Name: 셀을 별 모양으로 일곱 단계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 생쥐 간에서 별세포 간성세포를 분리하는 방법을 소화 효소 관류와 밀도 구심 분리를 통해. 이 기술은 순도 높은 세포 확보와 간 질환 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 바이오 메디컬 연구 및 NIH RO1 AI083426 - 01 (FW)에 우수 스미스 가족의 수상에 의해 투자되었다. 패트릭 Maschmeyer와 멜라니 Flach는 Boehringer Ingelheim 재단에서 박사 장학금 지원합니다.

C57BL / 6 생쥐 ~ 20 세 주 이상에서 사용해야합니다. 25-30g 무게 남성 마우스의 사용을 권장합니다. 별 모양의 세포의 수율은 셀 절연을 별 모양 이전에 2 개월 쥐에게 비타민 A - 농축 다이어트 먹이를 증가 수 있습니다. Balb / C 마우스에서 별 모양의 세포의 수율이 상당히 높은 반면 약 2x10 5 간장 별 모양의 세포는 하나의 C57BL / 6 마우스의 간장에서 정화 수 있습니다. 다음 프로토콜은 5 마우스로 조정됩니다. 동물 관리 및 실험이 승인 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 프로토콜에 따라 수행되었다. 1. 마우스 간은 현장의 재관류에서 소화 효소와 함께 <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 SC1 버퍼와 효소 재관류 솔루션을 따뜻하게. </li><li> 연동 펌프의 실리콘 튜브로 설정 날개 주입을 탑재합니다. </li><li> 간의 재관류 현장에서 사용되는 유량입니다 6.5ml/min의 층류 흐름을 얻기 위해 PBS로 펌프를 보정합니다. SC1 솔루션과 실리콘 튜브를 평형. </li><li> 케타민을 (90 MG / kg)과 Xylazine (10 MG / kg) 솔루션과 깊이 마취제를 투여함을 보장하기 위해 반사 손실 테스트 intraperitoneal 주사로 마우스를 마취. </li><li> 적당한 기지에 위로 향한 위치에 마우스를 수정. </li><li> 복부 피부에 세로 절개를 수행하고 복막을 폭로하기 위해 가위와 집게를 사용하십시오. </li><li> 조심스럽게 복막을 열고 포털 정맥을 노출하기 위해 동물의 왼쪽으로 복강의 내장을 이동합니다. </li><li> 포털 정맥에 주입 세트의 정맥을 넣습니다. 이 단계에 대한, stereomicroscope의 사용을 권장합니다. </li><li> 30ml SC1 솔루션으로 간의 재관류를 시작합니다. 즉시 흐름을 시작 후 베나 카바 하부를 엽니다. 간장의 성공 플러싱은 간 조직의 색깔의 손실로 표시됩니다. </li><li> 30ml Pronase 전자 솔루션으로 간을 Perfuse. 성공적으로 소화시 간 엽 (叶)이 팽창되며, lobules은 캡슐을 통해 뚜렷한 나타납니다. </li><li> 30ml Collagenase의 P 솔루션으로 간을 Perfuse. 이 시점에서 간은 그 모양을 잃고 이완증의 및 비정질 보인다 있습니다. </li><li> 신중하게 횡경막과 주변 장기에서 간장을 분리하고 그것은 얼음 70ml SC2 용액에 보관합니다. </li><li> 추가 생쥐에 대한 절차를 반복합니다. </li></ol> 2. 마우스 간은의 체외의 소화에 모든 추가 작업 단계 층류 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. <ol><li> 날카로운 가위를 사용하여 약 2x2x2mm 3 조각으로 간을 잘라. </li><li> Pronase E - Collagenase P 솔루션 50ml로 간 조각을 포함 70ml SC2의 정지를 결합하고 DNase I 솔루션의 1ml를 추가합니다. </li><li> 37 20 분 대한 간은을 소화 ° C가 감동하는 동안. </li></ol> 3. 밀도 기울기 원심 분리 장치 <ol><li> 6 50ml 팰컨 튜브로 70μm 셀 strainers 통해 세포 현탁액을 필터링하고 SC2 버퍼 50ml까지 추가할 수 있습니다. 600g 4 ° C.에 10 분에 대한 원심 분리기 </li><li> 조심스럽게 뜨는의 40ml를 대기음, 다음 각 튜브에 150μl DNase I 솔루션을 추가하고 세포를 resuspend. </li><li> 4 50ml 팰컨 튜브에 수영장 셀 suspensions과 600g 4시 10 분에 대한 GBSS - B, 원심 분리기로 씻어 ° C. </li><li> 조심스럽게 펠렛 각 튜브에 추가 150μl DNase I 솔루션을 방해하지 않고 최대한 뜨는의를 대기음. 튜브 당 10ml GBSS - B의 세포 알약을 Resuspend. </li><li> 수영장 2 50ml 팰컨 튜브에 세포 튜브 당 36ml의 총 볼륨 GBSS - B를 추가합니다. 각각의 튜브에 14ml Nycodenz 솔루션을 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 총 10 튜브의 결과로 하나 12ml 기울기 원심 분리 튜브에 세포 현탁액의 10ml를 전송합니다. 부드럽게 1.5ml GBSS - B 당 튜브와 세포 현탁액을 오버레이. </li><li> 1,500그램 4에서 15을 위해 그라디언트를 원심 ° C 브레이크없이. 별 모양의 세포가 흰색 고리로서 계면에서 발견되는 반면, 그 후, hepatocytes는 튜브의 하단에 pelleted 것입니다. </li><li> 조심스럽게 별 모양의 세포를 포함하는 계면을 수확하고 GBSS - B와 함께 그들을 씻고, 600g, 4에서 원심 분리기를위한 10 분 ° C. </li><li> 뜨는을 대기음와 10 %의 열 inactivated FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2mM L - 글루타민, 1mM 나트륨 pyruvate 및 10mM HEPES와 보충 20ml DMEM에있는 세포를 resuspend. 2x10 4 셀 / cm 2 농도와 조직 문화 flasks에 세포를 전송합니다. 37 ° C와 5% CO 2에있는 세포를 품어. </li><li> 즉시 간장 별 모양의 세포가 죽은 세포와 세포 부스러기를 씻어 (약 2 시간 준비 후) 자기편 그대로 미디어를 변경합니다. </li><li> 다음 날, 별 모양의 세포에S는 perinuclear 비타민 A - 저장 지질 vesicles과의 특성 별 모양의 형태를 개발해야합니다. </li><li> 후속 실험, 간장 별 모양의 세포는 쉽게 같은 Accutase, 예를 들어 같은 가벼운 효소 솔루션을 사용하지 않는 코팅 플라스틱 표면에서 분리 수 있습니다 </li></ol> 4. 대표 결과 : 제공된 프로토콜을 사용하여 간장 별 모양의 세포의 준비 다음, 고립된 인구의 순도는 이러한 glial fibrillary 산성 단백질의 스타와 같은 모양, perinuclear 지질 방울, 그리고 표현 (GFAP로 세포 유형의 세 가지 주요 특성을 고려하여 테스트를 수 ). 특성 세포 분리 후 간장 별 모양의 세포의 2 시간의 외관뿐만 아니라 체외 문화의 날 1 3에 대한 대표적인 사진은 그림 1에 묘사된 있습니다. 그림 2는 세포 격리 다음 3 일간 교양되었습니다 간장 별 모양의 세포에서 GFAP에 대한 대표 immunofluorescence 염색법을 보여줍니다. 