DNA 기반의 어종 식별 프로토콜

어종 식별 시스템(Fish Species Identification System)은 주어진 샘플에 존재하는 어종을 식별하는 간단하고 빠르며 정확한 DNA 기반 방법입니다. 물고기 샘플은 proteinase K로 처리되어 핵산을 용액으로 방출합니다. 그런 다음 물고기 게놈 DNA를 분리하고 모든 물고기 게놈에서 발견되는 염기서열에 결합하는 프라이머를 사용하여 PCR을 증폭합니다.

그런 다음 PCR 산물을 세 가지 다른 제한 효소로 분해하고 Agilent 2100 bioanalyzer에서 분리합니다. 분해 반응에서 생성된 단편 길이는 제한 단편 길이 다형성 또는 RFLP 패턴 매칭 소프트웨어를 사용하여 어종을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 애질런트 테크놀로지스의 Rachel Formosa입니다.

오늘은 DNA를 기반으로 한 어종 식별 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차는 신선, 냉동, 다진 샘플, 조리된 샘플, 건조 된 샘플 또는 기타 가공 된 샘플에 존재하는 어종을 식별 할 수있는 스크리닝 방법입니다. 그리고 이것은 하루 이내에 완료할 수 있습니다.

우리는 이 절차를 사용하여 해산물의 진위를 연구하며, 이는 대체 및 잘못된 라벨링이 심각한 경제적, 환경적 및 식품 안전 결과를 초래할 수 있기 때문에 해산물 산업에 매우 중요합니다. 또한 시각적 식별 및 기타 전통적인 방법으로 어종을 결정하는 것이 특히 어려울 수 있습니다. 물고기가 처리되면 DNA 검사는 훨씬 더 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

시작하겠습니다. 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 각 생선에 10-1000mg의 원료 또는 조리된 어류 조직 샘플을 배치하여 DNA 추출을 위한 샘플 준비를 시작합니다. 220마이크로리터의 갓 준비된 proteinase 케이스 용액과 피펫을 위아래로 샘플링합니다.

배양 원심 분리기 후 섭씨 65도에서 10 분 동안 튜브를 14, 000 Gs에서 3-5 분 동안 배양하여 소화되지 않은 조직을 펠렛으로 만듭니다. 그런 다음 150 마이크로 리터의 각 상등액을 1.5 밀리리터의 새 튜브로 조심스럽게 옮기고 바닥에는 소화되지 않은 물질이 있고 상단에는 기름진 물질이 존재하지 않도록합니다. 상등액은 이제 게놈 DNA 추출에 사용될 것입니다.

각 샘플에 500마이크로리터의 핵산 결합 완충액을 추가하여 게놈 DNA 추출을 시작합니다. 이렇게 하면 총 샘플 부피가 650마이크로리터가 됩니다. 균질화될 때까지 샘플을 와류로 가열합니다.

다음으로, 각 샘플을 키트에 제공된 두 개의 밀리리터 용기 튜브 중 하나에 장착된 DNA 결합 스핀 컵으로 옮깁니다. 튜브의 캡을 스핀 컵 상단에 끼웁니다. 14, 000 Gs에서 1분 동안 샘플을 회전시켜 DNA를 스핀 컵 매트릭스에 로드합니다.

원심분리 후 스핀 컵을 제거하고 여과액을 버리고 컵을 용기 튜브에 다시 넣습니다. 500마이크로리터의 고염 세척 버퍼 1개를 추가합니다. 원심분리 후 튜브와 원심분리기를 다시 덮습니다.

여과액을 버리고 다시 스핀 컵을 용기 튜브에 다시 넣습니다. 이제 500 마이크로 리터의 80 % 에탄올을 추가하십시오. 튜브에 뚜껑을 닫고 1분 동안 14, 000G에서 회전합니다.

80% 에탄올에서 세 번째 세척 후 에탄올 세척을 두 번 더 반복하고 여과액을 버리십시오. 리셉터클 튜브의 스핀 컵을 교체하고 이번에는 2분 동안 회전하여 섬유 매트릭스를 건조시킵니다. 이제 스핀 컵을 1.5ml 수집 튜브로 옮깁니다.

컵 내부의 섬유 매트릭스에 있는 각 스핀 컵에 직접 100마이크로리터 진화 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 수집 튜브 캡을 스핀 컵에 끼우고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 배양 후 1분 동안 최대 속도로 샘플을 회전시킵니다.

다음으로 스핀 컵을 버리고 튜브를 덮습니다. DNA 농도를 측정하면 마이크로리터당 5나노그램에서 마이크로리터당 500나노그램 범위의 농도가 예상됩니다. DNA는 이제 장기 보관을 위해 최대 한 달 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있으며, DNA는 섭씨 영하 20도 또는 영하 80도에 위치합니다.

