어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다 사카로 미세스 세 레비 시아

다음 실험의 전반적인 목표는 복제가 증가함에 따라 돌연변이 빈도가 변화하는지 여부를 확인하는 것입니다. 효모 세포의 나이는 단순히 세포 분열의 추가 라운드나 축적 돌연변이 속도의 연령 특이적 변화에 기인합니다. 이는 먼저 선택적 및 비선택적 배지에 세포를 확산시킴으로써 젊은 세포의 돌연변이 빈도와 속도를 측정하여 각 세포 분열 라운드에 따른 돌연변이 축적으로 인해 연령이 증가하는 세포에 대한 예측된 돌연변이 빈도를 계산함으로써 달성됩니다.

다음으로, 액체 배양에서 성장한 비오틴으로 효모 세포 집단을 표지하고 원래 표지된 세포를 자기 분류로 회수하여 여러 세포 분열을 거친 노화된 모세포를 얻습니다. 그런 다음 노화된 모세포를 재성장시켜 나이를 증가시킨 다음 다시 분류하거나 엉덩이 흉터를 염색한 다음 평균 복제 연령 및 돌연변이 빈도를 결정하기 위해 선택적 및 비선택적 배지에 확산시킵니다. 관찰된 평균 연령. 이 방법은 누적된 유전적 손상 속도의 변화가 정상적인 노화에 기여하는지, 또는 부분적으로 돌연변이 속도의 변화로 인한 다양한 유전적 및 환경적 요인의 수명 변경 효과와 같은 노화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 Melissa Patterson이 표준 배양 조건에서 성장한 세포에 대한 변동 테스트를 사용하여 세포 생성당 기준 돌연변이 비율을 설정하는 것입니다. 각 복제 배양에 대해 세포를 1에서 2000까지 희석하고 1-4 마이크로 리터를 비 선택적 매체에 펴서 밀리리터 당 집락 형성 단위를 결정합니다. 마이크로 원심분리기에서 1분 동안 2, 400Gs로 남은 세포를 펠렛화하고 100마이크로리터의 물을 사용하여 돌연변이를 확인하기 위해 선택적 배지에 퍼지기 전에 다시 현탁시킵니다.

플레이트를 섭씨 30도에서 3일 동안 배양한 후, 콜로니를 세고, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 따라 초기 돌연변이 속도 및 빈도를 결정하고, 글리세롤 스톡에서 배양물을 YPD 배지에 줄무늬로 표시하여 먼저 섭씨 30도에서 1-3일 동안 배양합니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 최소 1ml의 물로 세포를 이동시킵니다. 줄무늬의 두껍게 자란 부분의 1-1.5cm는 8개의 세포에 약 10개의 세포를 제공한다는 것을 명심하십시오.

혈구 분석기를 사용하여 각 균주 또는 치료 조건에 대한 정확한 세포 밀도를 측정합니다. 5밀리몰 비오틴 시약 스톡을 사용하여 제조업체의 표준 절차에 따라 수집 지점당 10개에서 8개의 세포에 라벨을 붙입니다. 최종 세척 후 섭씨 4도에서 5분 동안 모든 원심분리 단계를 수행합니다.

물을 사용하여 표지된 세포를 최종 농도 10에서 밀리리터당 8개의 세포로 현탁시켜 세포 생존 능력을 확인하고 10마이크로리터의 세포를 23마이크로리터의 물과 67마이크로리터의 0.4%트라이암 블루로 희석할 수 있는 세포 생존 능력을 확인합니다. 하나의 XPBS에서 혈세포 분석기를 사용하여 살아 있거나 염색되지 않은 세포와 죽거나 염색된 세포를 점수화하기 전에 실온에서 40분 동안 세포를 배양합니다. 세포 연령 및 돌연변이 빈도에 대한 기준선 값을 측정한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 비오틴 표지 세포를 20ml의 YPD 배지로 옮깁니다. 여덟 개의 셀을 가장합니다.

섭씨 20도에서 16-18시간 동안 배양물을 밀리리터당 약 10-8개의 세포로 성장시킵니다. 세포가 고정상에 도달하지 않도록 하고 필요한 경우 세포를 몇 시간 동안 섭씨 4도로 유지하여 성장 기간 및 수집 시기를 최적화합니다. 세포 밀도를 측정하고 섭씨 4도에서 세포를 펠릿화한 후 30ml의 비드 라벨링, 완충액 및 볼텍싱을 첨가하여 세포를 세척한 다음 현탁액을 회전시키고 상등액을 붓습니다.

두 번째 세척 후, 50마이크로리터의 비드 라벨링 버퍼에 세포를 현탁시킵니다. 와류를 통해 총 8개의 세포를 가장합니다. 2 마이크로 리터의 마그네틱 비드를 추가하고 총 8 개의 세포를 가장하고 와류 한 후 주기적으로 뒤집어 10 분 동안 얼음 위에서 잠시 배양합니다.

다음으로, 30ml의 비드 라벨링 버퍼를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 0.5ml의 비드 라벨링 버퍼를 추가합니다. 총 8개의 세포를 가정하고 세포가 재현탁될 때까지 중간 설정에서 펠릿을 잠시 와류로 회전시킵니다.

40미크론 세포 여과기를 통해 현탁액을 50ml 튜브에 부어 남아 있는 세포 덩어리를 제거합니다. 필요한 경우 컬럼에 로드하기 전에 셀을 1-2시간 동안 얼음 위에 두십시오. 마그네틱 컬럼에 대해 제조업체에서 권장하는 프로토콜을 따라 최대 2배 10개에서 총 9개의 셀을 사용합니다.