간장 별 모양의 세포는 체외 문화 중에 myofibroblastic 세포로 구별. 이러한 활성 별 모양의 세포의 특성 특징은 알파 평활근 굴지 (αSMA)의 표현이다. 그림 3은 체외 문화의 날 7 활성화 별 모양의 세포에 aSMA과 마이 오신 IIA에 대한 immunofluorescence 염색법을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 간성 별 모양의 세포의 특성 형태. 별 모양의 세포가 제공하는 프로토콜을 사용하여 마우스 간은으로부터 격리되었다. 이미지가 별 모양의 세포가 세포 격리 후 2 시간 (A, B)뿐만 아니라 1 일 (C)와 체외 문화의 3 일 (D)에 대한 묘사. 간장 별 모양의 세포가 perinuclear 사이트에서 지질 vesicles 높은 금액을 전시하고 체외 문화의 첫 번째 일 (확대 200x) 동안 자신의 특유의 아스트랄과 같은 형태를 취득. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 간성 별 모양의 세포는 특히 간장에 GFAP을 표현. 별 모양의 세포는 체외 문화의 날 3 격리 및 immunofluorescently GFAP (적색)에 얼룩했다. 세포 핵은 파란색 (Hoechst는 얼룩)에 그려져있다. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 간 별 모양의 세포가 myofibroblasts로 구분. C57BL / 6 마​​우스에서 분리된 간장 별 모양의 세포는 7 일 교양되었습니다. 그 후, 그들은 챔버 슬라이드로 전송하고 aSMA (빨간색으로 표시)과 마이 오신 IIA (녹색에 묘사된)에 얼룩했다. 세포 핵은 Hoechst (파란색)과 counterstained되었습니다. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> SC1 버퍼 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 190mg </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 900mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1M 재고 솔루션 10 ML </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 X 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 X H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> 페놀 레드 </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 1리터까지 작성 </td></tr><tr><td colspan="2"> SC2 버퍼 </td></tr><tr><td> CaCl 2 X 2 시간 2 O </td><td> 560mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1M 재고 솔루션 10ml </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 X 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 X H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> 페놀 레드 </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 1리터까지 작성 </td></tr><tr><td colspan="2"> GBSS - 버퍼 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> CaCl 2 X 2 시간 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 X 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 X 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 X 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> 페놀 레드 </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 1리터까지 작성 </td></tr><tr><td colspan="2">GBSS - B 버퍼 </td></tr><tr><td> CaCl 2 X 2 시간 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 X 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 X 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 X 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> 페놀 레드 </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 1리터까지 작성 </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase 전자 재관류 솔루션 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 100mg (4000 PU / MG 분) </td></tr><tr><td> SC2 버퍼 </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Collagenase P 재관류 솔루션 </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 85mg (1.78 U / MG lyo) </td></tr><tr><td> SC2 버퍼 </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E - Collagenase P 솔루션 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 50mg (4000 PU / MG 분) </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 85mg (1.78 U / MG lyo) </td></tr><tr><td> SC2 버퍼 </td><td> 50ml </td></tr><tr><td colspan="2"> DNase I 솔루션 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 6mg (ca. 2000U/mg) </td></tr><tr><td> GBSS - B </td><td> 3ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nycodenz 솔루션 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> 8g </td></tr><tr><td> GBSS - A </td><td> 28ml </td></tr></tbody></table> 표 1. 버퍼와 간장 별 모양의 세포의 분리에 필요한 효소 솔루션을 제공합니다. 모든 버퍼의 산도는 7.3-7.4로 조정해야합니다. 또한, 모든 버퍼의 무균 여과 권장합니다. 해당 효소 활동에 따라 사용되는 효소의 양을 적응하는 것이 중요합니다.

