Name: 가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 배우세요 Corning HYPERStack 용기를 사용한 닫힌 체계 세포 배양 프로토콜로 고수율 부착 세포 배양 및 효율적인 세포 수확 방법을 익히세요.

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저자는 폐쇄 시스템 지식, 가방 디자인, 가방 실러스 및 용접의 대출뿐만 아니라 HYPERStack의 회로도에 가방을 만드는 그들의 도움을 Lonza 워커스빌 감사하고 싶습니다.

1. HYPERStack 용기 - 가스 투과 재료 기술 배경 <ol><li> HYPERStack 우주선은 세포의 대사에 대한 76.2micron 가스 침투성 폴리머 필름을 통해 가스 교환에 의존 세포의 폐쇄 시스템 culturing위한 multilayered 함선입니다. </li><li> HYPERStack 선박은 선박 내부의 세포 위에 "헤드 스페이스"를하지 않는 더 많은 전통적인 세포 배양 용기에서 다릅니다. 오히려 선박 내의 가스 교환이 "상부"를 포함하는보다, 가스 투과 제품은 대기 개방 각 문화 챔버 아래에 공기 공간 ( "tracheal"공백으로 함)합니다. </li><li> 이 tracheal 공간 상응하는 가스 교환을하기 위해 선박의 각 세포 배양 구획에 성장 세포 수 있습니다. </li><li> 가스 투과 필름은 멸균 환경을 유지하면서 가스 교환이 발생할 수 있습니다. 여러 레이어의 각각에 대해 모든 유체 조작은 단일 입력 포트를 통해 발생합니다. </li></ol> 2. HYPERStack 선박 구성 요소 요약 <ol><li> Stackette는 상단 플레이트 및 가스 투과 필름으로 구성되어 있습니다 각각의 세포 배양 구획이다. 세포는이 구역 내에 양식입니다. </li><li> 액체 매니폴드는 HYPERStack 모듈 내에서 함께 12 stackette 레이어 각각 연결합니다. 모듈 12 레이어의 배수에서 혈관 형성 튜브와 연결됩니다. 매니폴드는 사용자가 전체 선박 한 유체 조작을 할 수 있습니다. </li><li> 에어 매니폴드도 함께 stackette 레이어를 연결하지만 유체 추가가 발생할 때 혈관에서 공기를 치환하는 데 사용됩니다. 그것은 충전하는 동안 사용할 수있는 입력 줄이 포함되어 있습니다. </li><li> Tracheal 공간 가스 교환은 각 레이어 '가스 투과 필름을 통해 발생할 수 있도록, 각 stackette 레이어 사이의 야외 공간입니다. </li><li> 액체 처리 튜브는 액체 연료에 연결된 모든 폐쇄 시스템 유체 조작을하는 데 사용됩니다. 이 구성 요소는 사용자 정의할 수 있습니다. </li><li> 벤트 튜브는 공기 매니폴드에 연결된 공기 필터를 포함하고 불임을 유지하면서 과잉 공기를 공개하는 데 사용됩니다. </li><li> 체이스 튜브는 필터와 클램프를 가지고 있으며 액체 처리 튜브에 연결되어 있으며, 혈관을 기입 후 액체 처리 튜브에서 유체 대피하는 데 사용됩니다. </li><li> 코닝 스택 조작하는 사람 또는 CSM 사용시 올바른 위치에있는 혈관을 배치 지원하는 처리 장치입니다. </li><li> 필링 웨지는 스테인레스 스틸 수동 HYPERStack 혈관을 작성 때 사용 지원됩니다. </li></ol> 3. HYPERStack 선박에서 사용되는 가스 투과 필름을 통해 가스 확산 결과 <ol><li> 통풍 헤드 스페이스 전통적인 세포의 성장 시스템에서 미디어에있는 산소는 문화 3 일 50 % 이상의 평균 소진됩니다. (그림 1) </li><li> 