Name: Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a realizar imunocitoquímica em células-tronco pluripotentes humanas usando um aparelho de cytospin caseiro. Este método cria monocamadas celulares para quantificação confiável de marcadores de superfície como SSEA-3 e SSEA-4.

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Financiamento parcial para este trabalho foi fornecida pela NSF CARREIRA-0744556 (Rao) e uma bolsa de estudos através do VCU-HHMI Ciências da Educação e Programa de Pesquisa (Pascual).

Parte 1: Coloração Suspensão imunocitoquímico <ol><li> As células são colhidas em uma suspensão de células individuais. </li><li> As células são então transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 2mL e centrifugado a 200g por 4 minutos. </li><li> As células são lavadas por aspiração fora sobrenadante, re-suspensas em 1mL de PBS - (sem Mg 2 + e Ca 2 +) e depois centrifugada novamente a 200g por 4 minutos. Isto deve ser feito duas vezes. </li><li> Após a lavagem, as células são então fixado pelo re-suspendendo-as em 1mL de 4% paraformaldeído (PFA) em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> As células são lavadas novamente duas vezes com 1mL de PBS -. </li><li> Depois de células de lavar roupa, bloco por re-suspendendo-as em 1 ml de solução de bloco (6% serum/94% PBS -). Incubar esses em temperatura ambiente por 45 minutos. </li><li> Após, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos e aspirar a Solução Block. Re-suspender as células em 1mL da solução de anticorpo primário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada). As células podem ser incubadas em temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite antes de prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Células são então lavadas duas vezes com 1 ml de solução Block. </li><li> Depois, volte a suspender as células em 1mL de solução de anticorpo secundário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada) e incubar à temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Depois de uma hora, as células devem ser lavadas novamente duas vezes com 1 ml de solução Block. </li><li> Após a lavagem com solução de Bloco, lave as células novamente com 1mL de PBS -. </li><li> Após as lavagens diversas, re-suspender as células em 1mL de DAPI nuclear mancha (diluição de 1:10.000 em PBS DAPI -) e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Após 5 minutos, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos. Aspirar a solução nuclear DAPI mancha e re-suspender as células em 1mL de PBS -. </li></ol> Parte 2: Incorporação de hPSCs em slides gerados por aparelhos cytospin <ol><li> Slides de plástico são preparados por fazer a quantidade desejada de furos com uma broca imprensa. O diâmetro deve ser no máximo um milímetro maior que o maior diâmetro da ponta da micropipeta (s) a ser utilizado. </li><li> Filtro de papel é cortado com os parâmetros da lâmina de plástico com uma tesoura. </li><li> Furos são feitos então no papel de filtro. O tamanho do buraco (s) deve ser grande o suficiente para que a ponta micropipeta (s) se encaixa confortavelmente através dele. </li><li> Depois, um dos slides de plástico preparado é colocado na parte superior e uma lâmina de vidro na colocados na parte inferior do papel filtro de corte (Figura 1). As camadas são fixados com fita adesiva. </li><li> Um máximo de 100μL (dependendo da densidade desejada monocamada) da suspensão de células coradas da Parte 1 é então colocado no topo da ponta da micropipeta (s). </li><li> Se necessário, o aparelho com a solução de célula pode ser pesado e um contrapeso de peso semelhante criado. </li><li> O aparelho cytospin e contrapeso pode são então colocados em uma centrífuga de mesa e centrifugado a 200g por 4 minutos. </li><li> Após a centrifugação, o aparelho é cuidadosamente desmontado cytospin de uma forma que doesnt desalojar as células da lâmina de vidro. </li><li> Se necessário, o excesso de PBS redor - do lado de vidro em aspirados para fora. </li><li> As células podem ser visualizados usando um microscópio de fluorescência para verificar se a monocamada de células desejado foi alcançado. </li></ol> Parte 3: slides de montagem <ol><li> A queda dos meios de comunicação de montagem desejada é colocado diretamente no centro de cada área contendo células. </li><li> Depois, a lamínula é suavemente baixou para os slides tentando evitar as bolhas de ar, se possível. </li><li> Excesso de meios de montagem é então removido do slides. </li><li> Depois, os lados do lamínulas são selados com verniz. </li><li> Os slides podem ser mantidos em uma área de armazenamento escuro até que os resultados são observados e documentados. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para efeitos do nosso laboratório, um prato de 35 milímetros de culturas de células-tronco cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) é alocado para o procedimento de coloração imunocitoquímica para uso com o aparelho cytospin. As células são então coletados por meio de passaging enzimática, removendo o máximo da camada de MEF quanto possível, em uma suspensão de uma única célula. Se mais de isolamento de células-tronco eficaz a partir da camada MEF é desejada, as colônias podem ser manualmente escolheu entã...

