칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

안녕하세요, 제 이름은 Ken Paradiso입니다. 저는 NIH의 베데스다 캠퍼스에 위치한 국립 신경 장애 및 뇌졸중 교내 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke Intramural program)에서 Ling Gang Wu를 위해 일하고 있습니다. 나는 당신에게 caly에 대한 기술을 보여 드리겠습니다 : 시냅스 전 기록 패치 클램핑을 유지했습니다.

그래서 뇌 조직을 준비하기 위해 쥐에서 뇌를 제거합니다. 우리는 뇌를 이 용액 안에 넣는데, 그것은 얼음처럼 차갑고 칼슘이 적은 용액이며, 뇌에 항상 산소가 공급되도록 하기 위해 탄수화물로 부글부글 끓을 것입니다. 또한 손상량을 최소화하기 위해 DA를 최소화하기 위해 얼음처럼 차가워야 합니다.

그래서 뇌는 이제 이 해결책 안에 있을 것입니다. 우리는 그것을 꺼내고, Sano 상관 관계 또는 미친 접착제로 블록에 장착 할 수 있도록 블록에 넣을 수 있도록 적절하게 자르지 만 챔버를 얼음처럼 차갑고 낮은 칼슘 용액으로 채우고 거품을 일으키고 진동기에 배치 한 다음 70 헤르츠의 주파수 블레이드 주파수와 0.01에서 0.02 밀리미터의 순방향 고급 속도에서 두께로 180-190 미크론으로 슬라이스를 자릅니다 초. 따라서 초당 10-20미크론이 됩니다.

각 조각이 만들어지면 얼음 차가운 식염수에서 일반 칼슘 용액이 들어 있는 이 챔버로 조각을 옮깁니다. 이것은 우리가 기록한 것과 동일한 용액이며 37도의 생리학적 온도입니다. 그런 다음 복구를 위해 여기에 조각을 넣습니다.

생리학 실험이 실행되기 전에 30분에서 1시간 동안 여기에 머무릅니다. 그래서 여기 저는 뇌를 가지고 있고 그것을 해결책에서 끌어낼 것입니다. 따라서 이것은 시연 목적으로 더 큰 뇌입니다.

이것은 P 20 쥐에서 나온 것입니다. 우리가 뒤집어 줄게. 우리가 관심을 갖는 것은 뇌간입니다.

그래서 여기 아래의 이 지역과 꽃받침이 붙잡고 있는 이 지역은 바로 저기 그 지역에 있습니다. 그래서 우리가 할 일은 뇌의 나머지 부분을 잘라내고, 뇌간을 분리한 다음, 뇌간을 절단실로 만들 준비를 하는 것입니다. 자, 이제 뇌간의 나머지 부분을 잘라내고 뇌간을 분리해 보겠습니다.

우리가 어디에 있는지 보여주기 위해 그것을 뒤집을 것입니다. 일반적으로 우리는 이런 식으로 하지 않을 것이고, 다시 말하지만, 우리는 그 전체 부분을 제거할 수 있습니다. 다시 뒤집어서 우리는 뇌간을 분리했고 바로 거기에서 또 다른 절단을 하고 있습니다.

좋아요, 그게 다입니다. 그것이 바로 뇌간입니다. Held의 꽃받침은 바로 거기에 있습니다.

이것이 바로 뇌간입니다. 다시 말씀드리지만, 조금 뒤로 미룰 것입니다. 소뇌의 한쪽을 잘라내면 뇌간이 이렇게 옆으로 놓일 수 있습니다.

우리는 약간의 Sano 아크릴 접착제를 넣고 옆으로 눕혀 놓고 차가운 얼음, 차가운 저칼슘 용액으로 빠르게 채웁니다. 가능한 한 빨리 산소 라인을 연결하십시오. 이제 그것을 집어 비브라토로 가져옵니다.

우리는 뇌의 시작 부분에 도달하기 위해 그것을 빠르게 가져온 다음 뇌의 시작 부분에 도달하면 속도를 초당 0.01mm로 떨어뜨립니다. 따라서 초당 10마이크로입니다. 그래서 믿을 수 없을 정도로 느린 속도로 움직이

뇌의 첫 번째 부분은 사다리꼴 몸체의 내측 나일스인 mtb가 있는 부분입니다. 그리고 그것이 들어있는 부분이기 때문에 일단 전사 피펫에 넣으면 가능한 한 피펫 끝에 가깝게 가져 오려고 노력합니다. 그리고 거기에는 뇌의 한 조각이 있는데 저는 그것을 이 방으로 재빨리 옮겼는데, 그 안에는 정상 수준의 칼슘과 더 높은 온도의 표준 기록 용액이 들어 있습니다.