같은 세포 성장 시스템에서 미디어의 3mm 높이의 산소 기울기는 셀 계층에서보다 상부 접합에 언론에 거의 50% 큽니다. (그림 2) </li><li> 76.2micron 가스 투과 폴리스티렌 필름을 통해 산소의 확산은 미디어의 2.6mm 통해 확산 같습니다. HYPERStack 선박에 사용되는 가스 투과 필름은 가스 교환이 셀 계층에서 발생 할 수 있습니다. </li><li> 세포 합류로 성장할로 HYPERStack 선박의 tracheal 공간에 산소의 %는 상수이다. (그림 3) </li></ol> 4. 미디어 가방 준비 <ol><li> HYPERStack - 12 계층 우주선 미디어 1.3L 소요되며 HYPERStack - 36 계층 우주선 미디어 3.9L 걸립니다. </li><li> 전에 체포 미디어를 inoculating하는 혈청은 사용할 수있다면, 튜브는 미디어 가방에 혈청 가방 용접 철저히 섞는다. </li><li> 큰 가방의 클램프를 사용하여 봉투에 미디어의 약 300 ML를 고정. 이것은 모든 주사 세포 입력하고 아무도 미디어 가방에 남아 없습니다 중에 사용되도록합니다. 가방 스탠드에 플레이스 미디어 가방. </li></ol> 5. Inoculating 미디어 <ol><li> 세포 현탁액와 연결된 튜브와 주사기를 입력합니다. 미디어 가방에 세포 현탁액을 포함하는 주사기에서 튜브 용접 3 / 16 "튜브. </li><li> 미디어 가방에 세포 현탁액을 주사 잘 섞는다. </li></ol> 6. 프로 시저 작성 <ol><li> 튜브는 HYPERStack 우주선의 3 / 8 "액체 취급 튜브. (연결 무균 또는 다목적 (MPCs) 연결을 사용하여, 당신이 또한 선박에 미디어 가방을 연결할 수)에 주사 미디어 가방 용접. </li><li> HYPERStack에 액체 처리 및 추적 튜브에 클램프를 닫습니다. </li><li> 후크 환기 필터 튜브 CSM에있는 지주 클램프로, 부하 위치에 CSM에 HYPERStack 36 레이어 선박 놓으십시오. 뚜껑을 조여하여 입력 위치로 CSM 이동합니다. 정확한 입력 위치로 혈관을 넣어, 공기 필터는 채우기 작업 중에 젖음 방지를 위해 최상의 위치에 지금있다. 10 ° 각도 허용 equilibr작성 중에 레이어에 액체 에이션. 작성 쐐기에 미치는 측면에 배치 HYPERStack - 12 계층 우주선이 작성을위한 올바른 위치에 있습니다. </li><li> HYPERStack 우주선 (높은 아님)과 같은 수준에서 가방을 위치하여 입력 라인에서 맑은 공기. 추적 튜브 클램프가 닫힌 상​​태로 유지하고, 혈관을 입력 유체 수 있도록 액체 처리 튜브 클램프 및 미디어 가방 클램프를 엽니다. </li><li> 가방 스탠드를 사용하여 선박에 세포 현탁액의 흐름을 돕기 위해 미디어 가방을 올립니다. </li><li> 주사 미디어의 모든 혈관을 입력 때까지 용기를 채우, 미디어의 300 ML은 여전히​​ 미디어 가방의 상단 부분에 유지됩니다. 혈관을 작성 계속 미디어 가방에서 클램프를 제거합니다. 액체는 상부 공기 매니폴드를 접근으로 작성을 통해 방지하기 위해 미디어 가방을 낮추는 방법으로 채우기 속도를 느리게. 천천히 채워 줄 수있는 액체 레벨을 가지고 있으며 액체 처리 튜빙을 클램프. </li></ol> 7. 레이어로 액체를 잠글 수 절연 절차 <ol><li> manifolds 두 세트가 가장 높은 위치에 있으므로 절연 위치로 CSM에 HYPERStack 선박을 지참하고 선박의 높이 아래 미디어 가방을 낮추십시오. HYPERStack - 12 레이어 선박은 선박의 측면에 손을 넣어하고 충전 쐐기를 리프트에 다른 사용하여 격리 위치로 해제하실 수 있습니다. </li><li> 직립 자세에서 열린 체이스 필터, 더 체이스 튜브 클램프를 엽니다. 