<ol><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Geerts, A. H. istory <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li>
<li>Gressner, A. M. &amp, Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li>
<li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li>
<li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li>
<li>Minicis, S. D. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li>
<li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers%3A+distinct+roles+of+%28myo-%29fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

간장 별 모양의 세포는 간장에 필수적인 생리와 pathophysiological 프로세스를 조절. 또한, 별 모양의 세포가 그들에게 간장 면역 반응의 중요한 구성 요소를 렌더링, 항원 제시 속성을 보유하고 있습니다. 간장 별 모양의 세포가 간 세포에있는 전체 번호 10~15%을 구성하지만, 이러한 세포의 격리는 쭉 내려 가래의 perisinusoidal 공간에서 자신의 로컬 라이제이션으로 인해 도전이다. 여기 현장 소화와 후속 구배 원심 분리에 의해 마우스 간은에서 간장 별 모양의 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 immunologic의 assays에 적합한 매우 순수 별 모양의 세포의 절연을 허용합니다. 고립된 세포의 실체는 별 같은 모양, perinuclear 비타민 A - 저장 지질 vesicles 및 GFAP의 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 세 가지 주요 특...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 70μm 셀 스트레이너 </td><td> BD </td><td> 352350 </td></tr><tr><td> CaCL 2 X 2 시간 2 O </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 로체 </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11,960 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 로체 </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 16,000 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> 기울기 원심 분리 튜브 </td><td> 그라 이너 바이오 원 </td><td> 163160 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15,630 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O X </td><td> Fluka </td><td> 63,068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O X </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 X 2 시간 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71,643 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 X H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71,507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71,628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td></tr><tr><td> 연동 펌프 </td><td> 콜 파머 </td><td> HV - 7523-70 </td></tr><tr><td> 페놀 레드 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> 실리콘 튜브 </td><td> Masterflex </td><td> HV - 96440-14 </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Gibco </td><td> 11,360 </td></tr><tr><td> 조직 문화 플라스크 (25cm 2) </td><td> BD </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> 빙게드 주입 세트 </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Seven Steps to Stellate Cells