그러면 슬라이스 절차 후에 생리학 실험에서 준비된 슬라이스를 회복할 수 있습니다. 자, 여기서부터는 같은 일이 반복될 것입니다. 다음 장비는 패치 클램핑을 수행하는 데 사용할 장비입니다.

우리는 고정 스테이지 정립 현미경을 가지고 있습니다. 내가 말했듯이 스테이지는 고정되어 있으므로 현미경은 매니퓰레이터에서 그 아래로 움직입니다. 우리는 가발과 Newman 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 무대, 앰프의 헤드 스테이지를 잡고 heca의 EPC 10 패치 클램프 앰프를 사용합니다.

그리고 제가 또한 언급했어야 할 것은 우리가 적외선으로 DIC를 사용한다는 것입니다. 여기에 IR 카메라가 있어 CAE를 찾을 때 우리가 보는 모든 것이 화면에 표시됩니다. 패치 클램프 증폭기는 Heca의 Pulse라고도 하는 이 소프트웨어에 의해 제어되며 증폭기와 모든 생리학 실험을 제어합니다.

결과가 이 화면에 나타납니다. caly는 큰 시냅스 전 말단이며, 크기 때문에 터미널에 물리적으로 패치를 붙일 수 있습니다. 그래서 우리는 시냅스 전 기록을 할 수 있는데, 그것은 특히 중추신경계에서 독특한 일입니다.

따라서 이를 통해 시냅스 전에 활성화된 칼슘 채널을 측정할 수 있습니다. 또한 꽃받침으로 이어지는 신경을 자극하려는 경우 활동 전위 활동도 측정할 수 있습니다. 이 실험실에서 우리가 하는 일은 신경전달물질이 포함된 소포와 막이 융합하는 엑소사이토시스(exocytosis)라는 과정을 측정하는 것입니다.

이제 그 소포에서 소포는 엑소사이토시스(exocytosis)라고 불리는 과정에서 막과 융합하여 시냅스 말단에 막을 추가하고, 우리는 그것을 커패시턴스의 변화로 측정할 수 있습니다. 멤브레인이 터미널에 추가됨에 따라 커패시턴스가 증가하므로 오늘 보여드릴 실험은 멤브레인이 제거될 때 시냅스 전에 커패시턴스를 측정하는 것입니다. 따라서 멤브레인을 계속 추가할 수는 없으며 물론 일부를 제거해야 합니다.

이 과정을 세포내이입(endocytosis) 또는 막 흡수(membrane uptake)라고 합니다. 우리는 또한 그것을 측정할 수 있으며 이는 커패시턴스 레벨의 감소로 측정될 것이며 나중에 그 예를 보여줄 것입니다. 이제 이를 통해 칼슘 채널 활동을 모니터링하고 외포작용과 세포내이입에 관여하는 일부 단백질을 모니터링하고 연구할 수 있습니다.

우리는 엑소(exo) 또는 세포내이입(endocytosis)에 관여하는 단백질을 차단하기 위해 펩타이드(peptides)와 같은 것을 넣을 수 있습니다. 우리는 또한 같은 일을 하는 독소를 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 말단으로 들어오는 칼슘의 양을 조절할 수 있기 때문에 엑소사이토시스 과정, 신경전달물질의 방출, 그리고 그 사건에 뒤따르는 막의 흡수를 실제로 연구할 수 있습니다.

이것은 당사의 세포 내 기록 솔루션을 포함하는 튜브입니다. 우리는 미리 준비한 다음 얼려 놓고 일반적으로 새로운 솔루션을 만들기 전에 몇 주에서 한 달 동안 사용할 수 있습니다. 다시 말씀드리지만, 녹음을 하기 직전에 저희는 항상 일정량의 먼지 입자 또는 다른 종류의 파편이 튜브에 들어갈 것이라고 생각했습니다.

다음 두 가지 중 하나를 수행할 수 있습니다. 용액을 꺼내서 걸러내거나 1-2분 동안 회전시킨 다음 용액을 떼어내어 내부에 파편과 기타 물질이 있는 바닥 부분을 남길 수 있습니다. 그래서 저는 돌리는 것을 선호하고 지금 당장 할 것입니다.

이것은 우리의 세포 내 용액을 담고 있는 튜브입니다. 해동되었습니다. 작은 원심분리기에서 약 2-3분 동안 회전시킬 예정인데, 이 정도면 용액에서 큰 먼지 입자를 제거하기에 충분할 것입니다.