이것은 미디어 가방에 다시 액체 처리 튜브 미디어를 비어 있거나 추적합니다. 튜브가 비어되면, 미디어 가방 튜빙의 클램프를 닫습니다. </li><li> 수직 위치에 추적 튜브 필터를 유지, 남은 액체는 용기에 입력하고 평형 수 있도록 HYPERStack에있는 액체 처리 튜브에 클램프를 엽니다. 이 발생 1-2 분 동안 기다리십시오. </li><li> manifolds이 왼쪽에 있도록 CSM에 HYPERStack 선박을 돌립니다. CSM의 부하 위치로 함선을 낮춥니다. 왼쪽으로 약간 HYPEStack - 12 레이어 혈관을 로킹하면 충전 쐐기의 제거를 허용합니다. 추적 및 액체 처리 튜브 모두에​​서 클램프를 닫습니다. </li><li> 미디어 가방 이제 선박에서 제거되었거나 그것은 나중에 수확 절차에 사용하기 위해 첨부된 남아있을 수 있습니다. 첨부된 미디어 가방을 저장하려면 HYPERStack 선박의 저장 트레이에 유지 밴드 아래 빈 가방과 가방에 남아있는 미디어 및 장소 롤. </li><li> 인큐베이터에 HYPERStack 용기를 이동합니다. 선박 관리를 나르는 때 공기 필터를 입력부터 액체 유지로 이동해야합니다. 이것은 약간 위쪽으로 HYPERStack의 매니폴드 끝을 팁하여 수행됩니다. </li></ol> 8. 수확 프로토콜 <ol><li> 수확 절차를 시작하려면 튜브는 수확 가방 어셈블리를 형성하기 위해 함께 세포 분리 솔루션과 담금질 가방을 용접. 모든 튜브 클램프이 닫힌 확인하십시오. (설명하기 만화를 사용) </li><li> 인큐베이터에서 H​​YPERStack 선박을 제거, 유지 밴드 아래에서 미디어 가방 출시하고, 가방 스탠드 만요. 부하 위치에 CSM에있는 혈관을 장소와 선박을 확보하기 위해 뚜껑을 조입니다. 지주 클램프에 환기 튜빙을 연결하여 입력 위치로 CSM 이동합니다. </li><li> 미디어 가방 관 그리고 미디어 첨부된 가방 흘러 수 있도록 선박의 액체 처리 튜브에 클램프를 열고, 가방 스탠드에있는 미디어 가방이 HYPERStack보다 낮은 걸려 있는지 확인 만들기. </li><li> 일단 혈관이 약 어 비어, 최종 빈 위치에 CSM 설정을 변경합니다. HYPERStack의 선박 및 액체 처리 튜브가 비어있는 경우 보낸 미디어 가방 튜브에 클램프 과거 미디어를 추적하기 위해 튜브를 들고 다음 액체 처리 튜브에 클램프 및 지출 미디어 가방 튜브에 클램프를 모두 닫습니다. </li><li> 튜브 용접에 의해 수확 가방 어셈블리와 함께 보낸 미디어 가방 교체하고 가방 스탠드를 사용하여 HYPERStack의 높이 위의 세포 분리 가방 조립의 높이를 올립니다. </li><li> 평균의 위치에 CSM를 놓습니다. 세포 분리 솔루션 관 HYPERStack에 솔루션을 클램프 및 전송 엽니다. 전송이 완료되면, 액체 처리 튜브 및 전지 분리 솔루션 튜브에 클램프를 닫습니다. </li><li> 부하 위치에 CSM을 가져와. 수평 위치 레버 열고으로 부드럽게 세포 레이어를 통해 솔루션을 배포, 바퀴를 사용하는쪽으로 선박 쪽 바위. 배는 가끔 솔루션의 동등한 분배를 유지하기 위해 락을 동안 평균 위치로 제공될 수 있습니다. 그것은 레이어가 완전히 코팅하는 시각 나타나지 않을 수도 있지만, 해리 솔루션은 균등 세포의 표면에 걸쳐 배포됩니다. 솔루션 적절하게 배포되면, 부하 위치에 HYPERStack을 잠글 수있는 CSM에있는 레버를 놓습니다. 