November 29th, 2010
기술, 프로토콜 및 높은 수율 자기편 세포 배양에 사용되는 코닝 HYPERStack의 선박 및 액세서리의 취급에 소개. 프로토콜은 현재의 스택 플레이트 제품 이상 증가 세포 수확에 대한 폐쇄 시스템 선박을 사용하는 방법을 보여줍니다.
이 절차의 전반적인 목표는 코닝 Hypers 스택 용기의 올바른 폐쇄 시스템 사용을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 중력 공급 방법을 통해 용기에 매체를 접종하고 충전함으로써 수행됩니다. 다음으로, 세포 현탁액을 각 층에서 분리하고 세포를 배양합니다.
배양 후에는 사용한 배지가 제거됩니다. 절차의 마지막 단계는 hypers 스택 혈관에서 세포를 채취하는 것입니다. 궁극적으로, 기체 확산 결과는 hypers stack closed system이 사용될 때 세포가 성장하는 동안 산소에 접근하는 능력을 보여주기 위해 얻어집니다.
가스 투과성 물질이 있는 하이퍼 스택 용기의 주요 장점은 세포 성장을 위한 표면적을 증가시킨다는 것입니다. 용기의 헤드 공간을 제거함으로써 제 동료 p pardo는 이제 하이퍼 스택 용기를 사용하기 위한 폐쇄형 시스템 프로토콜을 시연할 것입니다. 하이퍼 스택 용기는 상판과 가스 투과성 필름으로 구성된 개별 세포 배양 구획인 stat로 구성됩니다.
세포는 이 구획 내에서 배양됩니다. 액체 매니폴드는 모듈 내에서 각 ette 층을 함께 연결합니다. 모듈은 튜브와 연결되어 12개의 층으로 구성된 배수로 용기를 형성합니다.
매니폴드를 통해 사용자는 전체 용기에 대해 하나의 유체 조작을 할 수 있습니다. 에어 매니폴드는 또한 스탯 레이어를 함께 연결하지만 유체 추가가 발생할 때 용기에서 공기를 대체하는 데 사용되며 각 사이를 채우는 동안 사용할 채우기 라인을 포함합니다. 스탯 층은 기관 공간이라고 하는 열린 공기 공간으로, 각 층의 가스 투과성 필름을 통해 가스 교환이 발생할 수 있습니다.
액체 취급 튜브는 액체 매니폴드에 연결되며, 멸균 상태를 유지하면서 과도한 공기를 방출하기 위해 모든 폐쇄 시스템 유체 조작을 수행하는 데 사용되는 맞춤형 구성 요소입니다. 벤트 튜브가 사용됩니다. 벤트 튜브는 공기 매니폴드에 연결되며 공기 필터를 포함합니다.
액체 취급 튜브에 연결된 체이스 튜브와 필터는 용기를 채운 후 액체 취급 튜브에서 유체를 배출하는 데 사용됩니다. 또한 이 프로토콜에는 코닝 스택 매니퓰레이터(CSM)가 사용되는데, 이는 사용 중 용기를 올바른 위치에 배치하는 데 도움이 되는 처리 장치입니다. 이 시연에서는 가스 투과성 36층 용기에 대한 폐쇄형 시스템 세포 배양이 시연됩니다.
그러나 CSM을 사용하는 경우 충전 쐐기를 사용하여 12층 용기에서 이 절차를 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 배지 튜브를 접종하기 전에 3.9리터의 자루에 담긴 배지를 준비하는 것으로 시작합니다. 세럼 백을 미디어 백에 적시고 완전히 혼합하여 원하는 혈청 농도를 얻습니다.
큰 백 클램프를 사용하여 백에 있는 약 300ml의 매체를 고정합니다. 이렇게 하면 주입된 모든 세포가 주입 중에 사용되고 배지 백에 남아 있지 않습니다. 미디어를 백 스탠드에 올려 놓고 미디어를 접종합니다.
튜브에 부착된 주사기에 세포 현탁액을 채웁니다. 세포 현탁액이 들어있는 주사기를 튜브 용접으로 미디어 백에 부착합니다. 주사기에서 가방까지 16인치가 넘는 튜브 3개.
