Name: Embryoid 기관의 Cryosections를 사용하여 Pluripotent 줄기 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 배우세요 다능성 줄기 세포에서 유래한 배아체의 고품질 크라이오섹션 제작 방법을 통해 세포 및 분자 수준의 배아 발생 과정을 연구하세요. 이 기법은 조직 구조를 보존하며 다양한 연구에 적용 가능합니다.

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이 작품은 Fundação 드 Amparo에 의해 지원되었다 Pesquisa 에스타도하나요 리우데 자네이루 (FAPERJ), Conselho 나셔널 드 Desenvolvimento Científico 전자 Tecnológico (CNPq)과 Instituto 나셔널 드 Ciência E Tecnologia (INCTC). 우리는 브루나 S. 폴슨과 EB의 이미지 앨린 M. 페르난데스에게 감사하고 있습니다.

1. 고정 및 Cryopreservation Pluripotent 줄기 세포는 fibroblast의 성장 인자의 20 % 녹아웃 혈청 대체 (KSR) 및 8ng / ML (FGF - 2)와 보충 mitomycin C와 inactivated과 DMEM/F12 유지 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEF)에 교양되었습니다. EB 형성을 유도하기 위해서는 H9 세포가 아닌 자기편 요리로 전송 15 % KSR 8 보충 DMEM/F12 유지 칠일에 대한 교양되었습니다. 참고 (!) :이 기술은 모든 배아 및 유도 pluripotent 줄기 세포에서 파생된 EBS 사용할 수 있습니다. <ol><li> 피펫과 문화 요리에서 EBS를 수집합니다. </li><li> 재료 튜브의 바닥에 싱크까지 전송 15 ML 원뿔 관에 EBS하고 기다립니다. </li><li> 미디어를 제거하고 실온에서 30 분간 PBS에서 4 % paraformaldehyde (PFA) 솔루션과 EBS를 수정. 참고 (!) : 현장 하이브리드화 항원 복구에 들어 PFA 6,7의 사용으로 인해 항체와 교차 연결 반응을 방지하기 위해 수행되어야합니다. </li><li> PFA 솔루션을 제거하고 5 분 PBS로 세척. </li><li> EBS는 25-28에서 PBS 버퍼 자당 솔루션의 시리얼 희석 (순서대로 10, 20, 30 %)에 배치되어야 ° C, 각 솔루션은 매 30 분 교체해야합니다. 자료는 다음 OCT로 퍼가기 단계까지 4 30 % 자당 용액 ° C에 갖춰져 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 퍼가기,지도 및 냉동 <ol start="6"><li> 조심스럽게 튜브에서 EBS를 수집합니다. 가능한 한 배출 많이 자당 솔루션입니다. 참고 (!) : EBS를 수집하기 전에 자당 솔루션 팁의 내부 벽에 싸하는 것이 중요합니다. 이 절차는 제보에 첨부된 수 EB를 피할 수 있습니다. </li><li> 금형에 EBS를 삽입 및 필터 종이에 남아있는 자당 솔루션을 제거합니다. 참고 (!) : 중복 피하기 위해 EBS와 금형을 기입하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> EBS를 다시 정지하지 돌보는 천천히 OCT와 금형을 입력합니다. 그 후, 금형의 중심에 모두 EB를 놓고 피펫과 거품을 제거합니다. </li><li> 가벼운 15 분 동안 선동. </li><li> 예제를 동결하는 조각 드라이 아이스와 금형을 포위하라. OCT 완전히 얼어해야합니다. 이 시점에서 블록은 하나 이상의 년, -70 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 기술 Cryosectioning <ol start="11"><li> -70에서 냉동 블록을 제거 이전에 -18과 -21 사이의 온도에서 냉각 그라 이오 스탯에 대한 ° C 및 장소 ° C. 참고 (!)이 범위 밖의 온도가 부분과 같은 문제가 컬링 용융 또는 균열이 발생할 수 있습니다. </li><li> 금형에서 OCT 블록을 분리보다 OCT를 추가하여 그라 이오 스탯 지원에 넣습니다. </li><li> 그것은 제대로 방향 블록을하는 것이 중요하며 칼날의 가장자리에 병렬 정렬합니다. 참고 (!) : EBS 다른 조직 샘플보다 작은 있기 때문에,이 단계는 자료의 손실을 최소화하기 위해 매우 중요합니다. </li><li> 표면 비행기를 얻을 때까지 OCT 블록 피상적으로 sectioned해야합니다. 조직 표본의 얇은 부분 (10μm)은 이전에 200 MG / ML 폴리 리신 L (슬라이드 당 10 μL) 9,10와 코팅 슬라이드 촬영과 유리에 장착해야합니다. 참고 (!) : torned 섹션을 방지하려면 블레이드에서하는 어떠한 손해에주의를 기울이십시오. </li><li> 모든 섹션이 있어야 공기 건조 상온에서 1 시간 후 사용하기 전까지 사용하거나 -70 ° C에 저장된을 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법은 여기에 설명된 것은 제공하는 쉬운 따라 immunofluorescence 및 현장 하이브리드화 assays에 유용 embryoid 기관의 PFA 고정 얇은 그라 이오 스탯 섹션을 얻기 위해 프로토콜을. 집합체로서의 구조와 조직을 보존하면서 결과 cryosections은 인간 배아 줄기 세포의 분화의 세포 및 분자 측면의 연구를 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>D (+) 수크로스</td><td>시약</td><td>Vetec</td><td>228</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시약</td><td>Rieden-de Ha&amp;#235;n</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>PBS 용액</td><td>시약</td><td>LGC Biotecnology</td><td>13-30259.05</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>물 내 200mg/mL</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>시약</td><td>Sakura Finetek</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>수크로스 용액</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>PBS 내 10% 수크로스 용액 w/v</td></tr><tr><td>수크로스 용액</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>PBS 내 20% 수크로스 용액 w/v</td></tr><tr><td>수크로스 용액</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>PBS 내 30% 수크로스 용액 w/v</td></tr><tr><td>원추형 튜브</td><td>도구</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td>15mL 원추형 튜브</td></tr><tr><td>플레이트 쉐이커</td><td>도구</td><td>Biomixer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>크라이오스탯</td><td>도구</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>OCT 플랫폼용 몰드</td><td>도구</td><td></td><td></td><td>플라스틱 몰드 플랫폼</td></tr></tbody></table>