이 위치에 HYPERStack를 남겨주세요당신의 세포에 필요한 분리 시간 동안. </li><li> 일단 세포가 분리가, 가이드로 탁도를 사용하여 평균 위치에 CSM 이동합니다. 치료는 이상 세포를 소화하지 않도록해야합니다. 담금질 미디어 선박을 입력 수 있도록 담금질 가방 클램프 및 HYPERStack 액체 처리 튜브 클램프를 엽니다. 전송이 완료되면 HYPERStack 액체 처리 튜브에 클램프를 닫습니다. </li><li> 부하 위치에 CSM을 반환하고 측면에 선박쪽으로 문제를 일으키고 수평 위치 레버를 잡아. </li><li> 가방 스탠드를 사용하여 HYPERStack의 수준 아래의 수확 가방 어셈블리의 위치를​​ 낮춥니다. 선박 액체 처리 관은 끄지 가방에 다시 셀 솔루션을 클램프 및 전송 열고, 빈 위치로 CSM을 조정합니다. 부하 위치에 CSM을 반환하고 튜브 실러를 사용하여 선박에서 수확 가방 어셈블리를 분리합니다. 세포 솔루션은 처리를위한 준비가 된 것입니다. </li></ol> 9. 대표 결과 <ul><li> 시간을 수확하면 가스 투과 폴리스티렌 표면에 표준 폴리스티렌 표면에서 변환시 최적화해야합니다. 세포는 HYPERStack 제품에 빠르게 출시하는 경향이있다. </li><li> 현미경으로 세포를 볼 수있는 통풍구와 액체 처리 튜브가 해제 고정되어 있어야합니다. manifolds는 현미경의 무대에서, 아래 방향으로 거꾸로 HYPERStack 용기를 놓습니다. </li><li> 예방 단계는 그들이 작동을 중지하게됩니다 사용하는 동안 필터를 젖음 방지로 이동하실 수 있습니다. 안으로 HYPERStack 선박을 입력하고 클램프가 열려있을 때 통풍구와 체이스 튜브가 고가 유지를 통해, 더 젖음가 발생해서는 안됩니다. </li><li> 튜브의 폐쇄 클램프의 압력은 클램프가 열린 후 그것이 닫힌 상​​태로됩니다. 반대 방향으로 튜브를 곤란하게하는 것은 그것을 열립니다. </li><li> 입력 및 중력 피드를 통해 HYPERStack 선박을 종료 미디어 흐름 시간은 HYPERStack 선박 미디어의 최상위 수준과 미디어 컨테이너 미디어의 최상위 레벨 사이의 미디어 높이 차이에 따라 달라집니다. 큰 거리, 흐름을 빠르게. 최대 유량은 1.5L/min하는 필터의 평가에 의해 제한됩니다. </li><li> HYPERStack 선박에 적절한 입력 볼륨을 유지하면 세포 성장 챔버의 공기 방울 형성​​을 방지할 수 있습니다. 공기 방울은 샘플링이나 증발 물의 손실로 인해 unhumidified 환경에서 잠복기로 인해 발생할 수 있습니다. 추가 유체는 최종 사용자가 추가되어야하는 경우뿐만 아니라 배양 조건으로 샘플링 금액 및 주파수 결정됩니다. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 표준 세포 배양 용기에서 미디어의 산소 고갈. 그림 3 일 동안 세포의 수준에 MG / L 산소의 감소를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 표준 세포 배양 용기에서 미디어에 산소 기울기. 그림은 산소의 MG / L은 셀 계층에서보다 상부 교차로에 미디어에서 가장 큰 것입니다 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 세포 성장 동안 HYPERStack의 tracheal 공간에 산소의 비율입니다. 그림 96 시간 이상, 각 기체 투과 필름 바닥을 공급 레이어 사이에 산소의 비율은, 지속적인 유지 보여줍니다. 이것은 confluency로 성장하는 동안 산소를 액세스하는 세포의 능력을 보여줍니다.