그래서 이제 저는 방금 뽑은 용액인 상단을 휘젓지 않도록 주의하면서 깨끗한 튜브로 옮기고 약 90%를 떼어냅니다. 다시는 그러지 않으려고 노력하고, 마지막 한 조금이라도 그러지 않으려고 노력한다. 그래서 나는 거기에서 바로 멈출 것입니다.

이것을 나는 실험하는 동안 따뜻하고 차갑게 유지되도록 즉시 얼음에 넣었습니다. 그것은 매우 중요합니다. 이것은 우리의 피펫 중 하나입니다.

우리는 이것을 세포 내 녹음에 사용합니다. 그것은 두꺼운 벽으로 된 보어 실리카 유리이며 외경이 2mm, 내경이 1.16mm입니다. 먼저, 우리가 하는 일은 피펫을 다시 채우는 것입니다.

그래서 우리는 흡입을 적용하고, 피펫을 기록 용액에 넣고, 흡입을 적용하여 피펫의 아주 끝부분을 채우려고 시도하는데, 그렇지 않으면 다른 방법으로는 채워지지 않습니다. 이 작업을 마치면 모세관 튜브를 사용하여 파이펫 뒷면을 잡고 전극의 나머지 부분을 채웁니다. 이것은 표준 생리학 기술이며 말 그대로 튕기는 것입니다.

피펫의 끝이 부러질 위험이 있지만, 그렇게하지 않으면 종종 기포가 생길 수 있습니다. 자, 이제 패치 플랜트 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 피펫 홀더에 올려 놓습니다. 저기 은색 염화선이 있습니다.

염화은은 용액과 접촉하게 되며, 이를 통해 시냅스전 말단의 전기 활동을 측정할 수 있습니다. 그래서 우리가 하는 일은 CAE가 많은 슬라이스를 찾는 것입니다. 우리는 높은 밀도의 CAE를 원합니다.

그래서 이것은 우리가 사다리꼴 몸체의 내측핵인 MNTB를 찾고 있으며, 그곳에서 꽃받침을 형성하는 말단 또는 꽃받침 앱이 어떻게 발견되는지를 찾습니다. 그래서 우리가 할 일은 슬라이스를 스캔하기 시작하는 것입니다. 예를 들어, 저기 표면에서 약간 떨어진 꽃받침이 있고 패치할 것이 많지 않기 때문에 계속 스캔합니다.

그래서 이것은 우리가 찾고있는 꽃받침입니다. 내가 만든 것은 피펫이 갈 위치에 화면에 두 개의 표시입니다. 보시다시피 제가 피펫 iss를 쫓아갈 꽃받침 조각

양압을 가하여 꽃받침에 대항하여 밀어 올리게 한 다음 양압을 완화할 것입니다. 그런 다음 꽃받침이 피펫에 대고 위로 밀어 올리고 그 시점에서 매우 부드러운 흡입을 적용하고 멤브레인을 빨아서 밀거나 멤브레인을 피펫 팁에 밀봉하려고 합니다. 좋아, 긍정적 인 압력이 완화되었습니다.

이제 흡입을 적용하겠습니다. 그래서 우리는 프로입니다, 우리는 5 밀리볼트 펄스 또는 실제로 4 밀리볼트 펄스를 적용하고 있습니다. 좋아요, 그게 다입니다. 그래.

이제 멤브레인 전위(약 80)를 낮추고 빠른 과도 붐을 취소합니다. 이제 우리는 전체 세포로 갈 것입니다. 나는 부드러운 흡입을 적용하고 도매로 가려고 노력할 것입니다.

그 충전 과도 현상은 그가, 피펫과 셀이 이제 연속적이며, 그가 도매 녹음을 가지고 있음을 나타냅니다. 또 다른 아름다운 장면입니다. 그래서 더 밝은 빨간색은 커패시턴스 트레이스였고, 보시다시피 갑작스런 점프가 있었고 그 다음에는 감소했습니다.

좋아요, 방금 꽃받침 시냅스 전 말단에서 녹음을 얻는 기본 기술을 보여드렸습니다. 사다리꼴 몸체의 내측핵을 포함하는 슬라이스를 만드는 방법을 보여드렸습니다. 그것이 당신이 꽃받침을 붙잡고 있는 곳을 찾을 수 있는 곳입니다.

그리고 저는 여러분에게 슬라이스를 들여다보는 기술을 보여드렸습니다. 각 슬라이스를 살펴보면서 표면에 가장 많은 수의 caly가 있는 슬라이스를 찾습니다. 그런 다음 찾을 수 있는 가장 큰 caly membrane을 찾고 그 위에 클램프 레코드를 패치할 것입니다.

그리고 패치 클램프 녹음 기술도 보여드렸는데, 이것이 바로 표준 패치 클램프 녹음 기술입니다.