Name: 칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 배우세요 칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩 기법을 활용한 시냅스 생리학 연구 방법을. 쥐 뇌 조직을 저온 저칼슘 용액으로 보존하여 정확한 전기생리학적 측정이 가능한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공합니다.

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패치 클램프 설정 : 광학 : 좋은 세포를 찾으려면, 그리고 그것의 지위를 확립하기 위해 광학은 매우 중요합니다. 날카로운 모서리, 소프트 보이는 세포 : 세포의 명확한 이미지를보십시오. 첨부 꽃받침 잘 MNTB 교장 세포 찾기 위해 전체 필드를 검사합니다. 다른 각도에서 꽃받침의 복수를 찾는 요리를 회전합니다. 처음에는 그것은 풍선 모양의 터미널에서 연습을 확인합니다. 슬라이스의 표면에 세포를 선택하거나, 2 차 전지 레이어 인치 피펫과 세포의 첫번째 3분의 1 차를 대상으로 Calyxes을 파악하면 : 이중 막 (그림 1 참조)을 찾아, 그것이 꽃받침 있는지 확인 수 있도록 여러 각도에서 볼 수있는 슬라이스 접시를 돌린다. <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="그림 1" width="298" height="159" /> 그림 1 칼리의 깊이 : 칼리는 표면에이거나 가능한 표면에 가까이해야합니다. 패치를 사용할 수 표면 : 확인하기 위해 현미경에 사용 미세 초점 노프 방법 &quot;깊이 / 폭&quot;꽃받침입니다. 예를 들어, 잘 집중할 전체 차례 ~ 10 %는 당신에게에 패치 충분한 면적 이상을 제공할 것입니다. presynaptic 세포에 실링 : 연결된 세포에 도착하려면, 피펫의 POS 압력 (~ 0.15psi)에 의한 세포의 표면에 &quot;작은&quot;변형을보고, 아래와 전역, 피펫을 실행하는 조작하는 사람을 사용하여, 심지어로 필요한 경우와 같은 좋은 변형을 얻기 위해 presyn 단말기의 표면은, 다음, 압력을 릴리스하고 흡입을 적용합니다. PULSE, 데이터 수집 프로그램 : 처음 사용하기 전에 버퍼 크기를 증가하고, 언제든지 샘플링 용량을 필요로합니다. 수정된 매크로 매번로드해야합니다. 잠재 액체 융티온 : Presyn 녹화 솔루션 (부정적 11mV)입니다 - 11mV. Presyn : Cslow = ~ 15 PF presyn을위한 RS 광고 : 10 μsec, 65 % (더 많은 보상 수도 있습니다 가능한 W / 아웃 oscillations) 레코딩 용량하기 전에 테스트 현재 휴식 (10 뮤직 비디오, 10 밀리초 점프)이 휴식이 monoexponential되고 있는지 여부, 즉 presyn 용어가 하나의 구획으로 모델 수 있는지 여부. 필터 : 빠른 구성 요소를 놓쳤다하지 않도록 휴식을 측정하는 동안 30 kHz에서 10 kHz에서 (각각 베셀 필터 1, 2)에서 설정합니다. 미니 녹음하는 동안, Xinsheng 10 kHz에서와 5kHz를 사용합니다. LGW 우리가 미니의 상승 시간을 측정할 수 있도록 30 kHz에서에서만 필터 1 세트를 사용하는 나에게 물었다. 파일 이름 : 7 자리 mm 한달입니다 000mmxx (또는 달과 연도)과 XX는 핸드폰 번호입니다. 솔루션 라인 청소 : 0.1 M HCL 20 ML와 실험 끝에 청소 린스 200 ML ddH2O 다음. 외부 솔루션을 재활용, 펌프 속도는 20-30 RPM입니다. (목욕 챔버에서 돌아오는 솔루션 눈금 실린더에 다시 흐르고). 충분한 흡입을 보장하기 위해 3 나가는 라인을 설정합니다. 피펫 Presynaptic 녹화 솔루션 : ~ 310 밀리 Osmolar Presyn 솔루션 실험 기간 동안 R - 액세스 증가를 방지하기 위해 ~ 310 mOsm해야합니다. Presyn 피펫 솔루션은 postsyn 피펫 용액 (Presyn은 은퇴한에 대한 ATP 및 GTP 수 있습니다.) 다릅니다. TTX - 티 솔루션 (CA 전류를 분리) : <ul><li> 솔루션 블록 K - 채널에서 차 같이, 세포에, 실링, 또는 패치 이후에 적용하려고하고 세포를 depolarizes. 이것은 세포에 좋은하지 않습니다. 같은 이유로, 그것은 TTX가 적용된 후 슬라이스를 다시 사용할 수 없을 수도 있습니다. </li><li> 세포 또는 장기 탈분극의 효과를 확인하기 위해 슬라이스의 첫 번째와 마지막 응답을 비교합니다. </li><li> 효과가 빨리되도록 TTX는 1 μm의 대신에 0.5 μm의에 사용됩니다. 솔루션을 변경한 후에는 더 적은 시간을 기다릴 필요. </li></ul> 절단 조각 Vibratome 설정 : <ul><li> 70Hz 수평 진동 </li><li> 진폭 : 1.0 mm </li><li> 꽃받침 조각과를 깎다가 전달 0.1 달리 두께가 0.01-0.02 mm / 초 속도 : 180 μm의를 (~ 150이전 동물 μm의) </li></ul> 조각은 1 시간 (절삭 시간을 포함), 즉 15~20분 절단 후 욕조에서 떠날에 대한 37 º C에서 알을 품다. Pipettes : Presyn : 처음 MΩ 3.5-4.5, 3.0-3.5 MΩ 더 자신감 설정을 설정하는 풀러 설명서를 사용합니다. 유리 두께 때문에 지연 기능을 사용하여 (200 또는 1 일의 지연) 유리 유형 : Borosilicate, 표준 벽, 아니 필라멘트 외경 : 2.0 mm 내경 1.16 mm 길이 : 7.5 cm

칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

우리는 헬드, 포유류의 중추 신경의 신경 단말기의 꽃받침에 presynaptic 패치 클램프 녹음을위한 기본 기술을 보여줍니다. presynaptic 터미널에서 전기 녹음 작업 잠재력, 칼슘 채널 전류, 소포의 융합 (exocytosis)와 후속 막 이해 (endocytosis)의 측정을 수 있습니다. 신경 전달 물질을 포함한 vesicles의 융합이 꽃받침의 세포막에 추가하는 소포 막 발생합니다. 세포막의 금액이 증가 커패시턴스의 증가로 측정됩니다. 커패시턴스의 후속 감소 endocytosis, 멤브레인 이해 또는 꽃받침 막에서 제거하는 과정을 나타냅니다. Endocytosis은 꽃받침의 구조를 유지하기 위해 필요하고 또한 앞으로 exocytosis 이벤트에 대한 신경 전달 물질로 가득합니다 vesicles를 형성하는 것이 필요합니다. 개최의 꽃받침에 커패시턴스 레코딩은 가능한 직접 빠르게 소낭성의 릴리스와 포유 동물 CNS 신경 터미널에서 후속 endocytosis을 측정하기 위하여 만들었습니다. 또한, 해당 postsynaptic 활동이 동시에 결합하여 레코딩을 사용하여 측정할 수 있습니다. 따라서 중추 신경계의 버렸네에서 presynaptic 및 postsynaptic 전기 활동의 완전한 그림이 준비를 사용하여 달성됩니다. 여기, 슬라이스 준비, 개최, 기본 패치 클램핑 기술 꽃받침의 복수의 식별 형태학의 기능 및 exocytosis와 endocytosis를 측정 커패시턴스 레코딩의 예제에 대한 방법은 제공됩니다.

우리는 포유류 중추신경계의 신경 말단인 Held calyx에서 시냅스 전 패치 클램프 기록을 위한 기본 기술을 시연합니다. ...

