Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Olá, meu nome é Rick Pasqua, estudante do Laboratório de Engenharia de Células-Tronco aqui no Departamento de Ciências Químicas e da Vida da Virginia Commonwealth University. Neste vídeo, demonstrarei como nosso laboratório usa um aparelho de spin STO barato e feito por ele mesmo para criar uma monocamada observável de células-tronco pluripotentes humanas para a quantificação de marcadores de superfície celular. Dado que muitos protocolos IMUNOQUÍMICOS são adaptados para h PSCs cultivadas em lâminas de câmara como colônias, podem surgir problemas na caracterização da expressão dos biomarcadores no nível celular individual.

Ter as células em uma monocamada ajuda não apenas na análise visual destas, mas possivelmente também na quantificação de sua expressão, o aparelho de rotação sinusal que nossos laboratórios usam pode ser construído usando materiais encontrados na maioria dos laboratórios que precisam apenas de uma amostra de células pequenas e não precisa de nenhum tipo de reagente específico. E mais importante, é capaz de reproduzir de forma confiável uma propagação de células únicas para observação. Aqui estão algumas das coisas que você precisará para construir o aparelho de citosina.

Lâminas de plástico, uma vez que não precisam necessariamente estar limpas, você pode usar corrediças de câmara antigas, se desejar. Corrediças de vidro pré-limpas. Eles precisam ser limpos porque será aqui que a monocamada da célula será criada.

Papel de filtro, qualquer tipo deve fazer, e micro pontas de pipeta. Pontas de um a 10 microlitros são o que nosso laboratório usa antes que a construção possa começar. Os furos devem primeiro ser feitos nas lâminas de plástico.

Isso pode ser feito usando uma furadeira. O diâmetro dos orifícios depende do tamanho da ponta da micropipeta e deve ser aproximadamente a largura da seção mais larga da ponta usada para uma ponta de micropipeta padrão de uma a 10. Isso deve estar em torno de sete milímetros.

A quantidade de furos que você cria nas lâminas de plástico depende completamente do uso pretendido para elas. Para a coloração imunoquímica do nosso laboratório, por exemplo, geralmente usamos dois orifícios, um para a coloração positiva e outro para o controle de fundo negativo. Esses slides podem ser reutilizados por um período indefinido de vezes.

Para o papel de filtro, basta cortar um pedaço dele de acordo com os parâmetros da lâmina de plástico. Use os orifícios da lâmina como referência para fazer furos no papel de filtro. O tamanho do orifício no papel de filtro deve ser grande o suficiente para que a ponta da micropipeta possa se encaixar perfeitamente, conforme mostrado aqui.

Em seguida, precisamos cortar o número apropriado de pontas de micropipeta, uma para cada orifício em aproximadamente metade de seu comprimento. Isso servirá como base da lâmina de vidro para onde a camada mono celular será criada. Em seguida, o papel de filtro será colocado em cima disso.

O papel de filtro servirá para absorver qualquer excesso de meio da coloração da suspensão. Isso será então complementado pela corrediça de plástico que servirá como suporte sólido do aparelho. Isso pode ser selado nos quatro lados com fita adesiva comum.

Finalmente, pontas inteiras de micropipetas são então inseridas nas pontas cortadas do aparelho. Será aqui que as amostras celulares após a coloração da suspensão serão colocadas. Também pode ser útil marcar inicialmente onde estão as pontas cortadas na lâmina de vidro para um reconhecimento mais conveniente.

O protocolo de coloração de suspensão imunoquímica que nosso laboratório usa envolve a primeira colheita de células-tronco em uma única suspensão celular, geralmente feita por enzimática, usando tripsina ou tampões de dissociação celular não enzimáticos à base de EDTA. As células são então transferidas para um ml são tubos de microcentrífuga de dois ml e seu meio de crescimento padrão. Estes são então centrifugados a 200 Gs por quatro minutos.

A mesma velocidade de centrifugação será usada para todas as etapas de lavagem e centrifugação consequentes. O meio é então aspirado manualmente, seja extremamente cuidadoso durante a aspiração para garantir que o pellet celular não seja perturbado. Este é então lavado com um ml de PBS duas vezes girando para baixo e aspirando a cada vez.

