을 복강 밖 동물의 왼쪽으로 옮깁니다. 이 과정에서 가장 까다로운 부분은 소화 효소를 이용한 간의 제로 관류(zeto perfusion) 단계이며, 이에 대해 시연하겠습니다.

다음으로, 캐뉼라를 삽입할 때 실체 현미경을 사용하고 관류 동안 간 구조의 변화를 면밀히 관찰하는 것이 중요합니다. 실체 현미경 하에서 주입 세트의 캐뉼라를 문맥에 삽입하십시오. 30 mL의 SC one 용액으로 간 관류를 시작하십시오. 흐름이 시작된 직후 하대정맥을 절개하십시오.

간의 성공적인 세척은 간 조직의 색이 빠지는 것으로 확인할 수 있으며, 이어서 30 milliliters의 Pronase E 용액으로 간을 관류합니다. Pronase E 용액 관류 후에는 간엽이 팽창하고 캡슐을 통해 간소엽이 뚜렷하게 보이며, 이어서 30 milliliters의 collagenase P 용액으로 관류합니다. collagenase P 관류가 완료되면, 횡격막 및 주변 장기에서 조심스럽게 절제하여 간을 적출한 후, 얼음 위에 놓인 70 milliliters의 SC two 용액에 보관합니다.

이 시점에서 간은 형태가 무너져 긴장도가 없고 무정형으로 보입니다. 마우스 간의 소화 절차는 무균 상태에서 수행되어야 합니다. 층류 정화 작업대(laminar flow hood) 내에서 진행하십시오.

날카로운 가위로 간을 약 2×2×2mm³ 크기의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 70mL의 SC 2 현탁액과 간 조각을 50mL의 protease E collagenase P 용액과 혼합합니다. 1mL의 dna, one solution을 첨가하고 37°C에서 교반하며 간을 20분 동안 소화시킵니다.

간 조직의 효소 소화 후, 밀도 구배 원심분리를 통해 성상세포를 다른 간세포 유형으로부터 분리합니다. 이 과정을 시작하려면, 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 팔콘 튜브 6개에 여과하고, E2 버퍼로 세포를 세척한 뒤 600 G, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 각 튜브에서 상층액 40 mL를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 각 튜브에 DNA's, one 솔루션 150 µL를 첨가하고 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 50 mL Falcon 튜브 4개에 모으고, 600 Gs, 4 °C에서 10분 동안 G-B-S-S-P 원심분리기로 세척합니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 최대한 흡입하여 제거한 후, 각 튜브에 DNAs one 솔루션 150 µL를 첨가합니다.

튜브당 10 mL의 G-B-S-S-B에 세포 펠렛을 부유시킵니다. 세포들을 두 개의 50 mL falcon tube에 합치고, 튜브당 총 부피가 36 mL가 되도록 G-B-S-S-B를 추가합니다. 각 튜브에 14 mL의 den solution을 넣고 잘 섞습니다.

다음으로, 세포 현탁액 10 milliliters를 12 milliliter 밀도 구배 원심분리 튜브 하나에 옮겨 총 10개의 튜브를 준비합니다. 각 튜브의 세포 현탁액 위에 G-B-S-S-B 1.5 milliliters를 조심스럽게 층을 이뤄 가합니다. 가속 및 감속 단계 없이 1500 Gs, 4 °C에서 15분 동안 구배 원심분리를 수행합니다.

그 후, 간세포는 튜브 바닥에 펠릿 형태로 가라앉고, 성상세포는 인터페이스에 하얀 고리 모양으로 형성됩니다. 5 mL 피펫을 사용하여 성상세포가 포함된 인터페이스 층을 조심스럽게 채취하여 50 mL 튜브로 옮깁니다. G-B-S-S-B를 첨가하고 4 °C에서 600 Gs로 10분간 원심분리하여 세포를 세척합니다.

상층액을 흡입하여 제거하고 보충제가 포함된 DMEM 20 milliliters에 세포를 재부유시킵니다. 세포 수를 측정한 후, cm²당 2 × 10⁴ cells의 농도로 조직 배양 플라스크에 옮겨 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 준비 후 약 2시간이 지나면 간성상세포가 부착되며, 이때 배지를 교체하여 사멸한 세포와 세포 잔해를 씻어냅니다.

세포를 인큐베이터로 옮깁니다. 이 프로토콜을 사용하여 마우스 간에서 간성상세포를 준비한 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 시험관 내 배양 1일 차와 3일 차의 세포는 간성상세포의 특징적인 형태를 보여줍니다. 이들은 성상세포 모양이며 지질 소포의 저장을 나타냅니다.

핵심 부위에서 분리된 간성상세포의 순도는 glial fibrillary acidic protein 또는 GFAP의 발현을 통해 검증할 수 있습니다. 이 영상들은 세포 분리 후 3일 동안 배양한 간성상세포에서 적색으로 나타나는 GFAP의 대표적인 면역형광 염색 결과를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 순수한 성상세포를 충분히 얻기 위해 쥐의 간에서 간성상세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

간 관류 시 효율적인 소화를 보장하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 간의 dal 세포의 형태와 표현형을 평가함으로써 분리된 세포의 적절한 정체성을 결정하는 것이 필수적입니다.