7,745,209 : HYPERStack 용기 가스 투과 기술은 미국 특허 #에 적용됩니다. 저자는이 문서에서 사용되는 악기를 생산하는 코닝 생명 과학, 병원의 직원입니다.

HYPERStack의 우주선이 성공적으로 성장, 기본 및 줄기 세포를 설계했습니다. 그릇에 액체를 첨가가 중력에 의해 공급하며 또한 살균 미디어 컨테이너에서 펌핑하여 무균 가방 연결을 통해 실시되었다. 혈관 성장 지역의 이상 증가 2.5X 대 같은 체적 면적의 스택 플레이트 제품을 제공합니다. HYPERStack - 12 6천cm이 성장 지역, HYPERStack - 36이 1만8천cm이 성장 지역 및 HYPERStack - 120 성장 지역의 6만cm이 있습니다.있다 표면적을 증가함으로써, 사용자는 동일한 세포 인구 또는 많은에서 더 많은 세포를 생산하고 다양성을 줄일 수 있습니다. 그들은 또한 동일한 셀 출력을 달성하거나, 사람, 청정실 스위트 또는 incubators을 추가하지 않고 셀 출력을 높이기 위해 적은 혈관을 사용하여 공간 및 / 또는 노동을 저장할 수 있습니다. 시스템은 낮은 입자 조립 방법과 접착제를 사용하지 않고 생산됩니다. 그것은 삼중 체포 및 살균 제공 튜브 세트 및 필터와 preassembled되는 폐쇄 시스템입니다.

<table><tbody><tr><td>1.5L 백형 배지</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350ml 배지 + 150ml 혈청 (필요 시)</td></tr><tr><td>4.0L 백형 배지</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600ml 배지 + 400ml 혈청 (필요 시)</td></tr><tr><td>HYPERStack Vessel-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>HYPERStack Vessel-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>충전 쐐기(Filling Wedge)</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>스택 조작기(Stack Manipulator)</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>HyQtainer 하위 어셈블리 샘플링 장치</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>600ml 백형 배지 퀀처(10% FBS IMDM)</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>600ml 세포 해리 용액</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

가스 투과 재료 기술로 hyperstack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

대량 자기편 세포 배양은 microcarrier 비즈가 최적의 선택이 아닐 때 현재 스택 플레이트 세포 성장 제품을 표준화합니다. HYPERStack 선박은 현재 스택 플레이트 제품 폐쇄 시스템 규모를 허용하고 동일한 용적의 면적에&gt; 2.5X 더 많은 세포를 제공합니다. HYPERStack 선박 가스 교환이 발생할 수 있습니다 기체 투과 자료를 통해 기능은, 따라서 선박 내에서 내부 헤드 스페이스에 대한 필요가 없습니다. 헤드 스페이스의 제거는 세포 성장이 최소화 될 발생하는 구획이 동일한 체적의 풋프린트 내에서 세포 성장 표면 영역의 많은 레이어를 수 있도록 공간을 줄일 수 있습니다. 이러한 세포 치료 또는 예방 접종 생산 많은 어플 리케이션을 위해, 폐쇄 시스템은 세포 성장과 수확이 필요합니다. HYPERStack 선박 미디어 가방 또는 기타 방법으로 튜브를 통해 세포 및 시약뿐만 아니라 및 제거 가능합니다. 이 프로토콜은 세포, 폐쇄 시스템 세포의 성장 프로토콜, 다양한 수확 방법의 대사 요구를 충족하기 위해 HYPERStack의 선박, 가스 확산 결과에 사용되는 가스 투과 물질 뒤에 기술을 설명합니다.

기술, 프로토콜 및 높은 수율 자기편 세포 배양에 사용되는 코닝 HYPERStack의 선박 및 액세서리의 취급에 소개. 프로토콜은 현재의 스택 플레이트 제품 이상 증가 세포 수확에 대한 폐쇄 시스템 선박을 사용하는 방법을 보여줍니다.

