가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

이 실험 절차의 전반적인 목적은 Corning Hypers 스택 용기의 올바른 밀폐 시스템 사용법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 중력 공급 방식을 통해 용기에 배지를 접종하고 채웁니다. 그다음, 각 층에서 세포 현탁액을 분리하여 세포를 배양합니다.

배양 후, 사용한 배지를 제거합니다. 절차의 마지막 단계는 hypers stack 용기에서 세포를 회수하는 것입니다. 최종적으로, hypers stack 밀폐 시스템을 사용했을 때 세포가 공배양 유동성(co fluency)까지 성장하는 동안 산소에 접근할 수 있는 능력을 보여주는 가스 확산 결과가 도출됩니다.

가스 투과성 소재를 사용한 hypers stack vessel의 주요 장점은 세포 성장을 위한 표면적을 증가시킨다는 점입니다. vessel 내의 헤드스페이스를 제거함으로써, 이제 제 동료 p pardo가 hypers stack vessel을 사용하기 위한 폐쇄형 시스템 프로토콜을 시연하겠습니다. hypers stack vessel은 상단 플레이트와 가스 투과성 필름으로 구성된 개별 세포 배양 구획인 stat으로 이루어져 있습니다.

세포는 이 구획 내에서 배양됩니다. 액체 매니폴드는 모듈 내에서 각각의 ette 층을 서로 연결합니다. 모듈들은 튜빙으로 연결되어 12개 층의 배수로 구성됩니다.

매니폴드를 통해 사용자는 전체 용기에 대해 한 번의 유체 조작을 수행할 수 있습니다. 공기 매니폴드는 정적 층들을 서로 연결하며, 유체가 추가될 때 용기 내의 공기를 밀어내는 데 사용되고 각 층 사이의 충전 과정에서 사용할 충전 라인을 포함하고 있습니다. 정적 층은 기관 공간(tracheal space)이라고 불리는 개방된 공기 공간으로, 각 층의 가스 투과성 막을 통해 가스 교환이 일어날 수 있도록 합니다.

액체 핸들링 튜브는 액체 매니폴드에 연결되어 있으며, 멸균 상태를 유지하면서 과잉 공기를 배출하기 위해 모든 폐쇄 시스템 유체 조작에 사용되는 맞춤형 구성 요소입니다. 벤트 튜브가 사용됩니다. 벤트 튜브는 공기 매니폴드에 연결되어 있으며 공기 필터를 포함하고 있습니다.

액체 핸들링 튜브에는 용기를 채운 후 튜브 내의 잔류 액체를 제거하는 데 사용되는 체이스 튜브와 필터가 연결되어 있습니다. 또한, 본 프로토콜에서는 사용 중에 용기를 정확한 위치에 배치하는 것을 돕는 핸들링 장치인 Corning Stack manipulator(CSM)가 사용됩니다. 본 시연에서는 가스 투과성 36층 용기를 이용한 밀폐형 시스템 세포 배양이 시연됩니다.

하지만 CSM을 사용하는 경우, 충전 웨지를 사용하여 12층 용기에서 이 절차를 수행하는 상세 내용은 함께 제공되는 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 미디어 튜브에 접종하기 전, 3.9리터의 백 미디어를 준비하는 것으로 시작하십시오. 혈청 백을 미디어 백에 연결하여 적신 후, 원하는 혈청 농도가 되도록 충분히 혼합하십시오.

대형 백 클램프를 사용하여 백 내 배지 약 300 milliliters를 잠급니다. 이렇게 하면 충전 과정에서 접종된 모든 세포가 사용되며, 배지 백에 세포가 남지 않게 됩니다. 배지를 접종하기 위해 배지 백을 백 스탠드에 거치합니다.

튜브가 연결된 주사기에 세포 현탁액을 채웁니다. 세포 현탁액이 담긴 주사기를 튜브 웰딩으로 배지 백에 연결합니다. 주사기에서 백까지 16인치 튜브 3개를 연결합니다.

