Name: Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 배우세요 암 줄기 세포 마이그레이션을 평가하는 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징 기법을 활용한 방법입니다. 이 기술은 뇌종양 줄기 세포의 이동 메커니즘을 실시간으로 관찰하여 전이 및 재발 치료 표적을 식별하는 데 활용됩니다.

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PAC는 부분적으로 위스콘신 줄기 세포 연수 프로그램 (PA 클락)의 대학에 NIH T32 교부금으로 지원됩니다. JSK는 부분적으로 HEADRUSH의 뇌 종양 연구 교수, 로저 Loff 기념 GBM 연구 기금과 UW 재단 / 신경 외과 뇌 종양 연구 및 교육 기금에 의해 지원되었다. JCW와 YH는 부분적으로 NIH 보조금 NIBIB 1R01EB009103-01에 의해 지원됩니다.

1. BTSC의 세포 분리 BTSCs는 neurospheres으로 혈청이없는 줄기 세포 매체에서 재배 기존의 문화에서 파생됩니다. 의 문화는 이전에 10, 11 설명되어 있습니다. <ol><li> BTSC - 파생 neurospheres에서 세포 현탁액을 준비합니다. BTSC - 파생 neurospheres로 15 ML 원뿔 튜브에 수집 된 5 분 900 rpm으로 centrifuged 있습니다. 빠른 원심 분리는 전단 및 / 또는 손상 neurospheres 수 있습니다. 표면에 뜨는이 흡입되어 neurosphere 문화는 사전 예열 Accutase의 0.5 ML에 resuspended 있습니다. 이 솔루션은 37 5-10분에 대한 incubated 수 있습니다 ° C neurospheres가 풀어야 할 수 있도록합니다. 셀은 기계적으로 10-20 부드러운 P100의 피펫의 스트로크 한 후 줄기 세포 매체의 1.5 ML은 Accutase을 중화하기 위해 셀에 추가됩니다으로 끝낼 수 있습니다. </li><li> BTSCs 그 다음 5 분 1,300 rpm으로 centrifuged, 그리고 줄기 세포 매체 1 ML에 resuspended 있습니다. </li><li> 50 μl 나누어지는이 suspens에서 제거됩니다이온은, 세포 계산을위한 microcentrifuge 튜브에 배치. trypan 파랑의 50 μl는 Eppendorf 튜브에 추가되고 정지는 셀 계산을위한 hemocytometer에 배치되어 있습니다. </li><li> 셀 계산 한 후 필요한 경우 추가 줄기 세포 매체는 20000 라이브 셀 / μl 미디어의 셀 밀도를 제공 할 수있는 BTSC 정지에 추가됩니다. </li></ol> 2. 이중 계층 스와-8 마스터와 PDMS 스탬프의 성형 제작 (그림 1 참조) 우리는 마이크로 유체 장치의 조립에 필수적인 스와-8 마스터와 PDMS 스탬프를 조작하는 광학 리소그래피와 부드러운 리소그래피를 사용합니다. 표준 절차 12보다 약간 다른, 우리의 스와-8 마스터는 두 층으로 구성되어 있습니다. 250 μm 높이 퍼 뜨리고 및 수신 챔버 두 번째 / 상위 레이어에있는 동안 3 μm 높이 microchannels은 이전 과정에서 아래 / 첫 번째 층에 주조되어 있습니다. 이 문화 구획 (microchannel 사이의 올바른 연결을 위해서는s와 챔버), 두 레이어가 정확하게 위치에 정렬해야합니다. 그러나, 두 번째 층의 두께와 불투명도는 아래 기능을 액세스 광학 / fiducial aligner를 차단 할 수있을만큼 큽니다. 여기 fiducial 마커가 원격 위치하고있는 마스크를 디자인합니다. 두 번째 레이어를 회전하는 동안 따라서, 첫 번째 레이어에서 이러한 마커는 선택적으로 차폐 될 수 있습니다. 그 결과, 기능을 모두 레이어가 하나의 마스터에서 만든되고 PDMS 스탬프의 얕은 돋을 새김으로 성형 준비. <ol><li> 디자인 두 사진 마스크​​를 준비합니다. 한 마스크는 두 fiducial 마커와 첫 번째 층에 microchannels의 배열 (400 μm 길이 10-50 μm 폭)으로 구성되어 있습니다. 또 다른 마스크는 두 번째 레이어 챔버 (2mm 길이 600 μm 폭)을 퍼 뜨리고 및 수신 구성되어 있습니다. 두 마스크가 일러스트 레이터 (어도비, 캘리포니아)에 설계되어, 이소프로판올, 공기 건조로 청소 투명 필름 (얇은 금속 부품, 콜로라도)에 레이저 인쇄. </li><li> 첫 번째 층과 만들기스와-8 포토 레지스트 (MicroChem, 매사추세츠) 공급 업체의 제품 설명서에 따라. 첫째, 스핀 코트 스와-8 (5)의 3 μm 두께의 포토 레지스트와 핸들 웨이퍼 (WRS 자료, 캘리포니아) 소프트 베이킹이 나타납니다. 포토 레지스트는 자외선 노출 후 베이킹 개발에 이어 가까운 접촉에서 해당 마스크와 치료 후입니다. </li><li> 스와-8 (2100) 두께 250 μm와 스핀 코트 두 번째 층. 첫 번째 층에서 fiducial 마커를 차단에서 두꺼운 포토 레지스트를 방지하기 위해, 우리는 두 번째 층의 스핀 코팅하기 전에에 스카치 테이프로 이러한 영역을 다룹니다. 