Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

이 절차의 전반적인 목표는 구획화 미세유체 장치를 통해 암세포 이동을 육안으로 검사하고 특성화하는 것입니다. 이것은 먼저 혈청이 없는 배지에서 성장한 뇌종양 줄기세포의 기존 신경구를 해리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 구획화 설계가 있는 소프트 리소그래피 금형 A-P-D-M-S 스탬프를 사용하여 이중층 SU 8 마스터를 제작

다음으로, 미세유체 장치를 조립하고 뇌종양 줄기세포를 로드합니다. 마지막으로, 뇌종양 줄기세포 이동에 대한 장기 타임 랩스 이미징은 올인원 현미경 시스템을 사용하여 수행됩니다. 궁극적으로, 결과는 뇌종양 줄기세포가 초밀폐 공간을 통해 이동하는 동안 형태학적 단계의 회전 순서를 나타낸다는 것을 보여줍니다.

Transwell Boyton Chamber와 같은 기존 질량에 비해 이 기술의 주요 장점은 마이크로 장치를 통해 이동 과정, 제어된 세포 배치 및 인자의 정확한 전달을 육안으로 검사할 수 있다는 것입니다. 따라서 마이크로 포릭 기술은 신뢰할 수 있고 효율적이며 비용 효율적인 단일 세포 선택 및 탐색 기능을 가지고 있습니다. 이 기술의 의미는 암 전이 및 재발 치료로 확장되는데, 이는 고도의 이동성 세포에 대한 단일 세포 분석을 통해 잠재적인 미래 화학 요법 표적을 식별할 수 있기 때문입니다.

이 방법은 암 시스템의 이동 행동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 배아 발달, 면역 반응, 상처 치유 및 장기 재생과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. BTSC 유래 신경 창의 세포 현탁액으로 시작하여. 15ml 원뿔형 튜브에 세포를 모으고 900RPM에서 5분 동안 원심분리하지만 더 빠르지는 않습니다.

슈퍼 나틴을 흡입하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 5-10분 동안 0.5ml의 예열 아큐탄(Prewarm Accutane)에 배양하여 신경구를 느슨하게 합니다. 배양 후 P 100 피펫을 10-20회 부드럽게 스트로크하여 세포를 기계적으로 파괴합니다.

그런 다음 1.5ml의 줄기세포 배지를 첨가하여 Accutane 원심분리기를 중화하고 1300RPM에서 5분 동안 세포 현탁액을 1ml의 줄기세포 배지에 세포를 재현탁합니다. hemo cytometer를 가진 세포 조밀도를 검사하고 20에, 마이크로리터 당 000의 세포에 조밀도를 조정하십시오. SU eight 마스터 제작을 시작하기 위해 Adobe Illustrator와 Image Setter가 통합된 레이저 인쇄 투명 필름을 사용하여 두 개의 포토 마스크를 준비하십시오.

제 1 레이어 포토 마스크는 2 개의 기준 마커와 마이크로 채널의 어레이로 구성되고, 포토 마스크의 두 번째 레이어는 좌석 및 수용 챔버를 갖는다. 이소프로판올로 두 마스크 층을 모두 청소하고 자연 건조시킵니다. 이제 3 미크론 두께의 SU 8 포토 레지스트가있는 핸들 웨이퍼를 스핀 코팅한 다음 소프트 베이킹을 수행합니다.

그런 다음 첫 번째 레이어 포토 마스크가 UV에 밀접하게 접촉한 상태에서 사진을 노출시키고 저항하고 치료하도록 합니다. 그런 다음 포스트 베이크를 하고 경화된 웨이퍼를 현상합니다. 핸들 웨이퍼의 기준 마커 영역을 스카치 테이프로 덮습니다.

그런 다음 250미크론 두께의 포토 레지스트로 웨이퍼를 스핀 코팅합니다. 그런 다음 테이프를 떼어내면 정렬을 위한 마커가 나타납니다. 포토 레지스트의 두 번째 레이어를 놓고 기준 마커를 정렬합니다.

그런 다음 UV는 두 번째 레이어 포토 마스크를 노출시키고 치료한 다음 포스트 베이킹 및 현상을 수행합니다. 이제 표면 점착성을 줄이기 위해 증기 증착을 통해 SU eight 마스터를 ize합니다. 웨이퍼를 최소 1시간 동안 진공 상태에서 Tri Chloro cline 용액 몇 방울과 함께 건조제에 넣습니다.

