Embryoid 기관의 Cryosections를 사용하여 Pluripotent 줄기 세포 분석

1부, 소개. 안녕하세요, 제 이름은 라파엘입니다. 저는 브라질 리우데자네이루 연방대학교(Federal University of Rio de Janeiro)의 스티븐스 한스 랩(Stevens Hans Lab) 교수에서 박사후 연구원으로 근무하고 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 이스마일입니다. 저는 연구 조교이자 교수입니다. 이 동영상에서는 Android 신체의 투명한 부분을 준비하는 방법을 보여줍니다.

시작하겠습니다. 2부, 재료 및 장비. 이 절차를 위해서는 동결된 표본을 위한 매립 매체가 필요합니다.

4%세포의 정착을 위한 파라폼 알데히드 용액, 극저온 보호를 위한 자당 용액. 끝이 약간 구부러진 바늘, EBS를 더 잘 시각화하기 위한 실체 현미경 및 셰이커. 3부.

여기에서 인간 배아체는 비부착성 배양 플레이트에서 배양되고 있습니다. 피펫을 사용하여 모든 배아체를 15ml 원뿔형 튜브로 옮기기 위해 가능한 한 가깝게 그룹화합니다. EBS는 조심스럽게 수확되어 튜브로 옮겨집니다.

EBS는 많은 양의 자료가 없기 때문에 모든 ebs를 수집하는 것이 중요합니다.EBS가 디캔팅된 후 배양 배지는 조심스럽게 폐기됩니다. 튜브 바닥에 있는 펠릿을 볼 수 있어야 합니다. 이제 고정 절차를 진행할 수 있습니다.

EBS는 PBS 또는 인산염 완충 식염수의 4% 파라폼 알데히드 용액으로 고정됩니다. 펠릿을 PFA 용액으로 재현탁시키는 것이 중요합니다. 그런 다음 EBS를 고정 용액에 30분 동안 고정합니다.

고정 후 PFA 용액을 조심스럽게 제거합니다. Resus가 EBS를 현탁시키는 것을 피하고 ebs의 극저온 보호를 시작하기 위해 PBS에서 10% 자당 용액으로 교체한 후 이 용액에서 재료를 30분 동안 보관합니다. 다음으로, 10% 자당 용액을 조심스럽게 제거하고 20% 자당 용액에 EBS를 다시 현탁시킵니다.

다시 한 번, EBS는 이 솔루션에서 30분 동안 유지됩니다. 마지막으로, 20% 자당 용액을 제거하고 PBS에서 30% 자당 용액으로 대체하여 30분 더 보관합니다. 이제 ebs의 방향과 차단을 진행할 수 있습니다.

우리 실험실에서는 빈 캡슐 껍질을 금형으로 사용합니다. ebs의 차단을 위해서는 ebs를 수집하기 전에 팁의 내부 벽을 자당 용액으로 코팅하는 것이 중요합니다. 이제 EBS를 조심스럽게 수집하고 팁 아래쪽으로 기울어질 때까지 기다릴 수 있습니다.

다음으로 EBS는 블록의 중앙에 배치됩니다. 이것은 블록 내 EBS의 최종 위치여야 합니다. 실체 현미경과 미세한 팁의 도움으로 가능한 한 많은 자당 용액을 수집하고 배출합니다.

ebs를 수집하지 않도록 항상 주의하십시오. 끝이 약간 구부러진 바늘을 사용하여 모든 EBS가 블록 중앙에 위치합니다. 마지막으로, 잔류 자당 용액을 여과지 조각으로 수집합니다.

블록 내에서 EBS의 특정 위치는 좋은 품질의 슬라이스를 얻는 데 매우 중요합니다. 다음은 쉘 내부의 EB 위치가 좋지 않은 예입니다. EBS의 위치 지정과 자당 용액 제거 후, 쉘은 가장자리에서 시작하여 OCT로 채워지며 Resus가 ebs를 중단하지 않도록 항상 주의합니다.

나머지 기포는 피펫을 사용하여 제거하고 껍질을 15 분 동안 교반합니다. 동요를 따라. OCT 블록은 드라이 아이스로 얼어 있습니다.

이 시점에서 추가 분석을 위해 알루미늄 호일로 싸인 블록을 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 저온 유지 장치 파트 4, 절단으로 진행할 수 있습니다. 극저온 단면을 만들려면 일회용 또는 영구 블레이드, OCT 및 폴리 L 라이신 전처리된 유리 슬라이드가 필요합니다. OCT 블록은 냉동실에서 꺼내 섭씨 영하 20도에 도달할 때까지 저온 유지 장치 내부에 보관됩니다.

그런 다음 블록이 스탠드에 배치되고 블레이드 가장자리와 평행하게 정렬됩니다. EB 샘플은 대부분의 다른 조직 샘플보다 훨씬 작기 때문에 블록의 전체 표면이 동시에 블레이드에 닿도록 하여 재료 손실을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 배치된 후 블록을 10마이크로미터 조각으로 절단하고 이를 유리 슬라이드에 직접 수집합니다.

슬라이드는 바람직하게는 섭씨 영하 70도에서 보관하거나 같은 날에 사용할 수도 있습니다. 이 물질은 면역조직화학 또는 면역형광을 위해 염색될 수 있습니다. 결론. 본원에 기재된 방법은 인간 H 9 또는 마우스 US P 1 줄기세포 계통 모두로부터 발달된 배아체의 얇은 저온 유지 절편을 수득하기 위해 합리적으로 저렴하고 따르기 쉬운 프로토콜을 제공한다.

생성된 극저온 절편은 단백질 발현 또는 EB 형태를 분석하기 위해 다양한 절차에 사용될 수 있습니다.