Name: Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a realizar imunocitoquímica em células-tronco pluripotentes humanas usando um aparelho de cytospin caseiro. Este método cria monocamadas celulares para quantificação confiável de marcadores de superfície como SSEA-3 e SSEA-4.

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Financiamento parcial para este trabalho foi fornecida pela NSF CARREIRA-0744556 (Rao) e uma bolsa de estudos através do VCU-HHMI Ciências da Educação e Programa de Pesquisa (Pascual).

Parte 1: Coloração Suspensão imunocitoquímico <ol><li> As células são colhidas em uma suspensão de células individuais. </li><li> As células são então transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 2mL e centrifugado a 200g por 4 minutos. </li><li> As células são lavadas por aspiração fora sobrenadante, re-suspensas em 1mL de PBS - (sem Mg 2 + e Ca 2 +) e depois centrifugada novamente a 200g por 4 minutos. Isto deve ser feito duas vezes. </li><li> Após a lavagem, as células são então fixado pelo re-suspendendo-as em 1mL de 4% paraformaldeído (PFA) em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> As células são lavadas novamente duas vezes com 1mL de PBS -. </li><li> Depois de células de lavar roupa, bloco por re-suspendendo-as em 1 ml de solução de bloco (6% serum/94% PBS -). Incubar esses em temperatura ambiente por 45 minutos. </li><li> Após, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos e aspirar a Solução Block. Re-suspender as células em 1mL da solução de anticorpo primário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada). As células podem ser incubadas em temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite antes de prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Células são então lavadas duas vezes com 1 ml de solução Block. </li><li> Depois, volte a suspender as células em 1mL de solução de anticorpo secundário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada) e incubar à temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Depois de uma hora, as células devem ser lavadas novamente duas vezes com 1 ml de solução Block. </li><li> Após a lavagem com solução de Bloco, lave as células novamente com 1mL de PBS -. </li><li> Após as lavagens diversas, re-suspender as células em 1mL de DAPI nuclear mancha (diluição de 1:10.000 em PBS DAPI -) e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Após 5 minutos, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos. Aspirar a solução nuclear DAPI mancha e re-suspender as células em 1mL de PBS -. </li></ol> Parte 2: Incorporação de hPSCs em slides gerados por aparelhos cytospin <ol><li> Slides de plástico são preparados por fazer a quantidade desejada de furos com uma broca imprensa. O diâmetro deve ser no máximo um milímetro maior que o maior diâmetro da ponta da micropipeta (s) a ser utilizado. </li><li> Filtro de papel é cortado com os parâmetros da lâmina de plástico com uma tesoura. </li><li> Furos são feitos então no papel de filtro. O tamanho do buraco (s) deve ser grande o suficiente para que a ponta micropipeta (s) se encaixa confortavelmente através dele. </li><li> Depois, um dos slides de plástico preparado é colocado na parte superior e uma lâmina de vidro na colocados na parte inferior do papel filtro de corte (Figura 1). As camadas são fixados com fita adesiva. </li><li> Um máximo de 100μL (dependendo da densidade desejada monocamada) da suspensão de células coradas da Parte 1 é então colocado no topo da ponta da micropipeta (s). </li><li> Se necessário, o aparelho com a solução de célula pode ser pesado e um contrapeso de peso semelhante criado. </li><li> O aparelho cytospin e contrapeso pode são então colocados em uma centrífuga de mesa e centrifugado a 200g por 4 minutos. </li><li> Após a centrifugação, o aparelho é cuidadosamente desmontado cytospin de uma forma que doesnt desalojar as células da lâmina de vidro. </li><li> Se necessário, o excesso de PBS redor - do lado de vidro em aspirados para fora. </li><li> As células podem ser visualizados usando um microscópio de fluorescência para verificar se a monocamada de células desejado foi alcançado. </li></ol> Parte 3: slides de montagem <ol><li> A queda dos meios de comunicação de montagem desejada é colocado diretamente no centro de cada área contendo células. </li><li> Depois, a lamínula é suavemente baixou para os slides tentando evitar as bolhas de ar, se possível. </li><li> Excesso de meios de montagem é então removido do slides. </li><li> Depois, os lados do lamínulas são selados com verniz. </li><li> Os slides podem ser mantidos em uma área de armazenamento escuro até que os resultados são observados e documentados. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para efeitos do nosso laboratório, um prato de 35 milímetros de culturas de células-tronco cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) é alocado para o procedimento de coloração imunocitoquímica para uso com o aparelho cytospin. As células são então coletados por meio de passaging enzimática, removendo o máximo da camada de MEF quanto possível, em uma suspensão de uma única célula. Se mais de isolamento de células-tronco eficaz a partir da camada MEF é desejada, as colônias podem ser manualmente escolheu entã...

