Name: V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 배우세요 HIV V3 영역 시퀀싱을 통한 바이러스 트로피즘 유전형 추론 방법입니다. 중첩 RT-PCR과 바이오인포매틱스를 활용하여 R5 또는 비R5 바이러스를 분류하고, 임상 환경에서 신속하고 경제적인 진단 도구로 활용할 수 있습니다.

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이 분석의 개발은 바이브 의료 및 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에서 박사 해리건에 대한 임상 바이러스학의 GlaxoSmithKline / CIHR 의자 통해 지원되었다. 화이자와 바이브 건강에서 제공하는 지원.

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

P. 리차드 해리건은 바이브 의료, Virco, 머크, 애보트, 그리고 퀘스트와 관심의 충돌을했다. 이 동영상 문서는 바이브 의료 후원됩니다.

여기서 제시하는 방법은 tropism 테스트에 적용되는 표준 시퀀싱 방식입니다. 늦은 시간까지 제한하고 바이러스 tropism을 예측하는 순서 HIV 봉투 V3 루프의 임상 응용 프로그램이 있습니다. 이 방법은 최소한 임상 사용하는 다른 검증 assays에 비해 바이러스 tropism을 예측하는 동등 수 있도록, maraviroc (바이브 의료) 임상 시험의 회고 분석에 표시하고 있습니다. tropism 예측에 대한 V3 루프의 genotypic 분석을 수행하기 위해 많은 혜택이 있습니다. 첫번째로 제일 중요 한건,이 절차는 크게 접근을 증가하고 tropism 테스트의 처리 시간을 줄여, 운영 시퀀싱 장비와 모든 시설에서 수행할 수 있습니다. 비교에서, tropism 테스트를위한 황금 표준으로 재직했습니다 phenotypic 향상된 감도 Trofile 분석 (ESTA) (모노그램 Biosciences)는, 남부 캘리포니아에서 한 센터에서 수행됩니다. 추가 혜택이 적은 시작 물질 500copies/mL 최소 요구 플라즈마 바이러스 부하의 요구 사항을 포함합니다. 뿐만 아니라, genotypic 분석을 실행하는 운영 비용은 phenotypic 분석 분들에 비해 상대적으로 낮은 수 있습니다. 특히 리콜 소프트웨어의 사용은 유전자형 분석의 노동 집약적인 부분이 될 경향이 수동으로 순서대로 검토에 대한 요구 사항을 제거합니다. 여기서 제시하는 방법은 중요성에 또 다른 outweighing 특별한 단계로, 매우 간단합니다. 우리는 샘플의 바이러스 인구 내에서 캡처 소수 종족의 확률을 높일 세중의에 PCR 및 시퀀싱을 실행해야합니까. 세 이상의 복제 큰 수행할 수 있으며, 그러나 우리가 찾은이 효과적이고 신뢰할 수있는 모두 수 triplicates. 또한 고감도와 특이성을 유지하면서 같은 반응 RT - PCR과 PCR 첫 라운드를 모두 수행 한 단계 거꾸로 Transcriptase PCR 키트 (Qiagen)를 사용하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;NucliSens easyMAG version 1.0를 이용한 RNA 추출&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Magnetic Silica</td><td>bioMerieux</td><td>카탈로그 번호 280133</td><td>(48 x 0.6 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 용해 완충액</td><td>bioMerieux</td><td>카탈로그 번호 280134</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 추출 버퍼 1</td><td>bioMerieux</td><td>카탈로그 번호 280130</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 추출 버퍼 2</td><td>bioMerieux</td><td>카탈로그 번호 280131</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 추출 버퍼 3</td><td>bioMerieux</td><td>카탈로그 번호 280132</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG version 1.0 </td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2등급 A2 생물안전작업대</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1단계 역전사 PCR 및 2차 PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리수</td><td>Ambion</td><td>카탈로그 번호 9922</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq High Fidelity가 포함된 SuperScrip III One-Step RT-PCR System</td><td>Invitrogen</td><td>cat#12574-035</td><td>사용된 키트 구성품:&lt;br/&gt;- SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelity Enzyme Mix&lt;br/&gt;- 2X 반응 믹스 (각 dNTP 0.4mM 및 2.4mM MgSO4가 포함된 완충액)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR 시스템</td><td>로슈 그룹</td><td>카탈로그 번호 1 759 078</td><td>사용된 키트 구성품:
- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. (15 mM MgCl2 함유, 뚜껑에 2번 표시)
- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/&amp;#x03BC;l)- MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 스톡 용액 (25mM) (뚜껑에 4로 표시됨)</td></tr><tr><td>dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td><td>Roche 그룹</td><td>카탈로그 번호 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>수크로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>카탈로그 번호 S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루 나트륨염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>카탈로그 번호 B5525</td><td></td></tr><tr><td>크레졸 레드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>카탈로그 번호 114472-5G</td><td>지표 등급</td></tr><tr><td>열순환기 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;젤 전기영동&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50X TAE 완충액</td><td>Invitrogen</td><td>카탈로그 번호 24710030</td><td>(1000 ml) </td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 젤 염색약</td><td>Invitrogen</td><td>카탈로그 번호 S33102</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 (초고순도)</td><td>Invitrogen</td><td>카탈로그 번호 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel 저범위 정량 DNA 래더</td><td>Invitrogen</td><td>카탈로그 번호 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>시약 등급 Type II 초순수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>겔 전기영동 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;서열 분석&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit</td><td>응용생명과학</td><td>카탈로그 번호 4337458</td><td>(25,000회 반응)</td></tr><tr><td>Hi-Di 포름아미드</td><td>응용 생명과학</td><td>카탈로그 번호 4311320</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>카탈로그 번호 S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>카탈로그 번호 03690-100ML</td><td>0.5M, pH=8.0</td></tr><tr><td>TRIZMA 염산염 완충액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>카탈로그 번호 T-2819</td><td>1 M, pH 9.0</td></tr><tr><td>염화마그네슘 (MgCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>카탈로그 번호 M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA 함유 러닝 버퍼 (10X)</td><td>Applied Biosystems</td><td>카탈로그 번호 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Polymer Pop-7 (25mL) 또는 Polymer Pop-7 (10mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>카탈로그 번호 44363929 또는 카탈로그 번호 4352759</td><td></td></tr><tr><td>3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit</td><td>응용 생명과학</td><td>카탈로그 번호 4336943</td><td></td></tr><tr><td>열순환기 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 홀더가 포함된 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3730xl DNA 분석기</td><td>응용생명과학</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