테이프 그런 다음 정렬 목적으로 마커를 나타 내기 위해 벗겨되어 있습니다. </li><li> UV-노출 두 번째 마스크가 두 번째 레이어를. 정렬 마커가 발견으로, 그것은 광학 마스크 aligner를 사용하여 두 번째 마스크에있는 사람들에게 정렬 간단합니다. 포토 레지스트의 두 번째 층은 자외선 노출과 가까이 접촉에서 치료, 사후 제빵 및 개발에 이어 다음입니다. &lt;/ 리&gt; </li><li> 안티 - 스틱 코팅 된 마스터합니다. 치료 PDMS의 제거에 도움이되는 스와-8 마스터는 표면에게 nonstick 형 코팅을 할 수 증착을 통해 silanized 할 수 있습니다. 간단하게 trichloro 여러 드롭스 (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 진공 실란 솔루션으로, 적어도 하나의 시간 동안 건조기에 넣으십시오. </li><li> 마스터와 PDMS을 본 뜨는거야. 성 예비 중합체베이스 철저히 10시 1분 비율로 PDMS Sylgard 184 (다우 코닝, 미시간)의 치료자를 섞는다. 공기 방울은 본 적이 될 때까지 진공 degassing을위한 건조기에 넣으십시오. 새로운 기포가 도입되는 경우 다시 마스크와 가스를 제거하다에 혼합물을 부어. 는 실내 온도에 냉각 한 후 90 C.에서 2 시간 동안 레벨 열판에 금형을 치료, 부드럽게 PDMS 스탬프를 놓습니다. 따라서, 배양 채널 PDMS에 새겨진 및 장치의 조립 준비되어 있습니다. 이 금이 간 또는 착용 될 때까지 마스터 성형 재사용합니다. 안티 - 스틱 코팅 끈적 거림이 회복되면 다시 수행해야합니다. </li></ol> 3.마이크로 유체 장치 및 세포 배양의 조립 (그림 2) 문화 셀 위해, 기능 조각 PDMS 스탬프는 동봉 된 채널을 형성하기 위해 유리 coverslip에 부착되어 있습니다. 유입구 및 유출구는 문화 / 미디어를로드하기 위해 생성됩니다. 한편, 청소 및 유리 기판과 PDMS 스탬프를 다른 절차는 셀 호환성을 보장하기 위해 필요합니다. <ol><li> 생검 구멍 구멍을 뚫는를 사용하여 PDMS 스탬프를 통해 저수지하십시오. 우리는 직경이 6mm로 선택합니다. 이 저수지는 두 목적을 위해 제공하고 있습니다. 하나는 세포 성장을위한 추가 영양을 보유하는 것입니다. 다른 하나는 피펫 로딩 및 진공 흡인의 액세스입니다. </li><li> 30 분에 에탄올의 70 %에 PDMS 스탬프를 만끽 한 다음 다른 10 분에 드 이온화 물을 씻어. 목적은 제조 과정에서 도입하고, PDMS 오염을 uncrosslinked 잠재적 인 유기 잔차을 취소하는 것입니다. 이러한 유기 추출 13으로 더 강렬하고 철저한 청소 프로세스 (14) 다른 곳에서 사용되었다. 그러나, 우리는 BTSC 문화가 필요 발견했다. </li><li> 압력솥 (121 ° C, 35 분)를 사용하여 PDMS 스탬프를 검사. 이 단계는 더 PDMS의 crosslink 반응을 완성합니다. 이 단계에서 시작하여 단계 3.6까지 모든 절차는 무균 방식으로 촬영하고 있습니다. </li><li> PDMS 스탬프 그런 다음 이전에 폴리-L-라이신으로 코팅 된 유리 coverslip에 놓여 있습니다. 15-17 장치는 다음 37 번 박 laminin 솔루션과 채널 ° C.를 작성하여 laminin으로 코팅되어 있습니다 Laminin은 장치에서 흡입되고 장치가 줄기 세포 매체로 세척합니다. </li><li> 저수지 및 채널에 1 단계에서 세포 현탁액을로드합니다. dissociated 세포 11 μl 한 심는 저장소에 배치됩니다. 진공 흡인이 필요한 경우, 시딩 챔버에 세포를 강제하는 데 사용됩니다. 셀의 추가 7 μl은 인접한 심는 저장소를 배치하고 있습니다. 참고 : 평균 셀 밀도는 20,000 세포 / μl 미디어입니다. 고물에어 5 분 심는 및 수신 저수지는 미디어와 물이 차고 있습니다. </li><li> 상단에 0.5-1 mm 사전 autoclaved PDMS 시트를 놓습니다. 이 PDMS 조각 사이의 자연 - 발생 표면 부착은 세포 배양은 밀폐 및 운송, 부화 및 미세 이미지 준비 할 것입니다. </li></ol> 4. BioStation IM (니콘 인스트루먼트 Inc의, 멜빌, USA)와 BTSC 이주의 장기 시간 경과 영상. 카메라를 결합, 소프트웨어 및 보육 모든 한 상자 안에서,이 미세 시스템은 일없이 방해와 이미지 세포 배양에이 가능합니다. 또한, 독특한 모터 설계 목적 렌즈를 이동하고 포인트 방문 기능에 고정 샘플 단계를 유지합니다. 이 높은 처리량 분석에 이미지 병렬 실험을 추적 세포 운동하는 것이 실용적 수 있습니다. <ol><li> 사전 평형 온도, 수분, 공기 공급을 안정화시키기 위해 45 분 동안 Biostation의 IM합니다. 여러 물 cont의 추가샘플 챔버에서 ained 요리는 적절한 습도를 유지하는 데 사용됩니다. </li><li> 현미경의 샘플 챔버에 휴대가 가능한 장치를로드하고, 센터는 마이크로 핀셋을 사용합니다. </li><li> Biostation 소프트웨어의 초점, 위치 - 포인트 및 시간 포인트를 설정하고 시간 경과를 시작합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : compartmentalizing 마이크로 유체 장치를 사용하여 암 세포 이주의 육안 검사 및 특성의 예는 그림 3과 그림 4에 설명되어 있습니다. 