간장 별 모양의 세포 스타 같은 형태의 간 세포 거주하고 간 사인 내피 세포와 hepatocytes 1,2 사이에 쭉 내려 가래의 공간에 위치하고 있습니다. 별 모양의 세포는 골수 엽 성의 전구 물질에서 파생 및 토탈 바디 비타민 A 1, 2의 80 %를 저장할 수 있습니다. 활성화되면, 별 모양의 세포 따라서 간 섬유증 3 기여, 세포외 기질을 생산 myofibroblasts로 구분. 계약을 자신의 능력에 따라 myofibroblastic 별 모양의 세포가 포털 고혈압 4 연관된 혈관 음색을 조절할 수 있습니다. 최근, 우리는 간장 별 모양의 세포가 강력한 항원 제시 세포이며, NKT 세포뿐만 아니라, 기존의 T lymphocytes 5 활성화할 수 있습니다 보여주었다. 여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 효율적인 준비 방법을 제시한다. 그들 perisinusoidal 현지화으로 인해, 간장 별 모양의 세포의 격리는 여러 단계로 이루어집니다. 쭉 내려 가래의 공간에서 고립에 액세스할 별 모양의 세포를 렌더링하기 위해서는 마우스 간은이 소화 효소 Pronase E와 Collagenase P. 다음과 재관류로 현장에 perfused 있으며, 간 조직은에 Pronase E와 Collagenase P와 함께 추가적인 효소 치료를 받게됩니다 체외. 이후, 방법은 간장 별 모양의 세포에 비타민 A - 저장 지질 방울의 엄청난 금액을 활용합니다. 이 기능은 8퍼센트 Nycodenz 기울기에 원심 분리하여 다른 간장 세포 유형에서 별 모양의 세포의 분리 수 있습니다. 프로토콜 여기에서 설명한은 별 모양의 세포의 매우 순수하고 동질적인 인구 산출. 준비 순도는 이전 형광 현미경이나 유동세포계측법에 의해 분석 마커 분자 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)에 대한 염색법에 의해 평가하실 수 있습니다. 또한, 가벼운 현미경은 지질 방울의 높은 금액을 가지고 있고, 별 모양의 간장 별 모양의 세포의 독특한 모양을 보여준다. 함께 찍은, 우리는 그들의 대표적인 형태학의 외관 이미지와 별 모양의 세포 실체를 정의하는 데 도움이 GFAP 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 효율적인 격리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 격리를 위해 방법을 설명합니다. 별 모양의 세포 정화 들어, 마우스 간은이 소화되게하여<em&gt; 현장에서</em&gt;과<em&gt; 체외에서</em&gt; 밀도 기울기 원심 분리하기 전에 pronase - collagenase 처리에 의해. 이 기술은 고도로 순수한 간장 별 모양의 세포를 산출.

간 성상세포는 별 모양의 형태를 가진 간 상주 세포로, 간 sinusoidal 내피세포 사이의 디세 공간(space of Disse)에 위치하며...