embryoid 기관의 cryosections를 사용하여 pluripotent 줄기 세포 분석

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

배아 줄기 (ES) 세포가 blastocyst 단계 초기 포유류의 배아 1의 내부 세포 덩어리에서 파생된 pluripotent 세포 수 있습니다. ES 세포의 분화에 중요한 단계는 embryoid 기관의 형성 (EBS) 집계 2, 3입니다. ES 세포가 아닌 자기편 접시에서 양식 때 EB의 형성은 자연 집합을 기반으로합니다. ectoderm, mesoderm 및 endoderm 4 : 입체 EB의 recapitulates 많은 초기 포유류의 embryogenesis의 측면 및 세 세균 층에 구별. Immunofluorescence 및 현장 하이브리드화에 널리 조직 제 5, 6, 7 세포에있는 목표 단백질 및 mRNA의 검출 기술을 사용합니다. 여기 embryoid 기관의 고품질 cryosections를 생성하는 간단한 기술을 제시한다. 이러한 접근 방식은 OCT에서 EB의 포함의 공간적 방향 cryosection 기술 다음에 의존합니다. 그 결과 섹션은 특정 단백질, RNA 또는 DNA를 포함한 세포의 인구를 특성화하기 위해 분석 절차의 다양한 받게 수 있습니다. 이러한 의미에서, EB cryosections의 준비 (10μm)은 조직학 얼룩의 분석을위한 필수 도구 (예 : Hematoxilin과 Eosin, DAPI), immunofluorescence (예 : Oct4, nestin) 또는 현장 하이브리드화에 있습니다. 이 기술은 또한 EBS의 트라이 차원 구면 구조의 유지 보수 관련하여 embryogenesis의 측면을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

정지 성장 Pluripotent 줄기 세포가 embryoid기구 (EBS)에 구별. 집합체로 조직을 보존하면서 여기에서 우리는 embryogenesis의 세포 및 분자 측면을 연구하는 데 유용 고품질 EB의 cryosections를 얻는 방법을 보여줍니다.

Embryoid 기관의 Cryosections를 사용하여 Pluripotent 줄기 세포 분석

배아줄기세포(ES cells)는 포유류 초기 배아의 배반포 단계 내세포집단에서 유래하는 다능성 세포입니다 1. ...의 결정적인 단계는...