세포 현탁액을 미디어 백에 주입하고 잘 혼합합니다. 접종된 배지 백은 튜브 용접 또는 다목적 커넥터를 사용하여 용기의 8인치 이상 액체 처리 튜브 3개에 부착할 수 있습니다. 오늘 우리는 튜브 용접을 사용할 것입니다.
액체 취급 및 용기의 튜브를 추적하기 위한 클램프를 닫습니다. 36층 용기를 적재 위치의 A CSM에 놓습니다. 벤트 필터 튜브를 고정 cl에 걸기amp CSM에.
뚜껑을 조이고 CSM을 주입 위치로 이동하여 주입 작업 중 젖음을 방지하기 위해 에어 필터를 가장 높은 위치에 놓습니다. 10도 각도는 또한 충전 라인에서 맑은 공기를 채우는 동안 액체를 층과 평형화할 수 있습니다. 미디어 백을 선박과 같은 높이에 배치하여 체이스 튜브 클램프를 닫은 상태로 유지합니다.
액체 취급 튜브 cl을 엽니다.amp 및 미디어 백 clamp 액체가 용기에 들어갈 수 있도록 합니다. 백 스탠드를 사용하여 배지 백을 들어 올려 세포 현탁액이 혈관으로 유입되도록 합니다. 접종된 모든 배지가 용기에 들어갈 때까지 용기를 채웁니다.
미디어 백의 상단 부분에는 여전히 300ml의 미디어가 들어 있어야 합니다. cl을 제거하십시오amp 액체가 상부 공기 매니폴드에 접근할 때 용기를 계속 채우려면 미디어 백에서 s를 계속 채웁니다. 과도하게 채워지지 않도록 미디어 백을 낮추어 채우기 속도를 늦춥니다.
액체 레벨을 채우기 라인으로 천천히 가져오고 액체 취급 튜브를 뭉칩니다. CSM의 용기를 격리 위치로 가져와 두 매니폴드 세트를 가장 높은 위치에 배치합니다. 미디어 백을 용기 높이 이하로 내립니다.
체이스 필터를 똑바로 세운 상태에서 체이스 튜브 cl을 엽니다.amp. 이렇게 하면 액체 취급 튜브의 매체가 비워지거나 매체 백으로 다시 들어갑니다. 튜브가 비워지면 cl을 닫습니다.amp 미디어 백 튜브에 있습니다.
체이스 튜브 필터를 똑바로 세웁니다. CL을 엽니다.amp 용기의 액체 취급 튜브에 남아 있는 액체가 용기에 들어가 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 이 작업이 수행될 때까지 1-2분 정도 기다립니다.
그런 다음 매니폴드가 왼쪽에 오도록 CSM에서 용기를 돌립니다. 선박을 CSM의 적재 위치로 내립니다. 체이스 튜브와 액체 취급 튜브 모두의 클램프를 닫습니다.
배지 백은 이제 용기에서 제거되거나 나중에 수확 절차에서 사용하기 위해 부착된 상태로 유지될 수 있습니다. 부착된 미디어 백을 보관하려면 미디어 백을 굴려 용기의 보관 트레이에 있는 고정 밴드 아래에 놓습니다. 마지막으로 용기를 인큐베이터로 옮깁니다.용기를 운반할 때 통풍구 필터에 액체가 들어가지 않도록 주의하십시오.
이것은 매니폴드 끝을 약간 위쪽으로 기울여 수행됩니다. 수확 절차 튜브를 시작하려면 세포 협회 용액을 용접하고 백을 함께 담금질하여 수확 백 어셈블리를 형성하려면 모든 튜빙 클램프가 닫혀 있는지 확인하십시오. 인큐베이터에서 용기를 제거하고 CSM의 적재 위치에 놓습니다.
고정 밴드 아래에서 미디어 백을 분리하여 백에 걸어둡니다. 다음으로 서서 뚜껑을 조여 용기를 고정합니다. 통풍구 튜브를 홀딩 cl에 걸기amp CSM을 채우기 위치로 이동합니다.
백 스탠드의 미디어 백이 용기보다 낮게 걸려 있는지 확인하십시오. 매체 백 튜브와 용기의 액체 취급 튜브의 클램프를 열어 매체가 부착된 백으로 흐를 수 있도록 합니다. 용기가 약 3/4 비워지면 CSM 설정을 최종 빈 위치로 변경합니다.