컬럼을 적재할 때 공기가 잘 되는 모든 것을 제거하고 세척 사이의 분리기에 있는 컬럼을 제거 및 교체하여 세포가 비드 사이에 갇히는 것을 방지하십시오. 동일한 샘플의 여러 컬럼을 처리하기 위해 다중 컬럼 분리기를 사용하는 경우, 처리 시간을 줄이고 원하는 경우 세포 손실을 줄이기 위해 모두 동일한 수집 튜브로 용리합니다. 결합 및 세척 단계에서 흐름을 저장하여 모 세포가 생성하는 어린 세포를 분석한 후 세포를 3000Gs에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 농축한 후 1ml의 완충액을 제외한 모든 완충액을 흡인합니다.

8개의 원래 비오틴 표지 세포를 가장합니다. 그런 다음 잠시 와류를 일으켜 나머지 버퍼에 있는 세포를 현탁시킵니다. triam blue를 사용하여 희석된 세포의 부분 표본을 염색하고 혈류 세포 분석기를 사용하여 세포 밀도와 생존력을 측정합니다.

그런 다음 복구된 총 셀 수를 계산합니다. 세포 수가 예상보다 훨씬 많으면 용출 샘플을 다른 컬럼에 통과시켜 오염된 젊은 세포를 제거합니다. 셀 수가 예상보다 현저히 적으면 저장된 흐름을 통과시킵니다.

원하는 경우 모 세포의 수율을 개선하기 위해 다른 컬럼을 통해 샘플링합니다. 세포를 재성장시켜 복제 연령을 늘리고 비오틴 라벨링 없이 비드 라벨링 및 분류를 따릅니다. 복제 연령을 확인하려면 회수된 세포 25마이크로리터를 1.5ml 원심분리 튜브에 옮기고 1밀리리터의 XPBS를 사용하여 세포를 두 번 세척하고 세포 표면의 새싹 흉터를 표시합니다.

180마이크로리터의 XPBS 1개와 20마이크로리터의 형광 접합 WGA를 사용하여 세포를 재현탁시키고 1.5ml 원심분리기 튜브를 호일로 덮고 배양 후 30분 동안 섭씨 30도에서 부드럽게 흔들며 배양합니다. 하나의 XPBS를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 형광 현미경 검사의 경우 이미징 중 세포 이동을 피하기 위해 Antifa 시약을 사용하여 슬라이드에 세포를 장착합니다.

최대 며칠 동안 어둠 속에서 슬라이드를 완전히 경화시킵니다. 세포 나이의 대표적인 측정값을 얻기 위해 샘플당 최소 50개의 세포에서 새싹 흉터를 계산합니다. 또는, 하나의 세포를 현탁시킨 후, XPBS는 X축의 동일한 세포 집단에서 WGA 접합체 형광의 정규화된 기하학적 평균에 대해 Y축에서 현미경 검사로 계수한 어린 세포 및 나이 세포의 새싹 흉터 텍스트 프로토콜 그래프에 설명된 설정을 사용하여 유세포 분석을 수행합니다.

마지막으로, 이 관계에 대한 선형 추세선의 방정식을 구합니다.후속 대체를 위해, 방정식에서 X에 대한 세포 집단의 WGA 켤레 형광 강도의 정규화된 기하 평균을 구하고 Y를 풀어 샘플의 평균 세포 나이를 결정합니다. 이 그래프는 캔 원 유전자의 돌연변이 속도가 비오틴 표지 전과 후가 비슷했음을 보여줍니다: 독립적인 젊은 효모 집단에서 캔 원 돌연변이 빈도는 섭씨 20도 또는 섭씨 30도에서 성장했을 때 비오틴 표지 전과 후의 젊은 세포에서도 비오틴 표지 전후에 비슷했습니다. 여기에 표시된 그래프는 비오틴 라벨링 후 회수된 세포를 계수하고 처리되지 않은 세포 또는 1차 분류 후 1밀리몰의 과산화수소로 처리된 세포를 분류할 때 관찰할 수 있는 사항을 보여줍니다.

첫 번째 분류 후 세포 수가 예상보다 많이 나타날 수 있으며, 지속적인 분류로 인해 세포의 약간의 점진적 손실이 예상됩니다. 복제 연령은 형광 표지된 것을 수동으로 계수하여 결정되었지만, 이 그림에서 볼 수 있듯이 여기에서 볼 수 있듯이 세포의 흉터가 있습니다. 유세포 분석의 형광이지만 흉터 신호를 수동 계수와 비교하여 유세포 분석으로 모체 및 대조 세포 집단의 복제 연령을 결정할 수 있는 선형 관계를 얻었습니다.

이 그래프는 모세포의 평균 연령과 젊은 세포 집단에 대해 얻은 돌연변이 빈도 및 비율에서 계산된 예측 빈도와 비교하여 노화된 모세포의 관찰된 돌연변이 빈도와 유사하거나 증가된 사례의 예를 보여줍니다. 의 게놈 위치에 따라 하나의 유전자 이 절차를 따랐습니다. 반응성 산소 종에 대한 염색 또는 ular morphology에 대한 염색과 같은 다른 방법을 사용하여 세포 생리학의 어떤 변화가 돌연변이 축적의 노화 관련 변화와 관련이 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.