가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

마이크로캐리어 비드(microcarrier beads)가 최적의 선택이 아닐 때, 대용량 부착 세포 배양은 현재 적층형 플레이트(stacked plate) 세포 성장 제품을 통해 표준화되어 있습니다.

이 실험 절차의 전반적인 목적은 Corning Hypers 스택 용기의 올바른 밀폐 시스템 사용법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 중력 공급 방식을 통해 용기에 배지를 접종하고 채웁니다. 그다음, 각 층에서 세포 현탁액을 분리하여 세포를 배양합니다.배양 후, 사용한 배지를 제거합니다. 절차의 마지막 단계는 hypers stack 용기에서 세포를 회수하는 것입니다. 최종적으로, hypers stack 밀폐 시스템을 사용했을 때 세포가 공배양 유동성(co fluency)까지 성장하는 동안 산소에 접근할 수 있는 능력을 보여주는 가스 확산 결과가 도출됩니다.가스 투과성 소재를 사용한 hypers stack vessel의 주요 장점은 세포 성장을 위한 표면적을 증가시킨다는 점입니다. vessel 내의 헤드스페이스를 제거함으로써, 이제 제 동료 p pardo가 hypers stack vessel을 사용하기 위한 폐쇄형 시스템 프로토콜을 시연하겠습니다. hypers stack vessel은 상단 플레이트와 가스 투과성 필름으로 구성된 개별 세포 배양 구획인 stat으로 이루어져 있습니다.세포는 이 구획 내에서 배양됩니다. 액체 매니폴드는 모듈 내에서 각각의 ette 층을 서로 연결합니다. 모듈들은 튜빙으로 연결되어 12개 층의 배수로 구성됩니다.매니폴드를 통해 사용자는 전체 용기에 대해 한 번의 유체 조작을 수행할 수 있습니다. 공기 매니폴드는 정적 층들을 서로 연결하며, 유체가 추가될 때 용기 내의 공기를 밀어내는 데 사용되고 각 층 사이의 충전 과정에서 사용할 충전 라인을 포함하고 있습니다. 정적 층은 기관 공간(tracheal space)이라고 불리는 개방된 공기 공간으로, 각 층의 가스 투과성 막을 통해 가스 교환이 일어날 수 있도록 합니다.액체 핸들링 튜브는 액체 매니폴드에 연결되어 있으며, 멸균 상태를 유지하면서 과잉 공기를 배출하기 위해 모든 폐쇄 시스템 유체 조작에 사용되는 맞춤형 구성 요소입니다. 벤트 튜브가 사용됩니다. 벤트 튜브는 공기 매니폴드에 연결되어 있으며 공기 필터를 포함하고 있습니다.액체 핸들링 튜브에는 용기를 채운 후 튜브 내의 잔류 액체를 제거하는 데 사용되는 체이스 튜브와 필터가 연결되어 있습니다. 또한, 본 프로토콜에서는 사용 중에 용기를 정확한 위치에 배치하는 것을 돕는 핸들링 장치인 Corning Stack manipulator(CSM)가 사용됩니다. 본 시연에서는 가스 투과성 36층 용기를 이용한 밀폐형 시스템 세포 배양이 시연됩니다.하지만 CSM을 사용하는 경우, 충전 웨지를 사용하여 12층 용기에서 이 절차를 수행하는 상세 내용은 함께 제공되는 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 미디어 튜브에 접종하기 전, 3.9리터의 백 미디어를 준비하는 것으로 시작하십시오. 혈청 백을 미디어 백에 연결하여 적신 후, 원하는 혈청 농도가 되도록 충분히 혼합하십시오.