P-C-R-R-F-L-P 시약 키트에 제공된 프라이머와 시약을 사용하여 PCR을 수행합니다. 함께 제공되는 서면 프로토콜에 따라 PCR이 실행되는 동안 positive anti no template control을 포함하여 각 샘플을 실행하는 것이 좋습니다. 1.5 μl의 멸균 증류수 0.5 μl, 10 x 효소 완충액 0.5 μl, 10 x 효소 0.5 μl의 성분을 순서대로 결합하여 DTE E 1 HAE 3 및 NL 3 분해를 위한 제한 효소 마스터 믹스를 준비합니다.

모든 샘플과 1개의 반응 부피, 과량의 fourex 3개의 시약 혼합물에 대해 충분히 준비합니다. 그런 다음 샘플과 효소 이름이 표시된 각 반응 튜브에 2.5마이크로리터를 분배합니다. PCR이 완료되면 열 순환기에서 샘플을 제거하고 얼음 위에 놓습니다.

해당 반응을 위해 각 PCR 산물 2.5마이크로리터를 3개의 제한 분해 튜브 각각에 추가합니다. DDE 1 HAE 3, NLA 3. 다음 소용돌이.

간단히 원심분리하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 소화물을 배양합니다. 더 편리하다면 소화액을 하룻밤 동안 배양할 수도 있습니다. 분해 후 섭씨 65도에서 15분 동안 반응을 배양합니다.

그런 다음 각 튜브에 1마이크로리터의 60밀리몰 EDTA를 추가하여 반응과 와류를 종료합니다. 애질런트 bioanalyzer 시약 키트를 사용하여 제한 분해물을 준비하고 키트 가이드에 따라 A DNA 칩의 웰에 로드합니다. 각 샘플에 대해 세 개의 다이제스트가 모두 동일한 칩에 로드되어야 합니다.

그런 다음 칩을 와류로 만들고 기계에 로드합니다. 실행이 완료된 후 assay context로 이동하여 chip summary 탭을 선택합니다. 샘플 이름 필드에 칩의 12개 웰 모두에 대한 샘플 이름을 입력하여 테스트 DNA 샘플에 대한 어종을 식별합니다.

파일을 클릭하여 RFLP 디코더 프로그램을 시작합니다. 그런 다음 XAD 파일을 엽니다. 열린 대화 상자가 열립니다.

이제 사용된 DNA 칩에 대한 XAD 파일을 선택합니다. 그리고 열기를 클릭하여 칩에 로드된 샘플 목록을 확인합니다. 첫 번째 DNA 샘플에 해당하는 3개의 다이제스트를 선택합니다.

enzyme 열 아래에서, min peak height(최소 피크 높이)라고 표시된 필드에 사용된 제한 효소를 percent of lower marker(하위 마커의 백분율)로 지정합니다. 필요한 경우 기본값은 10%입니다. 이 값을 낮추어 놓친 작은 피크를 식별하거나 상승시켜 전기영체도에서 비특이적 노이즈로 인한 피크를 버릴 수 있습니다.

min peak height 값을 조정한 후 reintegrate를 클릭합니다. 이제 대화 상자 아래쪽에 있는 calc를 클릭합니다. bioanalyzer 실행에서 얻은 단편 길이 데이터는 소프트웨어 필드를 채웁니다.

다음으로 화면 왼쪽 상단 모서리에 있는 점수 드롭다운 목록에서 주사위를 선택합니다. 물고기 샘플이 단일 물고기 종 또는 혼합물로 구성된 경우, 샘플이 혼합물로 구성될 수 있는 경우, 화면 하단의 테이블은 결합된 점수 목록이라고 표시됩니다. 세 가지 소화 반응 모두의 결과를 기반으로 최상의 종이 일치합니다.

점수가 1인 완벽한 일치는 녹색으로 강조 표시됩니다. 근접 일치 항목은 화면 상단에서 노란색으로 강조 표시됩니다. 낮은 컷오프 값은 분석에 사용되는 최소 단편 크기를 지정하고, 일치 허용 오차 값은 일치로 간주되기 위해 단편이 예측된 단편에 얼마나 가까워야 하는지를 결정합니다.

표시된 값은 기본 설정이며 조정할 수 있습니다. 팁에 남아 있는 DNA 샘플을 분석하려면 이 단계를 반복합니다. 4개의 서로 다른 어종의 DNA 샘플을 이 비디오에 설명된 방법을 사용하여 분리, 증폭 및 소화했습니다.

제한 분해 샘플을 보여주는 바이오분석기 겔은 Agilent Bioanalyzer 및 RFLP 디코더를 사용하여 여기에 나와 있습니다. 여기에서 물고기를 식별하는 데 소프트웨어 굽힘 패턴이 사용됩니다. 첫 번째 샘플은 송어, 두 번째는 참치, 세 번째는 암석 토양으로 올바르게 식별됩니다.

그리고 마지막 샘플은 특정 대구입니다. 방금 애질런트의 P-C-R-R-F-L-P 분석법을 사용하여 DNA 기반 어종 식별을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 이 방법이 매우 민감하기 때문에 샘플의 교차 오염을 피하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 이제 샘플에 존재하는 어종을 빠르고 쉽고 정확하게 식별하는 방법을 알게 되었습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.