v3의 hiv - 1 tropism의 genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

배경 : 이전 HIV 치료에 CCR5 - 길항제 클래스에서 마약을받을하기 위해 환자 자신의 바이러스성 인구가 대안 coreceptor를 휴대 전화 항목에 대한 CCR5 coreceptor을 사용하지 않는 것 확인하는 HIV의 tropism 테스트를 받아야합니다. tropism 테스트하는 한 가지 방법은 coreceptor와 상호 작용하는 HIV 봉투의 V3 지역의 순서를 검사하는 것입니다. 방법 : 바이러스성 RNA는 혈장에서 추출한 것입니다. V3 지역은 중첩된 리버스 transcriptase - PCR로 증폭 세중의에있다. amplifications 그런 다음 합성 및 소프트웨어, RE_Call를 사용하여 분석하고 있습니다. 시퀀스는 다음 V3 지역에서 바이러스 tropism을 추론하기 위해 geno2pheno 같은 bioinformatic 알고리즘에 제출합니다. 시퀀스들은 geno2pheno 거짓 긍정적인 속도 아래 5.75 %를 일인 경우는 비 R5으로 유추됩니다. 샘플에서 세 시퀀스 중 하나가 아닌 R5로 유추하는 경우, 환자는 CCR5 - 길항제에 응답하지 않을 수 있습니다.

