셀을 별 모양으로 일곱 단계

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 간에서 간 성상 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 C에서 소화 효소가 있는 마우스 간의 두 번의 관류를 수행함으로써 달성됩니다. 관류 후, 간을 작은 조각으로 잘라 시험관 내 소화의 효율성을 높이고, 이는 다음에 수행됩니다.

마지막 단계로, 간 성상 세포는 밀도 구배 원심분리에 의해 다른 간 세포 유형과 분리됩니다. 궁극적으로 간 성상 세포를 얻고 그 순도를 광과 면역 형광 현미경으로 평가할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 실험실의 대학원생인 Patrick Meyer가 할 것입니다. NC를 준비하기 위해 마우스 간의 두 번의 관류를 먼저 섭씨 37도의 수조에서 SC one 완충액과 효소 관류 용액을 가열합니다.

다음으로, 연동 펌프를 설정하여 분당 6.5ml의 층류를 얻고 펌프의 실리콘 튜브를 SC 1 용액으로 평형을 이룹니다. 이제 반사 신경의 상실로 마취된 쥐가 깊이 진정되었다는 것을 확인하십시오. 그런 다음 적절한 베이스의 누운 위치에 마우스를 고정합니다.

가위와 집게를 사용하여 복부 피부를 세로로 절개하고 복막을 노출시킵니다. 조심스럽게 복막을 열고 창자를 복강에서 동물의 왼쪽으로 옮겨 문맥을 노출시킵니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 소화 효소와 함께 간의 제토 관류이며, 이는 입증 될 것입니다.

다음으로, 캐뉼라를 삽입할 때 실체 현미경을 사용하고 관류 중 간 구조의 변화를 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다.실체 현미경으로 작업하는 동안 주입 세트의 캐뉼라를 문맥에 삽입합니다. 30 ml의 SC one 솔루션으로 간의 관류를 시작하십시오. 흐름을 시작한 직후 Vanna Cava inferior를 엽니다.

간의 성공적인 내뿜기는 간 조직의 색깔의 손실에 의해 다음에, Pronase E 해결책의 30 밀리리터를 가진 간을 정독하는 것에 의해 나타납니다. 간엽이 부풀어 오르고 소엽이 캡슐을 통해 뚜렷하게 나타나며 30밀리리터의 콜라겐분해효소 P 용액이 관류된 프로나제 E 용액을 주입합니다. 콜라겐 분해 효소 P가 풍부하게 생성되면 횡격막과 주변 장기에서 간을 조심스럽게 해부하고 얼음 위의 SC 2 용액 70 밀리리터에 보관하여 쥐에서 간을 채취합니다.

이 시점에서 간은 형태를 잃고 아토닉하고 무정형으로 보입니다. 마우스 간의 소화 절차는 멸균 상태에서 수행되어야 합니다. 층류 후드에서.

날카로운 가위를 사용하여 간을 약 2x2x2입방밀리미터 조각으로 자릅니다. 다음 프로테아제 E collagenase P 해결책의 50 밀리리터를 가진 SC 2 및 간 조각 70 밀리리터의 현탁액을 결합하십시오. DNA 1 밀리리터를 첨가하면 1 용액이 섭씨 37도에서 20 분 동안 교반하면서 간을 소화합니다.

간 조직의 효소 분해 후, 성상 세포는 밀도 구배 원심분리에 의해 다른 간 세포 유형과 분리됩니다. 이 절차를 시작하려면 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 6개의 50ml 팔콘 튜브로 여과하고 E 2개의 버퍼 원심분리기로 600G 및 섭씨 4도에서 10분 동안 셀을 세척합니다. 원심분리 후 각 튜브에서 상층액 40ml를 조심스럽게 흡입합니다.

그런 다음 150마이크로리터의 DNA를 각 튜브에 하나의 용액으로 추가하고 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 4개의 50ml Falcon 튜브에 넣고 G-B-S-S-P 원심분리기로 600G 및 섭씨 4도에서 10분 동안 세척합니다. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 흡인하고 각 튜브에 150마이크로리터의 DNA를 한 용액씩 추가합니다.

우리는 튜브 당 10 밀리리터의 G-B-S-S-B에 세포 펠릿을 현탁시킵니다. 세포를 두 개의 50 밀리리터 팔콘 튜브에 모으고 튜브당 총 36 밀리리터 부피에 G-B-S-S-B를 추가합니다. 각 튜브에 14ml의 덴 용액을 넣고 잘 섞습니다.

다음으로, 10ml의 세포 현탁액을 하나의 12ml gradient 원심분리 튜브로 옮기면 총 10개의 튜브가 생성됩니다. 튜브당 1.5ml의 G-B-S-S-B로 셀 현탁액을 부드럽게 오버레이합니다. 1500Gs에서 15분 동안 섭씨 4도에서 중단 없이 그래디언트를 원심분리합니다.

그 후, 간세포는 튜브 바닥에서 펠릿화되는 반면, 성상 세포는 계면에서 흰색 고리로 발견됩니다. 5ml 피펫을 사용하여 성상 세포가 포함된 계면을 조심스럽게 채취하여 50ml 튜브로 옮깁니다. G-B-S-S-B를 첨가하고 600Gs와 섭씨 4도에서 10분 동안 원심융합하여 세포를 세척합니다.

상층액을 흡인하고 보충제로 20ml의 DMEM에 세포를 재현탁합니다. 세포를 계수 한 후, 평방 센티미터 당 네 번째 세포 중 10 배의 2 배 농도로 조직 배양 플라스크에 옮기고 섭씨 37도와 5 % 이산화탄소에서 세포를 배양합니다. 준비 후 약 2시간 후에 간 성상 세포가 부착되어야 하며 배지를 변경하여 죽은 세포와 세포 파편을 씻어내야 합니다.

세포를 인큐베이터로 되돌려 놓고, 이 프로토콜을 사용하여 마우스 간에서 간 성상 세포를 준비한 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 체외 배양 1일차와 3일차의 세포는 간 성상 세포의 특징적인 형태를 보여줍니다. 그들은 astro lichen 모양이며 지질 소포의 저장을 나타냅니다.

핵 부위별에서, 분리된 간 성상 세포의 순도는 신경교섬유산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 발현에 의해서도 검증될 수 있습니다. 이 이미지는 세포 분리 후 3일 동안 배양된 간 성상 세포에서 빨간색으로 표시된 GFAP에 대한 대표적인 면역형광 염색을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 순수한 성상 세포의 적절한 수율을 위해 뉴런 간에서 간 성상 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

간 관류 시 효율적인 소화를 보장하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 간 세포의 형태와 표현형을 평가하여 분리된 세포의 적절한 실체를 결정하는 것이 중요합니다.