가변 수 탠덤 반복(VNTR) 분석을 이용한 어류 병원체 검출

포름아마이드 기반 변성 용액이 포함된 PCR 플레이트부터 시작하세요.

각 웰에 어류 병원성 박테리아에서 추출한 희석된 PCR 증폭체를 첨가합니다.

이 증폭세포들은 형광 표지가 부착된 가변수 탠덤 반복 서열(VNTR)을 포함하며, 이는 박테리아 식별을 위한 유전적 표지자로 사용되는 짧고 반복적인 서열입니다.

공기 방울을 제거하기 위해 플레이트와 원심분리기를 밀봉하세요.

플레이트를 열 사이클러로 가열해 이중 가닥 VNTR을 변성시키세요.

포르마마이드는 가닥 분리를 촉진하고 재어닐링을 억제합니다.

단가닥 DNA를 안정화하기 위해 플레이트를 빠르게 냉각하세요.

원심분리기를 사용해 샘플 부피를 수집합니다.

밀봉을 제거하고 플레이트를 프레임으로 고정하세요.

모세관을 삽입하고 모세관 전기영동을 수행합니다.

전기영동 동안 VNTR 조각은 전기장 하에서 모세혈관을 통과하며 크기에 따라 분리됩니다.

레이저는 각 조각의 형광 태그를 여기시켜 색상으로 구분된 신호를 생성합니다.

결과적으로 생성된 전기영동도는 병원성 박테리아에 대응하는 VNTR 피크 패턴을 보여줍니다.

PCR 증폭자가 확인된 후에는 새 PCR 스트립이나 플레이트를 사용해 정제된 물에 PCR 산물을 1에서 10까지 희석합니다. 소용돌이와 원심분리기, 잠깐. 연기 창고에서 작업할 때, 포름아마이드와 기준 크기 표준 용액으로 구성된 원심분리관에서 마스터 혼합물을 준비합니다.

분석할 PCR 산물 수에 따라 원고에 명시된 시약 부피를 사용하세요. 10% 여잉 부피를 허용하세요. 소용돌이를 잠시 일으켜 9.5 마이크로리터를 모세관 전기영동 시스템에 적합한 PCR 플레이트 위에 개별 웰에 분배합니다.

그 다음 희석된 PCR 산물 0.5마이크로리터를 추가합니다. 잠시 밀봉하고 원심분리기를 하세요. 그 후 샘플이 담긴 플레이트를 PCR 열사이클러에 넣고, 95도 섭씨에서 3분간 변성시킨 후 4도까지 무한히 냉각시킵니다.

1000g에서 1분간 원심분리 기를 한 뒤, 밀봉을 조심스럽게 제거한 뒤, 제조사 지침에 따라 보정된 모세관 전기영동 시스템에 플레이트를 장착하세요. 선택한 장치에 적합한 시약을 사용하여 모세관 전기영동을 단편 분석하고, 원고의 설명에 따라 실행 조건을 조정합니다.