세포 라인은 BTSC입니다. 현재 설치로는, 세포 배양의 위상 이미지는 지속적으로 오일 (그림 3)과 같은 긴 매 2 초 (그림 4)처럼 자주로에 대해 기록 할 수 있습니다. 오일 외에도, 문화 미디어가 삭제 영양 보충 및 폐기물에 대한 교체해야합니다. 우리의 장기 시간 경과는 형태학의 변화에​​ 근거하여 마이그레이션하는 동안 여섯 세포 단계의 회전 순서를 식별합니다. illus으로그림 3 trated, 우리는 (i) 사전 마이그레이션하고, (ii) 개시은 (III) 경로 - 탐험, (IV)가, (V) 대상 - exloration와 (VI) 후 이주를 주행로에 대해 설명합니다. 수신 챔버에서 스핀들 모양의 세포는 성장 나누어 점진적으로 마이그레이션 할 수 있습니다 대량 종양에서와 같이 무대은 (i)에있어. 그들은 microchannel 입구에 접근함에 따라, 몇 전지는 무대를 진행 (II)는 접착제 돌출부를 확장하고 생성 할 때. 그 중 하나가 입구를 점유하고 마이그레이션 방향을 탐색 할 수 무대 (3)으로 이동 할 수 있습니다. 셀 마이그레이션 방향을 결정하면, 그것은 전체 microchannel을 통해 수행됩니다 지속적으로 높은 속도에서 microchannel을 통해 크루즈에 (IV) 단계로 진행. 단계 (VI) 그 다음에 챔버를받은 열린 공간을 탐험하고,하는 단계 (V)에 microchannel, 셀 수익의 끝에서. microchannel에서 마이그레이션 전력은 대부분,도 4에 도시 된 바와 같이 활동을 blebbing하여 amoeboid cel과 비슷 생성리터. 셀 blebbing와 막 변형이 완전히 여기에 기록됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 마이크로 유체 장치의 제조의 설계도. 전체 과정은 소프트 리소그래피의 수정 기술을 통해 3 인치 실리콘 핸들 웨이퍼에 수행됩니다. 3 μm 높이 microchannels 및 정렬 마커는 첫 번째 레이어로 구성되어 있습니다. 정렬 마커는 스카치 테이프로 가득하는 동안 다음 250 μm 두께 스와-8은 나중에 두꺼운 포토 레지스트에 의해 시력을 차단하지 않고 aligner를 마스크에 액세스 할 수 있습니다 것과 같은, 스핀 - 코팅입니다. 따라서, 챔버 기능은 두 번째 레이어로 만들 수하고 정확하게 첫 번째 레이어에 정렬. PDMS 스탬프는 결국 결과 마스터를 성형하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 장치 어셈블리 및 세포 심는 과정의 설계도. PDMS와 GL에 의해 둘러싸여엉덩이 coverslip은 3D 배양 공간이 챔버, 저수지 및 microchannels로 구성되어 있습니다. 수신 챔버가 처음 셀 - 무료 미디어로 가득되는 동안 시딩 챔버는 세포 배양으로 가득합니다. 그들 사이에 연결 microchannels는 측면을받는에 심는 측에서 셀 마이그레이션 길을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> microchannel을 통해 그림 3. BTSC 마이그레이션. 어퍼 : 시간 ​​경과의 스냅 샷은 하나의 셀 (녹색으로 강조 표시) 시딩 측에서 수신 측에 400 μm를 통해 마이그레이션을 보여줍니다. 전체 여행은 세포 형태학의 변경 순서를 포함, 약 2 일이 소요됩니다. 규모 바는 40 μm이다. 밑으로 여섯 가지 마이그레이션 단계의 만화 표현합니다. 사전 마이그레이션는 (i) : 시딩 챔버에서 스핀들 - 모양 dividable 세포는 점차 서로 함께 마이그레이션. 전지 본체 및 전자 편광으로 서로 microchannel 입학 경주 근처에있는 세포 lamellipodia의 돌출부를 xerting. 가입 (II) : 경쟁이 후퇴하는 동안 최고 용량과 철새 셀 채널 입구에 자리 잡고 있습니다. 경로 - 탐구 (III) : 약간의 극성과 amoeboid 모드로 철새 셀 변경됩니다. 이 마이그레이션 모드는 매우 운동성 작은 ​​막 돌출부를 blebbing하여 모든 방향으로 경로를 탐색 할 수 있습니다. 크루즈 (IV) : 마이그레이션 경로가 결정되면, 세포 앞으로 제목 추가 큰 돌출부를 유지하여 적응 amoeboid 모드로 변환합니다. 이 방법은 셀은 높은 운동성뿐만 아니라 지속적으로 방향과 속도를지지. 대상 - 탐색 (V) : 경로 엔드시, 셀은 속도가 느려 및 공격 대상에 대한 수신 챔버를 둘러 filopodias을 개발하고 있습니다. 후 마이그레이션 (VI) : 수신 챔버를 입력 한 후 셀은 별 모양으로 변하기 높은 운동성 있지만 결정 방향을 유지합니다. "/&gt; . (AB) : 시간 경과의 그림 4 스냅 샷은 BTSC의 활동과 막 변형을 blebbing의 사이클을 보여줍니다. 개시 (BD). 확장 (DF). 철회. 화살표와 곡선 - 라인 방향과 막 변형의 위치, 각각을 나타냅니다. 스냅 샷은 모든 팔초를 수집하고 있습니다.