HIV tropism는 바이러스 봉투의 V3 지역에서 유추하실 수 있습니다. V3는 PCR은 RT - PCR 중첩, 합성을 사용하여 세중의에 증폭하고, bioinformatic 소프트웨어를 사용하여 해석됩니다. 낮은 g2P 점수 1 개 이상의 시퀀스 (S)와 함께 샘플이 아닌 R5 바이러스로 분류됩니다.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

배경: HIV 치료에서 CCR5 길항제 계열의 약물을 투여받기 전, 환자는 ...임을 확인하기 위해 HIV 친화성 검사를 받아야 합니다.

이 프로시저의 전반적인 목표는 환자의 혈장으로부터 HIV RNA를 추출하고, 바이러스 외피 유전자의 V3 영역을 시퀀싱하여 HIV 감염 환자의 바이러스 친화성(tropism)을 추론하는 것입니다. 먼저, nested RT-PCR을 사용하여 HIV gp120의 V3 영역을 증폭합니다. 그 다음, 젤 전기영동을 통해 생성물의 존재를 확인하고, 증폭된 V3 생성물에 대해 집단 기반 시퀀싱(population-based sequencing)을 수행합니다.마지막으로 베이스 콜링 소프트웨어를 사용하여 서열을 분석하고, genome to pheno 알고리즘을 사용하여 공동 수용체 사용 여부를 추론합니다. 궁극적으로, 이러한 결과는 HIV-1 V3 루프의 집단 기반 서열 분석을 통해 환자의 바이러스 트로피즘이 R5인지 또는 non-R5인지 보여줄 수 있습니다. 따라서 표현형 세포 기반 분석과 같은 기존 방법 대비 이 트로피즘 분석 기술의 주요 장점은, 서열 분석 장비를 갖춘 모든 실험실에서 더 적은 양의 시작 물질로 비용을 절감하며 더 짧은 시간 내에 수행할 수 있다는 점입니다.이 기술은 500 µL의 혈장으로부터 환자의 바이러스 집단이 CCR5 길항제에 반응할 가능성이 있는지 식별할 수 있으므로 항레트로바이러스 요법 치료와 관련이 있습니다. EasyMag 자동 추출기를 사용하여 HIV RNA를 추출하십시오. 이제 바이러스 집단의 적절한 샘플링을 보장하기 위해 RT-PCR을 설정하기 위한 PCR 클린룸으로 이동하십시오.이 원스텝 반응에서 각 역전사 반응을 3회 반복 수행하도록 계획하십시오. 바이러스 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하며, 특히 SQV three F1 및 CO 6 0 2 prime repair를 사용하여 HIVV three 영역을 증폭합니다. 반응당 구성 성분을 기준으로 하십시오.리피터 피펫을 사용하여 증폭할 샘플 수에 충분한 양의 스톡 믹스 용액을 제조합니다. PCR 플레이트의 각 웰에 샘플 믹스 36 µL를 추가합니다. 이제 멀티 채널 피펫으로 전환하여 지정된 각 웰에 RNA 샘플 추출액 수 µL를 분주합니다. 각 분주 단계마다 팁을 교체하도록 주의하십시오.전송이 완료되면 PCR 스트립 캡으로 웰을 덮습니다. 그런 다음 HIVV three region의 원스텝 R-T-P-C-R이 프로그램된 써모사이클러에 PCR 플레이트를 넣습니다. 네스티드 PCR의 경우, SQV three F two 및 CD four R 프라이머 쌍을 사용하십시오.PCR 클린룸에서 증폭할 샘플 수에 필요한 시약의 양을 계산하십시오. 네스티드 PCR 믹스를 제조한 후, 리피터 피펫을 사용하여 깨끗한 PCR 플레이트의 웰당 19 µL씩 분주하십시오. R-T-P-C-R이 완료되면 증폭 후 작업실로 이동하십시오.8채널 멀티채널 피펫을 사용하여 R-T-P-C-R 템플릿 1 µL를 nested PCR 믹스에 분주합니다. 매 분주 시 팁을 교체하십시오. PCR 스트립 캡으로 웰을 닫고 플레이트를 써모사이클러(thermocycler)로 옮겨 증폭을 수행합니다.온도가 25°C로 돌아오면 써모사이클러에서 플레이트를 꺼냅니다. V3 영역이 성공적으로 증폭되었는지 확인하기 위해, 먼저 젤 전기영동으로 생성물을 분석합니다. CyberSafe 젤 염색약이 포함된 1.6% agarose 젤을 준비합니다.10 µL 멀티채널 피펫을 사용하여, 8 µL의 PCR 샘플을 각각의 웰에 분주합니다. 