그러면 마스터는 마스터로 PDMS를 성형하는 데 사용할 준비가 됩니다. 프리 폴리머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 철저히 혼합하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 기포가 보이지 않을 때까지 진공 탈기를 위해 혼합물을 건조제에 넣습니다.

혼합물을 마스크에 붓고 다시 가스를 제거하십시오. 새로운 기포가 유입되면 섭씨 90도에서 2시간 동안 레벨 핫 플레이트에서 금형을 경화시킵니다. 실온으로 냉각된 후 PDMS 스탬프를 부드럽게 해제합니다.

따라서 배양 채널은 PDMS에 새겨져 미세유체 장치의 조립이 준비됩니다. 마스터는 금이 가거나 마모될 때까지 성형에 재사용할 수 있습니다. 마스터가 끈적거리면 안티 스틱 코팅을 다시 적용할 수 있습니다.

PDMS 스탬프를 통해 미세유체 장치에 있는 인레트 그리고 출구를 만드는 것으로 시작하십시오. 생검 구멍 구멍을 사용하여 PDMS 스탬프를 70% 에탄올에 30분 동안 담근 다음 탈이온수로 10분 동안 헹궈서 청소합니다. 오토클레이브를 통해 PDMS 스탬프의 가교 반응을 멸균하고 완료합니다.

이제 폴리 L 라이신으로 코팅된 유리 커버 슬립에 PDMS 스탬프를 놓습니다. 그런 다음 장치는 저장소 입구를 통해 라미네이트 용액으로 챔버를 채워 라미네이트로 코팅하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 장치에서 라미네이트를 흡인하십시오.

그런 다음 줄기 세포 배지를 두 번 주입하여 장치를 세척합니다. 이제 해리된 세포 11마이크로리터를 시딩 저장소 중 하나에 로드합니다.필요한 경우 진공 흡인을 사용하여 세포를 챔버에 강제로 넣습니다. 그런 다음 추가로 7마이크로리터의 셀을 인접한 좌석 저장소에 로드합니다.

5분 후, 좌석과 수용실이 미디어로 가득 찰 것입니다. 이제 0.5-1mm 두께의 멸균 PDMS 시트를 장치에 놓습니다. PDMS의 자연적인 표면 접착력은 일단 밀봉되면 장치를 밀봉하고 운송, 배양 및 현미경 이미징 준비가 됩니다.

45분 동안 실행하여 biot, IM을 사전 평형화합니다. 온도, 수분 및 공기 공급을 안정화하려면 샘플 챔버에 여러 접시의 물을 추가하여 적절한 습도를 얻습니다. 준비된 장치를 현미경의 샘플 챔버에 로드합니다.

마이크로 핀셋을 사용하여 장치를 중앙에 놓습니다. 이제 Biot 소프트웨어를 사용하여 초점 지점과 시간 지점을 설정하고 필요한 경우 타임랩스 기록을 시작합니다. 배양에서 5일 후 배양 배지를 교체하십시오.

장치에 시드된 BTC는 위상 이미지로 지속적으로 기록되었습니다. 착석실에서 5일 동안 방추형 세포는 이동 전 단계에 머물렀습니다. 그들이 마이크로채널 입구에 접근함에 따라, 몇 개의 세포가 팽창하여 접착 돌출부를 생성했다.

오직 하나의 세포만이 입구를 차지하고 이동 방향을 탐색할 수 있었다. 일단 세포가 이동 방향을 결정하면, 세포는 꾸준한 고속으로 전체 마이크로채널을 순항하기 시작했습니다. 마이크로채널이 끝날 때쯤, 세포는 최종적으로 수용실에 들어가기 전에 수용실의 열린 공간을 탐색

2초의 이미징 간격으로 세포를 관찰함으로써 이동 동력은 대부분 OID 세포와 유사한 블래핑 활동에 의해 생성되는 것으로 나타났습니다. 절차를 시도하는 동안, 소자의 설계가 매우 유연하여 원하는 수준의 세포 이동을 달성하기 위해 마이크로채널 치수를 조작할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 세포를 배양하는 데 적합한 고유한 구획화 미세유체 장치를 만드는 방법을 잘 이해한 다음 장기 타임 랩스 이미징을 수행하여 이러한 세포의 이동 특성을 정성적 및 정량적으로 정의합니다. 이 절차를 따릅니다.

다음 세대 연속하는 DNA microarray 같이 다른 방법은 높게 이동하는 암세포가 유전적으로 얼마나 다른지와 같은 추가 질문에 응답하기 위하여 적용될 수 있습니다.