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</ol>

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여기에 제시된 마이크로 유체 장치와 이미지 레코딩 기술은 마이그레이션하는 동안 세포 형태의 시각적 특성 수 있습니다. 기존의 기존의 방법에 비해, 마이크로 유체 플랫폼은 비용 효율성, 높은 처리량 및 설계 유연성의 장점을 제공합니다. 제시 미세 시각화 시스템은 장기 라이브 세포 이주의 연구와 기록을 할 수 있습니다. 렌즈 모터 기능은 샘플을 방해하지 않으면 서 이미지 해상도가 높은 여러 마이그레이션 경로를 추적 할 수있게. 장치의 조립 동안 PDMS 스탬프은 비 영구적으로 PDL 코팅의 편의 (단계 3.4)의 유리 coverslip에 접착합니다. 그것은이 프로토콜의 성공을 위해 좋은 인감를 달성하는 것이 중요합니다. 예를 기판에 도장이나 먼지 / 파편에 기포와 같은 장치 제조,에서 도입 오염 누출 유체의 결합과 결과를 위태롭게 할 수 있습니다. 따라서, treatiNG는 먼지없는 방식으로 장치는 장치 실패를 방지하는 것이 중요합니다. 이전 PDL 코팅에, 유리 coverslips는 질산이 취급하고 PDL 솔루션은 먼지 / 파편을 제거하기 위해 centrifuged 있습니다. 클린 룸에 액세스 할 수없는 경우 우리는, 알코올 린스, 스카치 테이프를 찾고, PDMS 스탬프의 먼지 / 이물질 제거에 물통 매우 도움이. PDMS 스탬프가 유리 coverslip과 접촉 한 후 핀셋으로 부드럽게 우표를 활용하면 인감을 용이하게한다. BTSCs은 10 정상적인 신경 줄기 세포의 문화와 비슷한 줄기 세포 매체의 영역 문화를 통해 인간의 운영 객실 표본에서 풍부하게 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 풍부한 BTSCs는 줄기 세포 마커의 표현 (CD133, nestin), 여러 신경 lineages (glial 및 neuronal)에 차별화, 100처럼 몇과 orthotopic immunodeficient 마우스 모델에서 종양 개시 등의 줄기 세포와 같은 속성을 보여줍니다 세포 18. 일부 논쟁이 purifi에 대해 존재하지만양이온과 BTSCs 1 19-21의 정비, 영역 자체 BTSCs 더 부모 종양 22-24의 표현형 및 유전자형을 유지합니다. compartmentalized 공간은 셀 마이그레이션에 대한 생리적 환경을 모방 한 것이 었지요. 우리 장비에서 BTSC 세포 형태를 조절하여 크기 제약이 공간을 통해 이전의 강한 능력을 나타냅니다. 세포 형태학의 변화 우리의 특성은 인접한 뇌의 BTSC 침략의 가능한 새로운 자세한 설명을 모델링 할 수 있습니다 여섯 단계 순서 모드 - 변환을 나타냅니다. 초기 단계에서 전지 극성의 상당한 금액을 얻을 수 있으며 효율적으로 microchannel 내부에 자신을 고정 접착제 돌출부를 생성합니다. microchannel에서 셀 수용 인원이 이루어지면, 그것은 주행 모드로 변환하고 microchannel을 통해 전체 여행을 위해이 모드를 유지합니다. 이 단계에서, BTSC 높은 운동성하고 일관된 방향을 유지하지만, 에너지를 절약. 에terestingly, 그것은 microchannel 하나 그러한 한 번에 하나의 크루즈 세포로 제한되어 나타나면이 단계에 단세포 진행, microchannel에서 다른 세포의 휴양지. 이 메커니즘은 가능성이 확산 종양의 효율성을 보장하고 microchannel에 영양 overconsumption을 방지합니다. microchannel에서 마이그레이션을 완료 한 후, 셀 multidirectional 돌출부와 공격 대상 또는 새 마이그레이션 경로에 대한 자세한 탐사의 성향에 회복합니다. compartmentalizing 마이크로 유체 장치는 체외에서 소설은 뇌 실질의 BTSC 침투를 공부에 microenvironment을 만드는 것을 의미합니다. 이 방법은 쉽게 암 줄기 세포 (CSC) 및 기타 종양 유형에서 파생 된 철새 세포 라인의 연구에 적용 할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치에서 배양 세포는 보육 및 조직 문화 전문 지식을 갖추고 있습니다 모든 현대 생물학 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 스와-8 마스터, PDMS가 장착주조 및 장치 조립은 부드러운 리소그래피의 일부 기본 훈련 가능합니다. 또한이 플랫폼은 또한 그라데이션 믹서, 표면 패터닝, 유체 제어 및 microelectrode과 같은 다른 기능 모듈을 통합으로 다른 응용 프로그램 연장 될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM), 높은 혈당 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11,965 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 햄의 F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31,765 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> B27 보충 마이너스 비타민 A </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15,240 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 (EGF), 인간 재조합 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ TD&gt; <td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 인간 재조합 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 돼지의 장 점막에서 헤파린 나트륨 소금, </td><td> 시그마 </td><td> H1027-250KU </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> Laminin (천연 마우스) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 셀 매체를 줄기 </td><td></td><td></td><td><ul><li> 30% 햄 F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> 1퍼센트 항생제 - antimycotic </li><li> 비타민 A가없는 2퍼센트 B27 </li><li> EGF (20 NG / ML)와 bFGF / 헤파린 (20 NG/ ML bFGF, 5 MG / ML 헤파린) 믹스 재료 및 사용 전에 무균 필터 </li></ul></td></tr><tr><td> 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) / 헤파린 </td><td></td><td></td><td><ul><li> 나누어지는 농도 20 μg / ML </li><li> 25 μg의 경우 : 25 μg의 bFGF에 5mg/mL 헤파린의 1.25 ML을 추가합니다. </li><li> 250 μg의 경우 : 250 μg의 bFGF에 1 ML 5mg/mL의 헤파린을 추가합니다. 원뿔형 15 ML에 갈아 원추형으로 11.5 ML 5 MG / ML 헤파린을 추가합니다. </li><li> -80에서 50 μl 또는 250 μl aliquots ° C.로 저장 </li></ul></td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> 나누어지는 농도 20 μg / ML </li><li> 200 μg의 경우 : 200 μg의 EGF에 1 ML 멸균 DMEM (Gibco 11965-118)을 추가합니다. 15 ML 원뿔으로 갈아과 9 ML DMEM을 추가합니다. </li><li> 500 μg의 경우 : 200 μg의 EGF에 1 ML 멸균 DMEM (Gibco 11965-118)을 추가합니다. 50 ML 원뿔으로 갈아과 24 ML DMEM을 추가합니다. <li> 50 &amp; 무로 저장, L 또는 -80 250 μl aliquots ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td></td><td></td><td><ul><li> 나누어지는 농도 5 MG / ML </li><li> 100 MG의 헤파린을 무게. </li><li> 20 ML (70 %) DMEM-(30 %) F12-(1 %) PS​​A (14 ML DMEM, 6 ML F12, 200 μL PSA)에 100 MG의 헤파린을 추가 </li><li> 살균 필터 </li><li> -80 ° C에서 50 μl 또는 250 μl aliquots로 저장 </li></ul></td></tr><tr><td> 스와-8 포토 레지스트 </td><td> MicroChem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 핸들 웨이퍼 </td><td> WRS 자료 </td><td> 3P01-5SSP - 인보이스 </td><td></td></tr><tr><td> trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> 다우 코닝 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> laminin </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> 50 μg /최종 농도에 대한 PBS 버퍼에 ML </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> 니콘 악기 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