파트 1, 서론. 안녕하세요, 제 이름은 Rafael입니다. 저는 브라질 리우데자네이루 연방대학교의 Stevens Hans 교수님 연구실에서 박사후 연구원으로 근무하고 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Ismail입니다. 저는 연구원이며 교수이기도 합니다. 이 영상에서는 안드로이드 바디(Android bodies)의 투명 절편을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.그럼 시작하겠습니다. 두 번째 파트인 재료 및 장비입니다. 이 절차를 위해 냉동 표본용 매립제가 필요합니다.세포 고정을 위한 4%Paraform aldehyde 용액, 동결 보호를 위한 sucrose 용액. 끝이 약간 굽은 바늘, EBS의 시각화를 위한 실체 현미경 및 쉐이커. 3부.여기서는 인간 배아체(human embryo bodies)를 비부착 배양 플레이트에서 배양하고 있습니다. 피펫을 사용하여 모든 배아체를 최대한 가깝게 모은 후 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. EBS를 조심스럽게 수확하여 튜브로 옮깁니다.재료의 양이 많지 않으므로 모든 ebs를 수집하는 것이 중요합니다. EBS를 데칸트한 후, 배양액을 조심스럽게 버립니다. 튜브 바닥에 펠렛이 보여야 합니다. 이제 고정 절차를 진행할 수 있습니다.EBS는 PBS 또는 인산염 완충 식염수 내의 4% Paraform aldehyde 용액에서 고정됩니다. 펠렛을 PFA 용액으로 재부유시키는 것이 중요합니다. 그 후 EBS를 고정액에서 30분 동안 고정합니다.고정 후, PFA 용액을 조심스럽게 제거합니다. EBS가 다시 부유되는 것을 방지하면서 PBS 내 10% sucrose 용액으로 교체하여 EBS의 동결 보호(cryo protection)를 시작하고, 시료를 이 용액에 30분 동안 둡니다. 다음으로, 10% sucrose 용액을 조심스럽게 제거하고 EBS를 20% sucrose 용액에 다시 부유시킵니다.다시 한번, EBS를 이 용액에 30분 동안 둡니다. 마지막으로, 20% sucrose 용액을 제거하고 PBS에 조제된 30% sucrose 용액으로 교체하여 30분 더 둡니다. 이제 EBS의 배향 및 블로킹 단계를 진행할 수 있습니다.본 실험실에서는 빈 캡슐 껍질을 몰드로 사용합니다. EBS를 블로킹하기 위해서는 EBS를 수집하기 전에 팁의 내부 벽면을 수크로스 용액으로 코팅하는 것이 중요합니다. 이제 EBS를 조심스럽게 수집하고 팁 바닥으로 가라앉을 때까지 기다립니다.다음으로, EBS를 블록의 중앙에 배치합니다. 이것이 블록 내 EBS의 최종 위치가 되어야 합니다. 실체 현미경과 미세 팁을 사용하여, 가능한 한 많은 설탕 용액을 수집하여 배출합니다.ebs가 수집되지 않도록 항상 주의합니다. 끝이 약간 굽은 바늘을 사용하여 모든 EBS를 블록 중앙에 위치시킵니다. 마지막으로, 거름종이를 이용하여 남은 sucrose 용액을 수집합니다.양질의 절편을 얻기 위해서는 블록 내 EBS의 정확한 위치가 매우 중요합니다. 다음은 쉘 내부의 EBS 위치 설정이 잘못된 예시입니다. EBS를 위치시키고 자당 용액을 제거한 후, EBS가 다시 부유되지 않도록 주의하면서 가장자리부터 쉘 내부를 OCT로 채웁니다.남은 기포는 피펫을 사용하여 제거하고, 껍질을 15분 동안 교반합니다. 교반 후, OCT 블록을 드라이아이스에 넣어 동결시킵니다.이 단계에서 블록을 알루미늄 호일로 감싸 -80 °C에 보관하여 추후 분석에 사용하거나, 크라이오스탯(cryostat)의 네 번째 단계인 절편 제작 과정으로 진행할 수 있습니다. 동결 절편을 만들기 위해서는 일회용 또는 영구형 블레이드, OCT 화합물, 그리고 poly L lysine으로 전처리된 유리 슬라이드가 필요합니다. OCT 블록을 냉동고에서 꺼내어 온도가 -20 °C에 도달할 때까지 크라이오스탯 내부에 보관합니다.그 후 블록을 스탠드 위에 놓고 블레이드의 가장자리와 평행하게 맞춥니다. EB 샘플은 대부분의 다른 조직 샘플보다 훨씬 작으므로, 재료 손실을 최소화하기 위해 블록의 전체 표면이 블레이드에 동시에 닿도록 하는 것이 매우 중요합니다. 위치를 잡은 후, 블록을 10 µm 두께의 절편으로 자르고 이를 유리 슬라이드 위에 직접 수집합니다.슬라이드는 가급적 -70 °C에서 보관하거나 당일에 바로 사용할 수 있습니다. 해당 시료는 면역조직화학 염색 또는 면역형광 염색을 진행할 수 있습니다. 결론. 본 방법은 인간 H9 또는 마우스 US P1 줄기세포 라인에서 발달한 배아 몸체의 얇은 cryostat 절편을 얻기 위한 합리적으로 저렴하고 따라 하기 쉬운 프로토콜을 제공합니다.결과물인 동결 절편은 단백질 발현이나 EB 형태를 분석하기 위한 다양한 절차에 사용될 수 있습니다.

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연구

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Biology

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태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

세포 - 표면 마커에 대한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 중지 immunocytochemical 얼룩 (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4)가 관측 및 부량에 대한 세포 monolayer을 생성하기 위해 스스로 만든 cytospin 장치의 사용을 기반으로 달성했다.

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단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

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