용기와 액체 취급 튜브가 비어 있으면 튜브를 들어 올려 사용한 미디어 백 튜브의 클램프를 지나 미디어를 추적합니다. 그런 다음 액체 취급 튜브의 클램프와 사용한 미디어 백 튜브의 클램프를 모두 닫습니다. 튜브 용접으로 사용한 미디어 백을 수확 백 어셈블리로 교체하십시오.
백 스탠드를 사용하여 cell dissociating bag assembly의 높이를 vessel의 높이 위로 올립니다. CSM을 채우기 위치에 놓습니다. 세포 해리 용액 튜브 클램프와 수확 백 어셈블리 클램프를 열고 용액을 용기로 옮깁니다.
전달이 완료되면 액체 취급 튜브와 세포 해리 용액 튜브의 클램프를 닫습니다. 그런 다음 수평 위치 조정 레버를 연 상태에서 CSM을 로드 위치로 가져옵니다. 바퀴를 사용하여 용기를 좌우로 부드럽게 흔들어 용액을 세포층에 분산시킵니다.
용기는 용액의 균등한 분포를 유지하기 위해 흔들리는 동안 때때로 충전 위치로 되돌릴 수 있습니다. 용액이 적절하게 분배되면 CSM의 레버를 놓아 채우기 위치를 잠급니다. 세포에 필요한 해리 시간 동안 혈관을 이 위치에 두십시오.
탁도를 지침으로 사용하여 세포 분리를 결정합니다. 분리되면 CSM을 로드 위치로 이동합니다. 담금질 백 cl을 엽니다.amp 및 액체 취급 튜브 clamp 담금질 매체가 용기에 들어갈 수 있도록 합니다.
CL을 닫습니다.amp 액체 취급 튜브에. 이송이 완료되면 CSM을 적재 위치로 되돌리고 수평 포지셔닝 레버를 잡고 선박을 좌우로 흔듭니다. 백 스탠드를 사용하여 수확 백 어셈블리의 위치를 용기 높이 아래로 내립니다.
CSM을 빈 위치로 조정합니다. 용기 액체 취급 튜브 클램프를 열고 셀 용액을 담금질 백으로 다시 옮깁니다. CSM을 적재 위치로 되돌리고 튜브 씰러를 사용하여 용기에서 수확 백 어셈블리를 분리합니다.
이제 세포 용액은 기존 세포 성장 시스템에서 처리할 준비가 되었습니다. Headspace를 사용하면 미디어의 산소가 3일 동안 평균 50%씩 고갈됩니다. 배양에서, 이 그림은 동일한 성장 시스템에서 시간이 지남에 따라 세포 수준에서 산소 리터당 밀리그램의 감소를 보여주며, 3mm 높이의 배지를 통한 산소 구배는 세포층에서보다 배지에서 헤드스페이스 접합부까지 거의 50% 더 큽니다.
세포 성장 중 하이퍼 스택의 기관 공간에 있는 산소의 비율이 표시됩니다. 이 그림은 96시간 동안 각 가스 투과성 필름 바닥에 공급하는 층 사이의 산소 비율이 일정하게 유지됨을 보여줍니다. 이것은 세포가 성장하는 동안 산소에 접근하여 유창성을 발휘할 수 있는 능력을 보여줍니다.
이 동영상을 시청한 후에는 폐쇄된 시스템에서 Corning Hypers 스택 용기를 채우고 수확하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 기사는 높은 수율의 부착성 세포 배양을 위해 설계된 Corning HYPERStack 용기 및 부속품을 소개합니다. 이 프로토콜은 이러한 용기의 폐쇄 시스템 사용을 통해 세포 수확 효율성을 향상시키는 방법을 보여줍니다.
Closed system adherent cell culture using gas permeable vessels addresses scalability challenges in biologics manufacturing by increasing yield per footprint while maintaining sterility. This approach supports process intensification for cell therapy and vaccine production where closed systems are critical for regulatory compliance. The technology enables higher cell densities without expanding facility footprint, improving capital efficiency in upstream bioprocessing.
The HYPERStack system integrates into adherent cell production workflows from expansion through harvest, supporting continuous processing in vaccine and therapeutic protein pipelines.