본 절차의 전체적인 목표는 마우스 간에서 간성상세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 간에 소화 효소를 사용하여 두 차례 관류를 수행함으로써 달성됩니다. 관류 후, 이어서 수행될 인비트로(in vitro) 소화 효율을 높이기 위해 간을 작은 조각으로 자릅니다.마지막 단계로, 밀도 구배 원심분리를 통해 간성상세포를 다른 간세포 유형으로부터 분리합니다. 최종적으로 간성상세포를 확보하며, 광학 및 면역형광 현미경을 통해 그 순도를 평가할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 연구실의 대학원생인 Patrick Meyer가 진행하겠습니다. 마우스 간의 NC two 관류를 준비하기 위해, 먼저 SC one 버퍼와 효소 관류 용액을 37 °C 항온수조에서 가온하십시오.다음으로, 연동 펌프를 분당 6.5 milliliters의 층류가 흐르도록 설정하고 펌프의 실리콘 튜브를 SC one 용액으로 평형화합니다. 이제 반사 작용의 소실을 통해 마취된 마우스가 깊게 진정되었는지 확인합니다. 그런 다음 마우스를 적절한 지지대 위에 정면을 위로 한 앙와위 자세로 고정합니다.가위와 포셉을 사용하여 복부 피부를 세로로 절개하고 복막을 노출시킵니다. 복막을 조심스럽게 열고, 문맥을 노출시키기 위해 장을 복강 밖 동물의 왼쪽으로 이동시킵니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 소화 효소를 이용한 간의 제토 관류(zeto perfusion)이며, 이에 대해 시연하겠습니다.다음으로, 캐뉼라를 삽입할 때는 실체 현미경을 사용하고 관류 동안 간 구조의 변화를 면밀히 관찰하는 것이 중요합니다. 실체 현미경 하에서 주입 세트의 캐뉼라를 문맥에 삽입하십시오. 30 milliliters의 SC one 용액으로 간 관류를 시작하십시오. 흐름이 시작된 직후 하대정맥을 절개하십시오.간의 세척이 성공적으로 이루어지면 간 조직의 색이 빠진 것을 확인할 수 있으며, 다음으로 30 milliliters의 Pronase E 용액으로 간을 관류합니다. Pronase E 용액 관류 후에는 간엽이 팽창하고 캡슐을 통해 소엽이 뚜렷하게 보일 것이며, 이어 30 milliliters의 collagenase P 용액으로 관류합니다. collagenase P 관류가 완료되면, 횡격막 및 주변 장기에서 간을 조심스럽게 박리하여 적출한 후, 얼음 위에 놓인 70 milliliters의 SC two 용액에 보관합니다.이 시점에서 간은 형태를 잃고 긴장도가 낮으며 무정형의 모습으로 보입니다.

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

stromal 세포 - 파생 유도 활동 (SDIA)를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 neuroepithelial 엽 성의 전구 물질의 유도.

ES 세포 - 파생 Neuroepithelial 셀 문화

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포를 소뇌 전구 세포로 분화시키는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 줄기세포 군체를 초저 부착 플레이트로 옮겨 배아체를 형성하고, 성장 인자로 분화를 촉진한 다음, 배아체를 접착을 위해 매트릭스 코팅된 플레이트로 옮기는 작업이 포함됩니다. 후속 단계에는 세포 이동을 유도하고 성숙 배지를 추가하여 글루타메이터 및 GABAergic 소뇌 신경 세포 전구체와 Purkinje 세포 전구체의 발달을 안내하는 것이 포함됩니다.

유도 만능 줄기 세포에서 소뇌 세포의 2D 단층을 생성하는 기술

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다.  우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 장전 단층 및 그들의 발달을 평가하는 방법에서 M 세포의 분화를 유도하는 방법을 기술한다.

인간 줄기 세포 유래 Ileal 장용 단층에서 M 세포 유사 세포의 분화 유도

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

심장 자율 신경계의 병리학적 변화, 특히 교감 지점에서 심실 부정맥의 발병 및 유지 보수에 기여합니다. 본 프로토콜에서, 우리는 근본적인 분자 및 세포 프로세스의 이해를 향상시키기 위하여 murine stellate ganglia를 특성화하는 방법을 보여줍니다.

뮤린 스텔레이트 갠리온의 위치, 해부 및 분석

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

아래에 설명된 프로토콜은 특이적 레티노이드 자가형광을 사용하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 매우 이질적인 폐 세포 집단에서 레티노이드 함유 세포를 분리하는 간단하고 효과적인 방법입니다.

세포 분류에 의한 폐 레티노이드 함유 세포의 분리

여기서는 마우스 혈관선상에서 원발 주변 세포를 분리, 정제, 배양하는 프로토콜을 제시하며, 달팽이 측벽 질환을 연구하기 위한 산화 스트레스 및 세포 노화의 시험관 내 모델을 구축하는 방법을 제시합니다.

신생아 마우스에서 혈관선상균의 1차 경계 세포 분리 및 배양

배우세요 생쥐 간에서 별세포 간성세포를 분리하는 방법을 소화 효소 관류와 밀도 구심 분리를 통해. 이 기술은 순도 높은 세포 확보와 간 질환 연구에 필수적입니다.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

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