대형 백 클램프를 사용하여 백 내 배지 약 300 milliliters를 잠급니다. 이렇게 하면 충전 과정에서 접종된 모든 세포가 사용되며, 배지 백에 세포가 남지 않게 됩니다. 배지를 접종하기 위해 배지 백을 백 스탠드에 거치합니다.튜브가 연결된 주사기에 세포 현탁액을 채웁니다. 세포 현탁액이 담긴 주사기를 튜브 웰딩으로 배지 백에 연결합니다. 주사기에서 백까지 16인치 튜브 3개를 연결합니다.세포 현탁액을 배지 백에 주입하고 잘 섞어줍니다. 접종된 배지 백은 튜브 웰딩이나 다목적 커넥터를 사용하여 배양 용기의 3/8인치 액체 핸들링 튜브에 연결할 수 있습니다. 오늘은 튜브 웰딩을 사용하여 진행하겠습니다.용기의 액체 핸들링 및 체이스 튜브의 클램프를 닫습니다. 36층 용기를 CSM의 로드 위치에 배치합니다. 벤트 필터 튜브를 CSM의 홀딩 클램프에 겁니다.뚜껑을 조이고 CSM을 충전 위치로 이동시켜 공기 필터를 가장 높은 위치에 배치함으로써 충전 작업 중 젖는 것을 방지합니다. 10도의 각도는 충전 중에 충전 라인에서 공기를 제거하여 액체가 층별로 평형을 이루도록 돕습니다. 체이스 튜브 클램프를 닫은 상태로 배지 백을 용기와 동일한 높이에 배치하십시오.액체 핸들링 튜브 클램프와 배지 백 클램프를 열어 유체가 용기로 들어갈 수 있게 합니다. 백 스탠드를 사용하여 배지 백을 들어 올려 세포 현탁액이 용기로 잘 흘러 들어가도록 합니다. 접종된 배지가 모두 용기에 들어갈 때까지 용기를 채웁니다.배지 백의 상단 부분에는 여전히 300 milliliters의 배지가 남아 있어야 합니다. 액체가 상단 공기 매니폴드에 도달함에 따라 용기 채우기를 계속하려면 배지 백에서 클램프를 제거하십시오. 과충전을 방지하기 위해 배지 백의 높이를 낮추어 충전 속도를 늦추십시오.액체 수위를 충전선까지 천천히 높인 후 액체 핸들링 튜브를 클램프로 고정합니다. CSM 내의 용기를 격리 위치로 이동시키고 두 세트의 매니폴드를 모두 가장 높은 위치에 둡니다. 배지 백을 용기 높이보다 낮게 내립니다.체이스 필터를 수직으로 세운 상태에서 체이스 튜브 클램프를 엽니다. 이렇게 하면 액체 핸들링 튜브 내의 배지가 배지 백으로 다시 비워지거나 밀려나게 됩니다. 튜브가 비워지면 배지 백 튜브의 클램프를 닫습니다.체이스 튜브 필터를 수직 상태로 유지합니다. 용기의 액체 핸들링 튜브에 있는 클램프를 열어 남아 있는 액체가 용기로 들어가 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 이 과정이 완료될 때까지 1~2분 동안 기다립니다.다음으로, 매니폴드가 왼쪽에 오도록 CSM 내의 용기를 돌립니다. 용기를 CSM의 로드 위치로 내립니다. 체이스 튜브와 액체 핸들링 튜브 양쪽의 클램프를 닫습니다.이제 배지 백을 용기에서 제거하거나, 이후 회수 과정에서 사용하기 위해 부착된 상태로 둘 수 있습니다. 부착된 배지 백을 보관하려면, 배지 백을 말아서 용기 보관 트레이의 고정 밴드 아래에 놓으십시오. 마지막으로, 용기를 인큐베이터로 옮깁니다. 용기를 운반할 때는 액체가 공기 배출 필터로 들어가지 않도록 주의하십시오.이는 매니폴드 끝부분을 약간 위쪽으로 기울여 수행합니다. 수확 절차를 시작하기 위해, 세포 결합 용액 튜브와 퀀치 백을 서로 용접하여 수확 백 어셈블리를 형성하고, 모든 튜브 클램프가 닫혀 있는지 확인하십시오. 인큐베이터에서 용기를 꺼내 CSM의 로드 위치에 배치하십시오.