안녕하세요, 제 이름은 Ken Paradiso입니다. 저는 Bethesda 캠퍼스에 위치한 NIH의 국립 신경질환 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Intramural 프로그램에서 Ling Gang Wu 교수님과 함께 연구하고 있습니다. 지금부터 calyx-held presynaptic recording 패치 클램핑 기술을 보여드리겠습니다.뇌 조직을 준비하기 위해, 쥐로부터 뇌를 적출합니다. 적출한 뇌를 얼음처럼 차가운 저칼슘 용액에 넣으며, 이때 뇌에 항상 산소가 공급될 수 있도록 카보젠(carbogen)을 계속해서 버블링해 줍니다. 또한 손상을 최소화하기 위해 용액의 온도를 매우 낮게 유지해야 합니다.이제 뇌는 이 용액에 담겨 있을 것입니다. 뇌를 꺼내어 블록에 고정할 수 있도록 적절하게 절단한 후, Sano correlate 또는 순간접착제를 사용하여 블록에 장착합니다. 그런 다음 챔버를 얼음처럼 차가운 저칼슘 용액으로 채우고, 버블링을 수행한 뒤 바이브레이토메이터 위에 올립니다. 이후 두께 180 to 190 µm로 슬라이스를 절단하며, 이때 블레이드 주파수는 70 Hz, 전진 속도는 0.01 to 0.02 mm/s로 설정합니다. 이는 초당 10 to 20 µm에 해당하는 속도입니다.각 슬라이스를 제작한 후, 얼음처럼 차가운 식염수에서 일반 칼슘 용액이 들어 있는 이 챔버로 슬라이스를 옮깁니다. 이 용액은 기록 시 사용하는 것과 동일하며 37°C의 생리적 온도로 유지됩니다. 그런 다음 회복을 위해 슬라이스를 이곳에 둡니다.생리학 실험을 수행하기 전, 여기에 30분에서 1시간 동안 보관합니다. 이제 뇌를 용액에서 꺼내겠습니다. 시연을 위해 더 큰 뇌를 준비했습니다.이것은 P 20 쥐의 뇌입니다. 이를 뒤집어 보겠습니다. 우리가 관심을 가지고 있는 부분은 뇌줄기입니다.따라서 이 아래쪽 영역과 꽃받침(calyx)이 유지된 곳이 바로 여기 이 부근입니다. 이제 나머지 뇌 부분을 절단하여 뇌줄기를 분리한 다음, 슬라이싱 챔버(slicing chamber)에서 사용할 수 있도록 뇌줄기를 준비하겠습니다. 좋습니다, 이제 뇌줄기만 분리하기 위해 나머지 뇌 부분을 잘라내겠습니다.현재 위치를 보여드리기 위해 뒤집겠습니다. 보통은 이런 방식으로 하지 않으며, 다시 말씀드리지만 이 부분 전체를 그냥 제거해도 됩니다. 다시 원래대로 뒤집으면

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

우리는 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 패치 클램프 녹음 (CRAC) 말초 혈액 mononuclear 세포 - 파생 인간 T의 lymphocytes의 전류에 대한 단계별 절차를 제공합니다.

인간의 T Lymphocytes에서 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 기록 (CRAC) 해류

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 - 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

세포외이입 후, 융합된 원형질막은 세포내이입(endocytosis)으로 알려진 과정을 통해 회수됩니다. 이 메커니즘은 다음 방출을 위해 새로운 시냅스 소포를 형성합니다. 개별 내포성 이벤트는 마우스 부신 크로마핀 세포에서 세포 부착 커패시턴스 기록을 사용하여 캡처되고 분석됩니다.

마우스 부신하는 chromaffin 세포에서 세포 부착 된 정전 용량 측정을위한 방법

본 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 H9c2 심근 세포에서 전압 게이트 칼륨 (Kv) 채널 전류의 실시간 및 동적 획득을위한 효율적인 방법을 설명합니다.

전체 세포 패치 클램프 기술을 통한 H9C2 심근 세포에 전압 의존적 칼륨 전류 기록

이것은 유리 micropipettes의 모양을 수정하는 가이드입니다. 특히, 열 및 공기 압력을 사용하여 테이퍼가 낮은 피펫 저항을 선도 팁 오프닝을 증가하지 않고 확대됩니다. 이것은 작은 세포의 낮은 소음 녹음을 얻는 것이 중요합니다하지만 많은 응용 프로그램에서 유용합니다.

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

배우세요 칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩 기법을 활용한 시냅스 생리학 연구 방법을. 쥐 뇌 조직을 저온 저칼슘 용액으로 보존하여 정확한 전기생리학적 측정이 가능한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공합니다.

칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

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