<table><tbody><tr><td>Lâmina com Câmara Lab Tek Permanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Material para lâminas plásticas reutilizadas</td></tr><tr><td>Lâminas Microscópicas Superfrost/Plus Pré-limpas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Filtragem de 0,1-10&amp;mu;L</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Cobreglass para Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Meio de Montagem</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Soro Normal de Cabra</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal Anti-SSEA-4 de Camundongo</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Anticorpo Primário para Coloração de SSEA-4</td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal Anti-SSEA-3 de Rato</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>Anticorpo Primário para Coloração de SSEA-3</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-IgG de Cabra Conjugado com Camundongo</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Anticorpo Secundário para Coloração de SSEA-4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-IgG de Cabra Conjugado e Rotulado para Rato</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Anticorpo Secundário para Coloração de SSEA-3</td></tr><tr><td>DAPI, Dicloridrato</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um self-made aparelho cytospin

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) que incluem células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) são fontes de células emocionante devido à sua ilimitada capacidade de auto-renovação e seu potencial de se diferenciar em vários tipos de células. O estado de pluripotentes hPSCs é tipicamente avaliada por técnicas tais como qPCR, imunocitoquímica, e por outros<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt; Estratégias de diferenciação em vários tipos de células. Entre estas, as técnicas de imunocitoquímica têm sido desenvolvidos para a caracterização de rotina do estado indiferenciado de hPSCs com base na análise de biomarcadores candidato intracelulares e de superfície celular. Dado o fato de que hPSCs crescer como colônias, os problemas surgem em quantificar a expressão destes marcadores no nível da célula individual em uma base rotineira. Análises de citometria de fluxo serve para resolver este problema, mas requerem números de celular e uso de reagentes que normalmente não são propícias para a avaliação de rotina de controle de qualidade das culturas hPSC. Assim, o desenvolvimento de meios práticos e reprodutíveis de criação de amostras de células em monocamada com integridade preservada para avaliação marcador tem muitas vantagens nas pesquisas com células-tronco. Este beneficia muito a análise imunocitoquímica porque as células individuais da monocamada podem ser facilmente observados e quantificados para a expressão de marcadores específicos. Para atingir este objetivo, um self-made cytospin aparelho foi construído e otimizado para uso com coloração imuno-histoquímico. Dois marcadores de superfície celular (SSEA3/SSEA4) expressão foram analisados ​​em uma variante da linha de células-tronco BG01 para o objectivo deste protocolo.

Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), que incluem células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs), são células empolgantes...