지난 40 년 동안 미국은 사망률 만 5 % 감소의 결과로, 암 연구에 억 200여 달러를 투자했습니다. 환자 결과를 개선하기위한 주요 장애물은 공격적인 암 세포 침입, 전이 및 치료 저항 1과 관련된 세포의 이주를 근간 메커니즘의 가난한 이해입니다. Glioblastoma Multiforme (GBM), 가장 널리 주요 악성 성인 뇌 종양이이 어려움을 예시. 표준 수술, 방사선 및 chemotherapies에도 불구하고, 환자의 평균 생존은 인접한 뇌 및 신속한 암 재발이에 적극적인 GBM의 침투로 인해 만 십오개월입니다. 비정상 세포 철새 메커니즘과 종양 microenvironment의 상호 작용 가능성이 세 정상 세포에서 암을 차별화. 따라서, GBM에 대한 치료 방법을 개선하는 것은 암 세포 이주 메커니즘에 대한 이해를 필요로합니다. 최근 작품 THA 제안GBM 내에서 세포의 타 작은 subpopulation, 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC)는 치료 저항 및 재발에 대한 책임 수 있습니다. BTSC 철새 용량의 근간이 메커니즘은 특징 1,4로 시작합니다. 육안 검사 및 기하학적 조작, 기존의 마이그레이션 assays 5 제한으로 인해 전체 세포 인구를 정량화으로 제한됩니다. 반면, 마이크로 유체 장치 때문에 현대적인 현미경과 미세 환경에 6-9 제어와의 호환성의 단일 세포 분석을 허용합니다. 우리는 compartmentalizing 마이크로 유체 장치를 사용하여 BTSC 마이그레이션에 대한 자세한 특성화를위한 방법을 제시한다. 이 PDMS 만든 장치는 세 연결된 구획에 조직 배양 환경을 캐스팅 : 챔버을 퍼 뜨리고 챔버을 받고 microchannels를 연결. 우리 둘 다 방 4-5 다에 대해 가능한 BTSC을 지원하기 위해 충분한 미디어를 개최하는 등의 장치를 맞는미디어 교환없이 YS. 처음 심는 챔버 내로 유입이 높은 모바일 BTSCs는 병렬 수신 챔버에 microchannels를 연결하지만 마이그레이션 후 절연되어 있습니다. 이 마이그레이션은 뇌의 중간 공간을 통해 암 세포의 확산을 시뮬레이션한다. 마이그레이션하는 동안 세포 형태학의 위상 라이브 이미지는 며칠 동안 기록됩니다. 높은 철새 BTSC 따라서, recultured 격리되고, 더 분석 할 수 있습니다. Compartmentalizing microfluidics는 BTSCs 및 기타 암 줄기 세포의 이동 동작을 연구 할 수있는 다양한 플랫폼이 될 수 있습니다. 기울기 발전기, 유체 취급, 마이크로 전극 및 기타 비유동 모듈을 결합하여 이러한 장치는 약물 검사 및 질병 진단 6 사용하실 수 있습니다. 철새 세포의 공격적인 subpopulation의 절연은 분자 메커니즘의 기초 연구를 수있게 될 것입니다.

암 줄기 세포 이주를 조사하기위한 compartmentalizing 마이크로 유체 장치가 설명되어 있습니다. 이 소설 플랫폼은 가능한 세포 microenvironment를 생성 및 라이브 세포 운동의 미세 시각화 할 수 있습니다. 높은 운동성 암 세포는 잠재적으로보다 효과적인 미래의 치료로 이어지는 공격적인 침투 분자 메커니즘을 공부 절연되어 있습니다.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

지난 40년 동안 미국은 암 연구에 2,000억 달러 이상을 투자했으나, 사망률은 단 5% 감소하는 결과에 그쳤습니다. 주요...