세포 현탁액을 배지 백에 주입하고 잘 섞어줍니다. 접종된 배지 백은 튜브 웰딩이나 다목적 커넥터를 사용하여 배양 용기의 3/8인치 액체 핸들링 튜브에 연결할 수 있습니다. 오늘은 튜브 웰딩을 사용하여 진행하겠습니다.

용기의 액체 핸들링 및 체이스 튜브의 클램프를 닫습니다. 36층 용기를 CSM의 로드 위치에 배치합니다. 벤트 필터 튜브를 CSM의 홀딩 클램프에 겁니다.

뚜껑을 조이고 CSM을 충전 위치로 이동시켜 공기 필터를 가장 높은 위치에 배치함으로써 충전 작업 중 젖는 것을 방지합니다. 10도의 각도는 충전 중에 충전 라인에서 공기를 제거하여 액체가 층별로 평형을 이루도록 돕습니다. 체이스 튜브 클램프를 닫은 상태로 배지 백을 용기와 동일한 높이에 배치하십시오.

액체 핸들링 튜브 클램프와 배지 백 클램프를 열어 유체가 용기로 들어갈 수 있게 합니다. 백 스탠드를 사용하여 배지 백을 들어 올려 세포 현탁액이 용기로 잘 흘러 들어가도록 합니다. 접종된 배지가 모두 용기에 들어갈 때까지 용기를 채웁니다.

배지 백의 상단 부분에는 여전히 300 milliliters의 배지가 남아 있어야 합니다. 액체가 상단 공기 매니폴드에 도달함에 따라 용기 채우기를 계속하려면 배지 백에서 클램프를 제거하십시오. 과충전을 방지하기 위해 배지 백의 높이를 낮추어 충전 속도를 늦추십시오.

액체 수위를 충전선까지 천천히 높인 후 액체 핸들링 튜브를 클램프로 고정합니다. CSM 내의 용기를 격리 위치로 이동시키고 두 세트의 매니폴드를 모두 가장 높은 위치에 둡니다. 배지 백을 용기 높이보다 낮게 내립니다.

체이스 필터를 수직으로 세운 상태에서 체이스 튜브 클램프를 엽니다. 이렇게 하면 액체 핸들링 튜브 내의 배지가 배지 백으로 다시 비워지거나 밀려나게 됩니다. 튜브가 비워지면 배지 백 튜브의 클램프를 닫습니다.

체이스 튜브 필터를 수직 상태로 유지합니다. 용기의 액체 핸들링 튜브에 있는 클램프를 열어 남아 있는 액체가 용기로 들어가 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 이 과정이 완료될 때까지 1~2분 동안 기다립니다.

다음으로, 매니폴드가 왼쪽에 오도록 CSM 내의 용기를 돌립니다. 용기를 CSM의 로드 위치로 내립니다. 체이스 튜브와 액체 핸들링 튜브 양쪽의 클램프를 닫습니다.

이제 배지 백을 용기에서 제거하거나, 이후 회수 과정에서 사용하기 위해 부착된 상태로 둘 수 있습니다. 부착된 배지 백을 보관하려면, 배지 백을 말아서 용기 보관 트레이의 고정 밴드 아래에 놓으십시오. 마지막으로, 용기를 인큐베이터로 옮깁니다. 용기를 운반할 때는 액체가 공기 배출 필터로 들어가지 않도록 주의하십시오.

이는 매니폴드 끝부분을 약간 위쪽으로 기울여 수행합니다. 수확 절차를 시작하기 위해, 세포 결합 용액 튜브와 퀀치 백을 서로 용접하여 수확 백 어셈블리를 형성하고, 모든 튜브 클램프가 닫혀 있는지 확인하십시오. 인큐베이터에서 용기를 꺼내 CSM의 로드 위치에 배치하십시오.

고정 밴드 아래에서 배지 백을 분리하여 백 거치대에 겁니다. 옆에 서서 뚜껑을 조여 용기를 고정합니다. 벤트 튜브를 홀딩 클램프에 걸고 CSM을 충전 위치로 이동시킵니다.