Olá, meu nome é Rick Pasqua, aluno do Laboratório de Engenharia de Células-Tronco do Departamento de Ciências Químicas e da Vida da Universidade Estadual da Virgínia. Neste vídeo, demonstrarei como nosso laboratório utiliza um aparelho de centrifugação STO de baixo custo e fabricado internamente para criar uma monocamada observável de células-tronco pluripotentes humanas, a fim de quantificar marcadores de superfície celular. Como muitos protocolos IMUNOQUÍMICOS são adaptados para hPSCs cultivadas em lâminas com câmara em forma de colônias, podem surgir problemas na caracterização da expressão dos biomarcadores ao nível celular individual.Ter as células em uma monocamada auxilia não apenas na análise visual destas, mas possivelmente também na quantificação de sua expressão; o aparelho de espalhamento celular utilizado em nossos laboratórios pode ser construído com materiais encontrados na maioria dos laboratórios, necessita apenas de uma pequena amostra de células e não requer nenhum tipo de reagente específico. E, mais importante, é capaz de reproduzir de forma confiável uma dispersão de células isoladas para observação. Abaixo estão algumas das coisas necessárias para montar o aparelho de citosina.Lâminas de plástico, já que estas não precisam necessariamente ser limpas, você pode usar lâminas de câmara antigas, se desejar. Lâminas de vidro pré-limpas. Estas precisam ser limpas porque será aí que a monocamada celular será criada.Papel filtro, qualquer tipo serve, e ponteiras para micropipeta. Ponteiras de 1 a 10 microlitros são as utilizadas em nosso laboratório antes de iniciar a montagem. Primeiramente, devem ser feitos furos nas lâminas de plástico.Isso pode ser feito usando uma furadeira de bancada. O diâmetro dos orifícios depende do tamanho da ponteira de micropipeta e deve ser aproximadamente igual à largura da seção mais larga da ponteira utilizada para uma micropipeta padrão de um a dez microlitros. Isso deve ser em torno de sete milímetros.A quantidade de orifícios que você cria nos lâminas de plástico depende totalmente do uso pretendido. Para a coloração imunoquímica em nosso laboratório, por exemplo, geralmente usamos dois orifícios, um para a coloração positiva e outro para o controle negativo do fundo. Esses lâminas podem ser reutilizados por uma quantidade indefinida de vezes.Para o papel de filtro, basta recortar um pedaço com as dimensões do lâmina de plástico. Utilize os orifícios da lâmina como referência para fazer orifícios no papel de filtro. O tamanho do orifício no papel de filtro deve ser grande o suficiente para que a ponteira de micropipeta se encaixe firmemente, como mostrado aqui.Em seguida, precisamos recortar o número apropriado de ponteiras de micropipeta, uma para cada orifício, com cerca de metade do seu comprimento. Isso servirá como base da lâmina de vidro onde será criada a monocamada celular. Em seguida, o papel filtro será colocado sobre esta base.O papel-filtro servirá para absorver qualquer meio em excesso da coloração por suspensão. Em seguida, será coberto com uma lâmina de plástico que funcionará como suporte sólido do aparato. Em seguida, pode ser selado em todos os quatro lados com fita adesiva comum.Por fim, ponteiras inteiras de micropipeta são inseridas nas pontas cortadas do aparelho. Esse será o local onde as amostras celulares, após a coloração em suspensão, serão colocadas. Pode ser útil marcar inicialmente a posição das pontas cortadas na lâmina de vidro para facilitar o reconhecimento.O protocolo de coloração em suspensão imunoquímica utilizado em nosso laboratório envolve primeiro a coleta de células-tronco em uma suspensão de células isoladas, geralmente realizada por dissociação enzimática, utilizando tripsina ou tampões de dissociação celular à base de EDTA não enzimáticos. As células são então transferidas para tubos microcentrífugos de um ml ou dois ml com seu meio de crescimento padrão. Em seguida, são centrifugadas a 200 Gs por quatro minutos.A mesma velocidade de centrifugação será usada em todas as etapas subsequentes de lavagem e centrifugação. Em seguida, o meio é aspirado manualmente; tenha cuidado extra durante a aspiração para garantir que o pellet celular permaneça inalterado. Em seguida, realiza-se a lavagem com um ml de PBS duas vezes, centrifugando e aspirando após cada