베타-글루코시다제 분석을 사용한 박테리아의 돌연변이 빈도 평가

유전자 변형 박테리아를 배양하십시오.

박테리아는 교정 활성에 결함이 있는 DNA 중합효소의 돌연변이 변이체를 발현하도록 유도되어 복제 오류의 가능성을 증가시킵니다.

이러한 오류는 조절 영역에서 자발적인 돌연변이를 유발할 수 있으며, 이는 베타-글루코시다제 유전자를 억제하고 베타-글루코시다제 효소의 발현을 유발합니다.

일정한 시간 간격으로 샘플을 수집하고 각 배양에서 박테리아 생성 수를 평가합니다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다.

펠릿을 완충액에 재현탁합니다.

투과성 용액을 첨가하고 혼합하여 박테리아막을 투과시킵니다.

투과화된 박테리아 샘플을 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.

박테리아에 들어가 베타-글루코시다제 효소와 반응하여 유색 제품을 생성하는 기질을 추가합니다.

색상 강도를 측정하여 베타-글루코시다제 활성을 결정합니다.

박테리아 배양에서 베타-글루코시다제 활성을 분석하여 세대에 걸친 돌연변이 빈도를 결정합니다.

pBAD-ε 및 pGOOD1-εD12A11 벡터를 포함하는 대 장균 TOP10의 단일 콜로니를 항생제로 처리된 LB 배지 1밀리리터로 옮깁니다.

배양액을 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 아침, 10밀리리터의 신선한 배지가 들어 있는 3개의 플라스크에 사전 배양 1에서 250으로 희석합니다. 유도제에 아라비노스, IPTG 또는 아라비노스 및 IPTG를 각각 1밀리몰씩 첨가하고, 유도된 배양액을 섭씨 37도에서 8시간 동안 배양한다.

유도되지 않은 배양균을 병렬로 준비합니다. 1밀리리터 분취량을 수집하고 유도제를 보충하거나 보충하지 않은 10밀리리터의 신선한 배지가 들어 있는 새 플라스크에 1-500으로 희석합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

다음날, 사전 배양액을 희석하는 것으로 시작하는 단계를 반복하고 1밀리리터 분취량을 수집합니다. 그런 다음 분취량을 냉동실에 넣습니다.

다음으로, 각 문화권에서 발생한 세대 수를 결정합니다. 100마이크로리터의 적절한 연속 희석액을 접종 및 배양액을 LB 플레이트에 옮깁니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 아침, LB 플레이트의 식민지를 세십시오.

접종물 또는 log I과 성장 종료 또는 log C의 배양물에 존재하는 세포 수의 로그를 계산하고 세대수를 결정합니다.

그런 다음 배양물을 5,000gs에서 20분 동안 원심분리하고 세포를 50밀리몰 트리스 HCL, pH 7.6, 50밀리몰 NaCl 1밀리리터에 재현탁합니다.

세포를 투과화하려면 클로로포름 2-3방울을 넣고 20초 동안 소용돌이치십시오.

마지막으로, 96웰 마이크로플레이트에서 각 분취량의 글루코시다제 활성을 결정합니다.

100마이크로리터의 투과화 세포와 100마이크로리터의 p-니트로페닐-D-글루코피라노사이드 기질을 사용하여 웰에 기포가 생성되지 않도록 각 웰에 추가합니다.

마이크로플레이트 리더와 필터를 사용하여 420나노미터에서 흡광도를 판독합니다.