<table><tbody><tr><td>Lâmina com Câmara Lab Tek Permanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Material para lâminas plásticas reutilizadas</td></tr><tr><td>Lâminas Microscópicas Superfrost/Plus Pré-limpas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Filtragem de 0,1-10&amp;mu;L</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Cobreglass para Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Meio de Montagem</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Soro Normal de Cabra</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal Anti-SSEA-4 de Camundongo</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Anticorpo Primário para Coloração de SSEA-4</td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal Anti-SSEA-3 de Rato</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>Anticorpo Primário para Coloração de SSEA-3</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-IgG de Cabra Conjugado com Camundongo</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Anticorpo Secundário para Coloração de SSEA-4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-IgG de Cabra Conjugado e Rotulado para Rato</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Anticorpo Secundário para Coloração de SSEA-3</td></tr><tr><td>DAPI, Dicloridrato</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um self-made aparelho cytospin

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) que incluem células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) são fontes de células emocionante devido à sua ilimitada capacidade de auto-renovação e seu potencial de se diferenciar em vários tipos de células. O estado de pluripotentes hPSCs é tipicamente avaliada por técnicas tais como qPCR, imunocitoquímica, e por outros<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt; Estratégias de diferenciação em vários tipos de células. Entre estas, as técnicas de imunocitoquímica têm sido desenvolvidos para a caracterização de rotina do estado indiferenciado de hPSCs com base na análise de biomarcadores candidato intracelulares e de superfície celular. Dado o fato de que hPSCs crescer como colônias, os problemas surgem em quantificar a expressão destes marcadores no nível da célula individual em uma base rotineira. Análises de citometria de fluxo serve para resolver este problema, mas requerem números de celular e uso de reagentes que normalmente não são propícias para a avaliação de rotina de controle de qualidade das culturas hPSC. Assim, o desenvolvimento de meios práticos e reprodutíveis de criação de amostras de células em monocamada com integridade preservada para avaliação marcador tem muitas vantagens nas pesquisas com células-tronco. Este beneficia muito a análise imunocitoquímica porque as células individuais da monocamada podem ser facilmente observados e quantificados para a expressão de marcadores específicos. Para atingir este objetivo, um self-made cytospin aparelho foi construído e otimizado para uso com coloração imuno-histoquímico. Dois marcadores de superfície celular (SSEA3/SSEA4) expressão foram analisados ​​em uma variante da linha de células-tronco BG01 para o objectivo deste protocolo.

Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), que incluem células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs), são células empolgantes...

Olá, meu nome é Rick Pasqua, aluno do Laboratório de Engenharia de Células-Tronco do Departamento de Ciências Químicas e da Vida da Universidade Estadual da Virgínia. Neste vídeo, demonstrarei como nosso laboratório utiliza um aparelho de centrifugação STO de baixo custo e fabricado internamente para criar uma monocamada observável de células-tronco pluripotentes humanas, a fim de quantificar marcadores de superfície celular. Como muitos protocolos IMUNOQUÍMICOS são adaptados para hPSCs cultivadas em lâminas com câmara em forma de colônias, podem surgir problemas na caracterização da expressão dos biomarcadores ao nível celular individual.Ter as células em uma monocamada auxilia não apenas na análise visual destas, mas possivelmente também na quantificação de sua expressão; o aparelho de espalhamento celular utilizado em nossos laboratórios pode ser construído com materiais encontrados na maioria dos laboratórios, necessita apenas de uma pequena amostra de células e não requer nenhum tipo de reagente específico. E, mais importante, é capaz de reproduzir de forma confiável uma dispersão de células isoladas para observação. Abaixo estão algumas das coisas necessárias para montar o ap

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imunocitoquímica é um poderoso método para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de medidas que permitirão uma anticorpos para conservar e tirar o máximo proveito da própria coloração.

Imunocitoquímica: células-tronco neurais

Células-tronco pluripotentes de crescimento em suspensão se diferenciar em corpos embrióides (EBs). Aqui demonstramos como obter criosecções de alta qualidade EB útil para estudar os aspectos celulares e moleculares da embriogênese, preservando a sua organização como agregados.

Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

A caracterização regular de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), para verificar a manutenção de seu estado pluripotente, é um passo importante antes que essas células sejam usadas para outras aplicações. Aqui descrevemos um método para a propagação em pequena escala de iPSCs humanas especificamente projetado para permitir sua caracterização fácil e rotineira via imunocitoquímica.

Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

Este protocolo apresenta um método simples de duas etapas de diferenciação de células-tronco epiteliais estroma corneana de células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de custo-eficiente, em larga escala de células de qualidade clínica aplicáveis ao uso de terapia de células da córnea.

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Aprenda a realizar imunocitoquímica em células-tronco pluripotentes humanas usando um aparelho de cytospin caseiro. Este método cria monocamadas celulares para quantificação confiável de marcadores de superfície como SSEA-3 e SSEA-4.

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

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