etapa.O próximo passo envolve a fixação das células utilizando reagentes de formaldeído a 4% ou PFA necessários para isso ou listados no texto explicativo acompanhante deste vídeo. As células são incubadas na solução de formaldeído a 4% e deixadas à temperatura ambiente por 10 minutos. Recomenda-se que este passo seja realizado antes da suspensão extracelular, coloração para o uso do aparelho citocentrifugador.Posteriormente, as células são lavadas duas vezes com PBS para remover traços de PFA. As células devem então ser bloqueadas para evitar coloração inespecífica. Após as lavagens com PBS na etapa anterior, aspire o líquido de lavagem e adicione um mL da solução de bloqueio.Isso deve então ser deixado em temperatura ambiente por cerca de 45 minutos. Enquanto espera a solução de bloqueio, você pode preparar o anticorpo primário diluindo-o na diluição recomendada e na solução de bloqueio. Armazene isso a quatro graus Celsius.Após as células terem permanecido na solução bloqueadora por cerca de 45 minutos, centrifugue e aspire a solução, depois ressuspenda-as na solução de anticorpo primário. Para fins de detecção de ligação inespecífica e controle de fundo, é recomendável manter pelo menos uma amostra como negativa, à qual não é adicionado anticorpo primário e que é simplesmente ressuspendida em PBS.Todas as amostras são deixadas em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora. Se desejado, as células fixadas podem ser deixadas em suspensão na solução de anticorpo primário durante a noite e lavadas duas vezes com solução bloqueadora. A solução de anticorpo secundário pode ser preparada enquanto as lavagens são realizadas.Os anticorpos secundários são geralmente sensíveis à luz, portanto, sempre que possível, reduza a iluminação do laboratório e cubra os recipientes utilizados com papel alumínio, a fim de evitar o desbotamento da fluorescência. Reagentes antifa podem ser incorporados ao protocolo, mas deve-se ter cuidado em seu uso, pois podem resultar em um fundo mais alto, assim como o anticorpo primário diluído na concentração recomendada na solução bloqueadora. Aplique uma vis a todas as amostras, independentemente de ter sido adicionado ou não o anticorpo primário, após a conclusão da lavagem.Deixe repousar em uma área escura, como dentro de um frasco, por cerca de uma hora. Lave as células duas vezes com um ml de solução bloqueadora. As células devem estar prontas para a coloração nuclear com o corante DPI.Prepare a solução de DPI inicialmente em uma diluição de um para 10.000 em PBS, lave as células uma vez com um ml de PBS, depois ressuspenda em DPI e deixe em repouso à temperatura ambiente por cerca de cinco a 10 minutos. Assim como o anticorpo secundário, o DAPI é sensível à luz, portanto faça os ajustes necessários para evitar o desbotamento da fluorescência. Lave uma vez com um ml de PBS e, finalmente, ressuspenda.Suspender novamente em um mL de PBS. Isso deverá deixá-lo pronto para uso com um aparelho de citocentrifugação. Colocar no máximo 100 microlitros da solução de células isoladas na extremidade superior das ponteiras de micropipeta.Recomenda-se, no entanto, uma quantidade menor para evitar transbordamento ou gotejamento desnecessários. Em seguida, posicione um aparelho de citocentrifugação e o contrapeso em uma centrífuga de bancada e centrifugue a 1000 RPM durante quatro minutos. Após isso, desmonte cuidadosamente o aparelho de citocentrifugação de forma a minimizar a possibilidade de desprendimento das células da lâmina de vidro.Verifique se a sedimentação ocorreu sob microscópio de fluorescência antes do acondicionamento. Estas são imagens de uma monocamada de células BG one V coradas com quatro marcadores de superfície celular SSCA provenientes do aparelho citocentrifugador. Observe como as células estão isoladas umas das outras, permitindo observações e registros em nível de célula única.O que há de bom neste protocolo é que ele é capaz de reproduzir uma monocamada de células viável, economicamente eficaz e facilmente adaptável para qualquer análise de rotina de culturas de células-tronco. Com isso, espero que você aproveite este vídeo e encontre no protocolo uma utilidade para a sua própria pesquisa.

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Biologia

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