백 스탠드에 걸린 배지 백이 용기보다 낮게 위치해 있는지 확인하십시오. 배지 백 튜브와 용기의 액체 핸들링 튜브의 클램프를 열어 배지가 연결된 백으로 흐르게 하십시오. 용기가 약 4분의 3 정도 비워지면, CSM 설정을 최종 비우기 위치로 변경하십시오.

용기와 액체 핸들링 튜브가 비었을 때, 튜브를 들어 올려 폐배지 백 튜브의 클램프 너머로 배지를 밀어냅니다. 그 다음 액체 핸들링 튜브의 클램프와 폐배지 백 튜브의 클램프를 모두 닫습니다. 튜브 웰딩을 통해 폐배지 백을 수확 백 어셈블리로 교체합니다.

백 스탠드를 사용하여 세포 해리 백 어셈블리의 높이를 용기 높이보다 높게 올립니다. CSM을 충전 위치에 둡니다. 세포 해리 용액 튜브 클램프와 수확 백 어셈블리 클램프를 열고 용액을 용기로 옮깁니다.

이송이 완료되면 액체 핸들링 튜브와 세포 해리 용액 튜브의 클램프를 잠급니다. 다음으로, 수평 위치 레버를 연 상태에서 CSM을 로드 위치로 이동시킵니다. 휠을 사용하여 용기 측면을 부드럽게 좌우로 흔들어 용액이 세포층에 골고루 퍼지게 합니다.

용액이 균일하게 분포되도록 유지하기 위해 로킹 과정 중 가끔 용기를 충전 위치로 되돌릴 수 있습니다. 용액이 충분히 분포되면 CSM의 레버를 놓아 충전 위치로 고정합니다. 세포에 필요한 해리 시간 동안 용기를 이 위치에 둡니다.

탁도를 기준으로 세포의 탈착 여부를 판단하십시오. 세포가 탈착되면 CSM을 로드 위치로 이동시킵니다. 퀀치 백 클램프와 액체 핸들링 튜빙 클램프를 열어 퀀치 배지가 용기로 유입되도록 합니다.

액체 핸들링 튜브의 클램프를 잠급니다. 이송이 완료되면 CSM을 로드 위치로 되돌리고, 수평 위치 조절 레버를 잡아 용기 쪽을 좌우로 흔듭니다. 백 스탠드를 사용하여 수확 백 어셈블리의 위치를 용기 높이보다 낮게 내립니다.

CSM을 비움 위치로 조정합니다. 용기 액체 처리 튜브 클램프를 열고 세포 용액을 퀜치 백으로 다시 옮깁니다. CSM을 로드 위치로 되돌리고 튜브 실러를 사용하여 용기에서 수확 백 어셈블리를 분리합니다.

이제 세포 용액을 전통적인 세포 성장 시스템에서 처리할 준비가 되었습니다. Headspace 방식에서는 배지 내의 산소가 3일 동안 평균 50% 소모됩니다. 배양 중인 상태에서, 이 수치는 동일한 성장 시스템 내 세포 수준에서 시간 경과에 따른 리터당 밀리그램 단위의 산소 감소량을 나타내며, 3 mm의 배지 높이를 가로지르는 산소 구배는 세포층보다 배지와 Headspace의 접합부에서 거의 50% 더 높게 나타납니다.

세포 성장 중 hypers 스택의 기관 공간 내 산소 백분율을 나타낸 결과입니다. 해당 그림은 96시간 동안 각 가스 투과성 필름 바닥에 산소를 공급하는 층 사이의 산소 백분율이 일정하게 유지됨을 보여줍니다. 이는 세포가 합류(confluency) 상태에 이를 때까지 성장하는 동안 산소에 원활하게 접근할 수 있음을 입증합니다.

이 영상을 시청하신 후에는 폐쇄형 시스템에서 Corning Hypers stack vessel을 채우고 수확하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.