또한 각 행당 최소 하나의 웰에 DNA ladder를 로딩합니다.젤을 약 100V에서 10분 동안 전기영동합니다. 자외선 형광을 통해 밴드를 시각화하고, 사진을 찍어 이미지를 기록합니다. 3회 반복 증폭이 모두 성공한 샘플을 기록하십시오.필요한 경우, 증폭 산물이 3개 미만인 샘플에 대해 R-T-P-C-R을 반복하십시오. 증폭된 바이러스 cDNA 샘플은 V 3 0 2 F 및 S QV three R one 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱 반응을 통해 추가로 검증합니다. big di 시약을 냉동고에서 꺼내 실온에서 해동하십시오.분석할 샘플 수에 필요한 시약을 계산하고 준비합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 시퀀싱 반응 믹스 5 µL를 해당 플레이트 웰에 분주합니다. 플레이트를 킴와이프로 덮고 그대로 둡니다.그동안, 남은 PCR 산물에 멸균수 180 µL를 첨가하여 PCR 산물을 1:15로 희석합니다. 희석된 샘플 1 µL를 해당 플레이트의 바닥에 피펫으로 분주합니다. 샘플 옮기기가 완료되면 항상 팁을 교체하여 다음 웰에 분주하십시오.스트립 캡으로 플레이트를 밀봉하고 1초간 볼텍싱합니다. 플레이트를 원심분리하려면 속도를 140 5G로 설정하십시오. 회전 속도가 140 5G에 도달하면 회전을 중단합니다.반응을 진행하기 위해 플레이트를 써모사이클러(thermocycler)에 넣습니다. 각 웰에 3 M sodium acetate 4 µL와 냉각된 95% Ethanol 40 µL를 넣어 DNA를 침전시킨 후, 캡을 다시 닫습니다. 플레이트를 10초 동안 볼텍싱(vortexing)하고, 플레이트를 톡톡 두드려 기포를 제거합니다.플레이트를 -20 °C에서 30분에서 2시간 동안 보관합니다. 2000 G에서 20분 동안 원심분리하여 DNA를 회수합니다. 스트립 캡을 제거하여 폐기합니다.플레이트를 폐기물 용기 위로 뒤집어 상층액을 따라냅니다. 뒤집은 플레이트를 종이 타월로 눌러 남은 상층액을 완전히 제거합니다.플레이트를 감쌀 수 있도록 종이 타월 두 장을 접습니다. 플레이트를 원심분리기에 뒤집어 넣고 140 5G에서 회전시킵니다. 140 5G에 도달하면 회전을 멈춥니다.그 다음 95% ethanol 155 µL로 세척하고 상층액을 따라냅니다. 이어서 원심분리를 반복합니다. 잔류 ethanol이 모두 증발할 수 있도록 플레이트를 2~5분 동안 그대로 둡니다.DNA 샘플을 변성시키기 위해, 멀티채널 파이펫을 사용하여 플레이트의 빈 웰을 포함한 모든 웰에 maide용 high dye 10 µL를 분주합니다. 플레이트를 septima로 밀봉한 후, 서모사이클러에 넣고 90 °C에서 2분간 처리합니다. 마지막으로, 샘플 플레이트를 시퀀싱 플레이트에 장착하여 시퀀서에 넣습니다.데이터 분석의 한 가지 허용 가능한 방법은 소프트웨어인 recall을 사용하여 사람의 개입 없이 자동 베이스 콜링(base calling)을 수행하는 것입니다. Recall은 무료 맞춤형 베이스 콜링 소프트웨어로, 로그인 후 browse 옵션을 사용하여 업로드할 샘플 파일을 선택합니다. 가공되지 않은 시퀀싱 데이터 파일을 찾아 최대 20 megabytes까지 업로드하십시오.다음으로, 참조 서열을 V three로 설정하십시오. 데이터 처리(process data)를 클릭합니다. 페이지 우측에서 결과 폴더를 선택하여 샘플 목록을 표시합니다.빨간색으로 표시된 샘플은 실패한 것이며, 초록색으로 표시된 샘플은 통과한 것입니다. 특정 샘플을 클릭하고 보기 버튼을 누르면 시퀀스를 검토할 수 있으며, 페이지 우측의 안내에 따라 시퀀스를 탐색하고 파일을 zip 폴더로 다운로드할 수 있습니다.