본 절차의 전반적인 목표는 구획화된 미세유체 장치를 통해 암세포의 이동을 시각적으로 관찰하고 특성화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 무혈청 배지에서 배양된 뇌종양 줄기세포의 기존 뉴로스피어(neurosphere)를 분리합니다. 두 번째 단계로 이층 구조의 SU-8 마스터를 제작하고, 소프트 리소그래피를 이용해 구획화 설계가 적용된 PDMS 스탬프를 제작합니다.다음으로, 미세유체 장치를 조립하고 뇌종양 줄기세포를 주입합니다. 마지막으로, 올인원 현미경 시스템을 사용하여 뇌종양 줄기세포 이동의 장기 타임랩스 이미징을 수행합니다. 최종적으로, 결과는 뇌종양 줄기세포가 초미세 제한 공간을 통해 이동하는 동안 형태학적 단계의 회전 서열을 나타냄을 보여줍니다.Transwell Boyton Chamber와 같은 기존 방식에 비해 이 기술의 주요 장점은, 마이크로 장치를 통해 세포의 이동 과정을 시각적으로 검사하고 세포를 제어하여 배치하며 인자를 정밀하게 전달할 수 있다는 점입니다. 따라서 마이크로 유체 기술은 신뢰할 수 있고 효율적이며 비용 효과적인 단일 세포 선택 및 탐색 기능을 갖추고 있습니다. 높은 이동성을 가진 세포에 대한 단일 세포 분석을 통해 향후 잠재적인 화학요법 표적을 식별할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 암 전이 및 재발 치료로까지 확장됩니다.이 방법은 암 시스템의 이동 행동에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 배아 발달, 면역 반응, 상처 치유 및 장기 재생과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. BTSC 유래 신경구(neurospheres)의 세포 현탁액으로 시작합니다. 세포를 15 mL 원심분리관(conical tube)에 모으고 900 RPM에서 5분 동안 원심분리하되, 이보다 빠르게 회전시키지 마십시오.상청액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 37°C에서 5~10분 동안 0.5 mL의 예열된 Accutane으로 배양하여 뉴로스피어(neurospheres)를 느슨하게 분리합니다. 배양 후, P100 피펫으로 10~20회 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 기계적으로 분쇄합니다.그 다음, Accutane 원심분리기를 중화시키기 위해 줄기세포 배지 1.5 milliliters를 추가하고, 세포 현탁액을 1300 RPM에서 5분 동안 원심분리한 후 세포를 줄기세포 배지 1 milliliter에 다시 현탁합니다. 혈구계수기로 세포 밀도를 확인하고 밀도를 microliter당 20,000 cells로 조정합니다. SU-8 마스터 제작을 시작하기 위해, Adobe Illustrator와 Image Setter가 통합된 레이저 프린팅 투명 필름을 사용하여 두 개의 포토마스크를 준비합니다.첫 번째 층 포토마스크는 두 개의 기준 마커와 마이크로 채널 배열로 구성되며, 두 번째 층 포토마스크에는 안착 및 수집 챔버가 있습니다. 두 마스크 층을 이소프로판올로 세척한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 이제 핸들 웨이퍼에 3 µm 두께의 SU-8 포토레지스트를 스핀 코팅하고 소프트 베이킹을 수행합니다.그 다음, 첫 번째 레이어 포토 마스크를 밀착시킨 상태에서 uv 노광을 통해 포토레지스트를 노출시키고 경화시킵니다. 이후 웨이퍼를 포스트 베이크하고 현상합니다. 핸들 웨이퍼의 피듀셜 마커 영역을 스카치테이프로 덮습니다.그런 다음 웨이퍼에 250 micron 두께의 포토레지스트를 스핀 코팅합니다. 그 후, 정렬 목적의 마커가 드러나도록 테이프를 제거합니다. 두 번째 포토레지스트 층을 도포하고 피듀셜 마커를 정렬합니다.그 다음, 두 번째 층 포토마스크를 UV 노광 및 경화시킨 후 포스트 베이킹과 현상을 진행합니다. 이제 표면의 끈적임을 줄이기 위해 증착법을 통해 SU-8 마스터를 처리합니다. 웨이퍼를 진공 상태의 데시케이터에 넣고 Tri Chloro cline 용액을 몇 방울 떨어뜨려 최소 1시간 동안 둡니다.이제 마스터를 사용하여 PDMS를 성형할 준비가 되었습니다. 먼저 프리폴리머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 충분히 혼합하십시오. 