A próxima etapa envolve a fixação das células usando 4% de par de formaldeído ou reagentes PFA necessários para fazer isso ou listados no artigo que acompanha este vídeo. As células são incubadas na solução de formaldeído a 4% e deixadas em temperatura ambiente por 10 minutos. Recomenda-se que esta etapa seja realizada antes da suspensão ex extracelular, coloração para o uso do aparelho de cyto spin.

Em seguida, as células são lavadas duas vezes com PBS para remover vestígios do PFA. A célula deve então ser bloqueada para evitar manchas inespecíficas. Após as lavagens do PBS na etapa anterior, aspire a lavagem e adicione um ml da solução de bloqueio.

Isso deve ser deixado em temperatura ambiente por cerca de 45 minutos. Enquanto aguarda a solução de bloqueio, você pode preparar o anticorpo primário diluindo-o para a diluição recomendada e a solução de bloqueio. Armazene isso a quatro graus Celsius.

Depois que as células estiverem na solução de bloqueio por cerca de 45 minutos, gire para baixo e aspire e suspenda-as novamente na solução primária de anticorpos. Para fins de detecção de ligação inespecífica e controle de fundo, é melhor manter pelo menos uma amostra como negativa. Não foram aplicados anticorpos primários e é simplesmente suspenso em PBS.

Todas as amostras são deixadas em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora. Se desejado, as células fixas podem ser deixadas em suspensão na solução primária de anticorpos durante a noite e lavadas duas vezes com solução de bloqueio. A solução de anticorpos secundários pode ser feita durante a lavagem.

Os anticorpos secundários geralmente são sensíveis à luz, portanto, se possível, diminua as luzes do laboratório e cubra todos os recipientes usados com papel alumínio, isso é feito para evitar o branqueamento por fluorescência. Os reagentes antifa podem ser incorporados ao protocolo, mas deve-se ter cuidado em seu uso, pois pode resultar em um fundo mais alto, como o anticorpo primário diluído na concentração recomendada na solução de bloqueio. Aplique um vis a todas as amostras, independentemente de o primário ter sido adicionado ou não após a conclusão da lavagem.

Deixe isso em uma área escura, como dentro de uma jarra, por cerca de uma hora. Lave as células com um ml de solução de bloqueio duas vezes. A célula agora deve estar pronta para coloração nuclear com corante DPI.

Prepare a solução de DPI em uma diluição de um a 10.000 em PBS inicialmente, lave as células em um ml de PBS uma vez, depois resus, suspenda em dpi e deixe em temperatura ambiente por cerca de cinco a 10 minutos. Como o anticorpo secundário, o DAPI é sensível à luz, portanto, faça os ajustes necessários para evitar fluorescência e branqueamento. Lave uma vez com um ml de PBS e, finalmente, reus.

Suspenda novamente em um ml de PBS. Isso deve estar pronto para uso com um aparelho de spin cito. Coloque um máximo de 100 microlitros da solução de célula única na parte superior das pontas das micropipetas.

Uma quantidade menor é recomendada para evitar transbordamento ou gotejamento desnecessário. Depois. Coloque um aparelho de centrifugação e o contrapeso em uma centrífuga de mesa e gire a 1000 RPM por quatro minutos. Em seguida, desmonte cuidadosamente o aparelho de spin cito de forma a minimizar a chance de deslocamento das células da lâmina de vidro.

Verifique se a posição em pé ocorreu sob o microscópio de fluorescência antes da montagem. Estas são fotos tiradas de uma monocamada de célula BG one V corada com marcadores de superfície celular SSCA quatro do aparelho de spin cito. Observe como as células estão isoladas umas das outras, possibilitando observações e registros de células únicas.

O que é bom sobre este protocolo é que ele é capaz de reproduzir células de monocamada que é viável, econômica e facilmente adaptável para qualquer análise de rotina de culturas de células-tronco. Então, com isso, espero que você desenhe este vídeo e encontre o protocolo de uso em sua própria pesquisa.