바이러스 친화성(Viral tropism)은 geno to pheno 공동 수용체 알고리즘을 이용한 집단 기반 시퀀싱 생성 서열로부터 추론할 수 있습니다. significant 설정의 드롭다운 메뉴에서 motivate 2% 및 5.75% FPR의 임상 데이터 분석을 기반으로 최적화된(optimized) 옵션을 선택하십시오. 이제 분석을 위해 서열을 업로드하거나 붙여넣으십시오.FASTA 파일 형식을 사용할 수 있습니다. CCR5 길항제에 대한 반응성을 예측하는 geno Tono FPRA 예측 결과를 얻기 위해 다른 내용을 추가하지 마십시오. 생성된 G two P 보고서는 아미노산 형태의 V three 루프 서열을 제공하며, 비 R five 사용 바이러스와 관련된 돌연변이의 관련 위치를 나타냅니다.보고서 하단에는 위양성률이 제공되며, 이는 CCR five 길항제에 대한 반응 관점에서 해석됩니다. 이 보고서는 PDF 파일로 다운로드할 수 있습니다. 시료에서 얻은 세 가지 서열 중 어느 하나라도 non R five로 추론되면, 환자가 CCR five 길항제에 예상대로 반응할 가능성은 낮습니다. HIV one V three 루프의 RTP CR 증폭 결과에 대한 젤 전기영동 결과, 모든 임상 시료에서 산물이 생성되는 것은 아님이 나타납니다.증폭된 샘플에서 생성된 서열은 recall로 읽은 크로마토그램에서 시각화할 수 있습니다. 혼합물이 거의 없는 깨끗한 서열이 나타나야 합니다. 때로는 서열이 불분명하여 정확한 염기 지정이 어려울 수 있습니다.여기에서 보여주는 것과 같이, 일부 환자는 non CCR five 사용 바이러스를 보유한 것으로 확인될 수 있습니다. 이러한 환자들은 CCR five 길항제 치료에 반응할 가능성이 낮습니다. 하지만, G two P 분석 보고서 하단의 녹색 상자로 표시된 바와 같이, 대다수의 환자는 CCR five 사용 바이러스로 구성된 바이러스 군집을 보유하고 있는 것으로 나타납니다.따라서 이 기술을 숙달하고 나면, 추출부터 분석까지 시작부터 끝까지 약 4일 정도면 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 genome pheno 생물정보학 알고리즘과 함께 집단 기반 시퀀싱 방법을 사용하여 바이러스의 친화성을 예측하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다.

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

HIV-1 발병기전은 바이러스 특성과 숙주 유전적 요인에 의해 정의됩니다. 여기에서는 gag 유전자 염기서열 변이가 바이러스의 체외 복제 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 재현 가능한 측정을 할 수 있는 강력한 방법을 설명합니다.

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

거의 동종발생 바이러스 간의 성장 경쟁은 상대적 복제 적합성을 결정하기 위한 민감한 측정을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 재조합 HIV-1 클론의 구축, 바이러스 전파 및 성장 경쟁, 민감하고 일관된 결과를 산출하도록 최적화된 분석 방법이 포함됩니다.

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

배우세요 HIV V3 영역 시퀀싱을 통한 바이러스 트로피즘 유전형 추론 방법입니다. 중첩 RT-PCR과 바이오인포매틱스를 활용하여 R5 또는 비R5 바이러스를 분류하고, 임상 환경에서 신속하고 경제적인 진단 도구로 활용할 수 있습니다.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

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