그 다음, 기포가 더 이상 보이지 않을 때까지 혼합물을 데시케이터에 넣고 진공 탈포합니다.혼합물을 마스크 위에 붓고 다시 탈포합니다. 새로운 기포가 발생한 경우, 수평이 맞는 핫플레이트에서 90 °C로 2시간 동안 몰드를 경화시킵니다. 실온으로 식힌 후, PDMS 스탬프를 조심스럽게 떼어냅니다.이로써 PDMS에 배양 채널이 각인되었으며, 미세유체 장치를 조립할 준비가 되었습니다. 마스터는 균열이 생기거나 마모될 때까지 몰딩에 재사용할 수 있습니다. 마스터 표면이 끈적거리는 경우, 비점착 코팅을 다시 도포할 수 있습니다.PDMS 스탬프를 사용하여 미세유체 장치에 입구와 출구를 만드는 것으로 시작합니다. 생검 천자침(biopsy hole puncture)을 사용하여 PDMS 스탬프를 70% ethanol에 30분 동안 담가 세척한 후, 탈이온수로 10분 동안 헹굽니다. 오토클레이브(autoclaving)를 통해 PDMS 스탬프를 멸균하고 가교 반응을 완료합니다.이제 poly L lysine이 코팅된 유리 커버슬립 위에 PDMS 스탬프를 놓습니다. 그 다음 리저버 입구를 통해 챔버에 라미네이트 용액을 채워 장치를 라미네이트로 코팅하고, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 장치에서 라미네이트를 흡입하여 제거합니다.그런 다음 줄기세포 배지를 두 번 가득 채워 장치를 세척합니다. 이제 분리된 세포 11 µL를 시딩 리저버 중 하나에 로딩합니다. 필요한 경우, 진공 흡입을 사용하여 세포를 챔버 안으로 강제로 밀어 넣습니다. 그런 다음 인접한 시딩 리저버에 세포 7 µL를 추가로 로딩합니다.5분 후, 시팅 및 수용 리저버(reservoir)에 배지가 가득 채워집니다. 이제 0.5에서 1mm 두께의 멸균된 PDMS 시트를 장치 위에 올립니다. PDMS 자체의 자연적인 표면 접착력으로 장치가 밀봉되며, 밀봉이 완료되면 운송, 배양 및 현미경 이미지 촬영을 위한 준비가 끝납니다.biot, IM을 45분 동안 가동하여 미리 평형 상태로 만듭니다. 온도, 습도 및 공기 공급을 안정시키기 위해 샘플 챔버에 물 접시를 여러 개 넣어 적절한 습도를 유지합니다. 준비된 장치를 현미경의 샘플 챔버에 장착합니다.마이크로 핀셋을 사용하여 장치를 중앙에 맞춥니다. 이제 Biot 소프트웨어를 사용하여 초점 위치 지점과 시간 지점을 설정하고, 필요한 경우 타임랩스 기록을 시작합니다. 배양 5일 후에 배양액을 교체합니다.장치에 파종된 BTC는 위상차 이미지로 지속적으로 기록되었습니다. 안착 챔버 내에서의 5일 동안, 방추형 세포들은 전-이동 단계에 머물러 있었습니다. 세포들이 마이크로채널 입구에 접근함에 따라, 일부 세포들이 확장되며 접착성 돌기를 생성하였습니다.단 하나의 세포만이 입구에 위치하여 이동 방향을 탐색할 수 있었습니다. 세포가 이동 방향을 결정하자, 일정한 고속으로 마이크로채널 전체를 통과하여 이동했습니다. 마이크로채널의 끝에서 세포는 수신 챔버(receiving chamber)의 개방된 공간을 탐색한 후 최종적으로 챔버 내부로 진입했습니다.두 번의 2차 이미징 간격으로 세포를 관찰한 결과, 이동력은 주로 OID 세포와 유사한 블래빙(blabbing) 활동에 의해 생성되는 것으로 나타났습니다. 실험 절차를 수행할 때, 장치의 설계가 매우 유연하여 원하는 수준의 세포 이동을 달성하기 위해 마이크로채널의 치수를 조절할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 관심 있는 세포를 배양하는 데 적합한 독특한 구획화 마이크로유체 장치를 제작하는 방법과, 본 절차에 따라 이러한 세포의 이동 특성을 정성적 및 정량적으로 정의하기 위한 장기 타임랩스 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.고이동성 암세포가 유전적으로 얼마나 다른지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)이나 DNA 마이크로어레이(DNA microarray)와 같은 다른 방법들을 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 이상의 표현은 소설 아가로 오스 겔 기반 microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포 (NSCs)의 운동성 향상 것을 보여줍니다. 이 기술은 인간의 신경 줄기 세포와 같은 세포 소스가 없어서 다른 포유 동물 세포 시스템에 쉽게 적응할 수 있으며, 시간을 주변의 차례가 중요합니다.