고정 밴드 아래에서 배지 백을 분리하여 백 거치대에 겁니다. 옆에 서서 뚜껑을 조여 용기를 고정합니다. 벤트 튜브를 홀딩 클램프에 걸고 CSM을 충전 위치로 이동시킵니다.백 스탠드에 걸린 배지 백이 용기보다 낮게 위치해 있는지 확인하십시오. 배지 백 튜브와 용기의 액체 핸들링 튜브의 클램프를 열어 배지가 연결된 백으로 흐르게 하십시오. 용기가 약 4분의 3 정도 비워지면, CSM 설정을 최종 비우기 위치로 변경하십시오.용기와 액체 핸들링 튜브가 비었을 때, 튜브를 들어 올려 폐배지 백 튜브의 클램프 너머로 배지를 밀어냅니다. 그 다음 액체 핸들링 튜브의 클램프와 폐배지 백 튜브의 클램프를 모두 닫습니다. 튜브 웰딩을 통해 폐배지 백을 수확 백 어셈블리로 교체합니다.백 스탠드를 사용하여 세포 해리 백 어셈블리의 높이를 용기 높이보다 높게 올립니다. CSM을 충전 위치에 둡니다. 세포 해리 용액 튜브 클램프와 수확 백 어셈블리 클램프를 열고 용액을 용기로 옮깁니다.이송이 완료되면 액체 핸들링 튜브와 세포 해리 용액 튜브의 클램프를 잠급니다. 다음으로, 수평 위치 레버를 연 상태에서 CSM을 로드 위치로 이동시킵니다. 휠을 사용하여 용기 측면을 부드럽게 좌우로 흔들어 용액이 세포층에 골고루 퍼지게 합니다.용액이 균일하게 분포되도록 유지하기 위해 로킹 과정 중 가끔 용기를 충전 위치로 되돌릴 수 있습니다. 용액이 충분히 분포되면 CSM의 레버를 놓아 충전 위치로 고정합니다. 세포에 필요한 해리 시간 동안 용기를 이 위치에 둡니다.탁도를 기준으로 세포의 탈착 여부를 판단하십시오. 세포가 탈착되면 CSM을 로드 위치로 이동시킵니다. 퀀치 백 클램프와 액체 핸들링 튜빙 클램프를 열어 퀀치 배지가 용기로 유입되도록 합니다.액체 핸들링 튜브의 클램프를 잠급니다. 이송이 완료되면 CSM을 로드 위치로 되돌리고, 수평 위치 조절 레버를 잡아 용기 쪽을 좌우로 흔듭니다. 백 스탠드를 사용하여 수확 백 어셈블리의 위치를 용기 높이보다 낮게 내립니다.CSM을 비움 위치로 조정합니다. 용기 액체 처리 튜브 클램프를 열고 세포 용액을 퀜치 백으로 다시 옮깁니다. CSM을 로드 위치로 되돌리고 튜브 실러를 사용하여 용기에서 수확 백 어셈블리를 분리합니다.이제 세포 용액을 전통적인 세포 성장 시스템에서 처리할 준비가 되었습니다. Headspace 방식에서는 배지 내의 산소가 3일 동안 평균 50% 소모됩니다. 배양 중인 상태에서, 이 수치는 동일한 성장 시스템 내 세포 수준에서 시간 경과에 따른 리터당 밀리그램 단위의 산소 감소량을 나타내며, 3 mm의 배지 높이를 가로지르는 산소 구배는 세포층보다 배지와 Headspace의 접합부에서 거의 50% 더 높게 나타납니다.세포 성장 중 hypers 스택의 기관 공간 내 산소 백분율을 나타낸 결과입니다. 해당 그림은 96시간 동안 각 가스 투과성 필름 바닥에 산소를 공급하는 층 사이의 산소 백분율이 일정하게 유지됨을 보여줍니다. 이는 세포가 합류(confluency) 상태에 이를 때까지 성장하는 동안 산소에 원활하게 접근할 수 있음을 입증합니다.이 영상을 시청하신 후에는 폐쇄형 시스템에서 Corning Hypers stack vessel을 채우고 수확하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

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