Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides

Parte Um, Introdução. Olá, meu nome é Rafael. Sou pós-doutoranda no Professor Stevens Hans Lab da Universidade Federal do Rio de Janeiro, no Brasil.

Olá, meu nome é Ismail. Sou assistente de pesquisa, também professor. Neste vídeo, mostraremos como preparar seções claras de corpos Android.

Então vamos começar. Parte dois, materiais e equipamentos. Para este procedimento, precisaremos de um meio de incorporação para amostras congeladas.

Solução de aldeído paraforme a 4% para fixação das células, soluções de sacarose para crioproteção. Uma agulha com a ponta ligeiramente dobrada, um microscópio estéreo para melhor visualização do EBS e um agitador. Parte três.

Aqui, os corpos embrionários humanos estão sendo cultivados em placas de cultura não aderentes. Usando uma pipeta, agrupamos todos os corpos embrionários o mais próximo possível para transferi-los para um tubo cônico de 15 mililitros. Os EBS são cuidadosamente colhidos e transferidos para o tubo.

É importante coletar todos os EBS, pois não há uma grande quantidade de material Após a decantação dos EBS, os meios de cultura são cuidadosamente descartados. Você deve ser capaz de ver o pellet no fundo do tubo. Agora podemos prosseguir para o procedimento de fixação.

O EBS será fixado em solução de aldeído paraforme a 4% em PBS ou solução salina tamponada com fosfato. É importante ressuspender o pellet com solução de PFA. Os EBS são então fixados em solução de fixação por 30 minutos.

Após a fixação, a solução de PFA é cuidadosamente removida. Tomando cuidado para evitar que o Resus suspenda o EBS e seja substituído por uma solução de sacarose a 10% em PBS para iniciar a crioproteção do ebs, o material é mantido por 30 minutos nesta solução. Em seguida, removemos cuidadosamente a solução de sacarose a 10% e ressuspendemos o EBS em uma solução de sacarose a 20%.

Mais uma vez, os EBS são mantidos por 30 minutos nesta solução. Finalmente, a solução de sacarose a 20% é removida e substituída por uma solução de sacarose a 30% em PBS, onde é mantida por mais 30 minutos. Agora podemos prosseguir para a orientação e bloqueio de ebs.

Em nosso laboratório, usamos invólucros de cápsulas vazias como moldes. Para o bloqueio do ebs, é importante revestir as paredes internas da ponta com solução de sacarose antes de coletar o ebs. Agora podemos coletar cuidadosamente o EBS e esperar até que ele decanta até o fundo da ponta.

Em seguida, o EBS é colocado no centro do bloco. Esta deve ser a posição final do EBS dentro do bloco. Com a ajuda de um microscópio estéreo e uma ponta fina, coletamos e descarregamos o máximo possível de solução de sacarose.

Sempre tomando cuidado para não coletar o ebs. Usando uma agulha com a ponta ligeiramente dobrada, todos os EBS são posicionados no centro do bloco. Finalmente, a solução de sacarose restante é coletada com pedaços de papel de filtro.

A localização específica do EBS dentro do bloco é muito importante para a obtenção de fatias de boa qualidade. Aqui está um exemplo de mau posicionamento EB dentro do shell. Após o posicionamento do EBS e a remoção da solução de sacarose, a casca é preenchida com OCT começando pelas bordas, sempre tomando cuidado para evitar que o Resus suspenda o ebs.

As bolhas restantes são removidas usando uma pipeta e as cascas são agitadas por 15 minutos. Após agitação. O bloco OCT é congelado em gelo seco.

Neste ponto, você pode armazenar o bloco envolto em papel alumínio a menos 80 graus Celsius para análise posterior ou prosseguir para o criostato Parte quatro, Corte. Para fazer as seções criogênicas, você precisará de uma lâmina descartável ou permanente, OCT e lâminas de vidro pré-tratadas com poli L lisina. O bloco OCT é removido do freezer e mantido dentro do criostato até atingir 20 graus Celsius negativos.

O bloco é então posicionado no suporte e alinhado paralelamente à borda da lâmina. As amostras de EB são muito menores do que a maioria das outras amostras de tecido, por isso é muito importante ter certeza de que toda a superfície do bloco toca a lâmina ao mesmo tempo, minimizando assim a perda de material. Depois de posicionado, o bloco é cortado em fatias de 10 micrômetros, que são coletadas diretamente nas lâminas de vidro.

As lâminas podem ser armazenadas, de preferência a 70 graus Celsius negativos, ou também podem ser usadas no mesmo dia. O material pode ser corado para imuno-histoquímica ou imunofluorescência. Conclusão. O método aqui descrito fornece um protocolo razoavelmente barato e fácil de seguir para obter seções finas de criostato de corpos embrionários desenvolvidos a partir de linhagens de células-tronco H nove humanas ou US P um de camundongo.

As seções criogênicas resultantes podem ser usadas em uma ampla variedade de procedimentos para analisar a expressão proteica ou a morfologia da EB.