아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

이 비디오에서는 화학주성 이동 플레이트를 사용하여 살아있는 뇌종양 줄기세포의 이동에 대한 관심 약물의 효과를 분석하기 위해 뇌종양 줄기세포 이동 분석을 수행합니다. Live-cell imaging은 분석 중 세포 이동의 시각화 및 정량화를 용이하게 합니다.

약물 치료 연구를 위한 뇌종양 줄기세포(BTSC) 이동 분석: BTSC의 이동에 대한 약물 치료의 효과를 분석하기 위한 체외 생세포 이미징 기법

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

여기, 양적 측정 마이그레이션 및 시간이 지남에 조건 하에서 여러 치료 세포종 뇌 종양 줄기 세포의 내 습을 라이브 세포 이미징 기술을 설명 합니다.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

여기에서는 혈액 뇌 장벽 전이성 종양 미세 환경을 준비하고 배양한 다음 공초점 이미징 및 인공 지능 (기계 학습)을 사용하여 상태를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다.

장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

배우세요 암 줄기 세포 마이그레이션을 평가하는 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징 기법을 활용한 방법입니다. 이 기술은 뇌종양 줄기 세포의 이동 메커니즘을 실시간으로 관찰하여 전이 및 재발 치료 표적을 식별하는 데 활용됩니다.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

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