V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

이 절차의 전반적인 목표는 바이러스 외피 유전자의 V 3 영역을 시퀀싱하여 환자의 혈장에서 H-I-V-R-N-A를 추출하기 시작함으로써 HIV 감염 환자의 바이러스 영양성을 추론하는 것입니다. 다음으로, 중첩된 R-T-P-C-R을 사용하여 HIV GP one 20의 V three 영역을 증폭합니다. 그런 다음 겔 전기영동을 사용하여 제품의 존재를 확인한 다음 증폭된 V 3개 제품의 인구 기반 염기서열분석을 수행합니다.

마지막으로, 염기 호출 소프트웨어를 사용하여 염기서열을 분석하고 게놈 대 표현 알고리즘을 사용하여 공동 수용체 사용을 추론합니다. 궁극적으로 이러한 결과는 HIVV 3 루프의 인구 기반 염기서열 분석을 통해 환자의 바이러스 군이 R 5인지 비 R 5인지를 보여줄 수 있습니다. 따라서 이 기술의 주요 장점은 표현형 세포 기반 분석과 같은 기존 방법에 비해 병력 분석이라는 점이며, 염기서열분석 장치가 장착된 모든 실험실에서 수행할 수 있어 더 적은 시작 물질로 더 짧은 시간에 비용을 절감할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 환자의 바이러스 집단이 500마이크로리터의 혈장에서 CCR 5 길항제에 반응할 가능성이 있는지 여부를 확인할 수 있기 때문에 항레트로바이러스 요법 치료와 관련이 있습니다. 간편한 매그 자동 추출기를 사용하여 H-I-V-R-N-A를 추출합니다. 이제 바이러스 집단의 적절한 샘플링을 보장하기 위해 R-T-P-C-R을 설정하기 위해 A PCR 클린룸으로 이동합니다.

이 1단계 반응에서 각 역전사 반응을 3회씩 수행할 계획을 세웁니다. 바이러스 RNA를 사용하여 CDNA를 합성하고, 특히 SQV 3 F1 및 CO 6 0 2 프라임 복구로 HIVV 3 영역을 증폭합니다. 반응별 성분을 기준으로 합니다.

리피터 피펫을 사용하여 증폭할 샘플 수에 충분한 스톡 믹스 용액을 만듭니다.PCR 플레이트의 각 웰에 36마이크로리터의 샘플 믹스를 추가합니다. 이제 멀티채널 피펫으로 전환하여 마이크로리터의 RNA 샘플 추출물을 지정된 각 웰로 변환합니다. 추가할 때마다 팁을 변경할 때 주의하세요.

이송이 완료되면 PCR 스트립 캡으로 웰을 덮습니다. 다음 HIVV 3 지구의 1개 단계 R-T-P-C-R를 위해 프로그램된 thermocycler에 있는 PCR 판을 두십시오. 중첩된 PCR의 경우 SQV 3 F 2 및 CD 4 R 프라이머 수리를 사용합니다.

PCR 클린룸에서 증폭할 샘플 수에 필요한 시약의 양을 계산합니다. 중첩된 PCR 혼합물을 생성한 다음 리피터 피펫을 사용하여 깨끗한 PCR 플레이트의 웰당 19마이크로리터를 분취합니다. R-T-P-C-R이 완료되면 사후 증폭실로 이동합니다.

8채널 멀티채널 피펫을 사용하여 1마이크로리터의 R-T-P-C-R 템플릿을 중첩된 PCR 혼합물로 옮깁니다. 각 추가 사이에 팁을 변경합니다. 웰을 PCR 스트립 캡으로 덮고 증폭을 위해 플레이트를 열순환기로 옮깁니다.

온도가 섭씨 25도로 돌아온 후 열순환기에서 플레이트를 제거합니다. V 3 지구가 성공적으로 증폭되었다는 것을 확인하기 위하여는, 첫째로 젤 전기 이동법으로 제품을 분석하십시오. 사이버 안전 젤 얼룩이 있는 1.6% AROS 젤을 준비합니다.

10 마이크로 리터 멀티 채널 피펫 사용. 8개의 마이크로리터 PCR 샘플을 각 웰로 옮깁니다. 또한 한 줄에 하나 이상의 웰에 DNA ladder를 로드합니다.

젤을 약 100볼트에서 10분 동안 실행합니다. 자외선 형광으로 띠를 시각화하고 사진으로 이미지를 문서화합니다. 모든 삼중 증폭이 성공적으로 수행된 샘플을 기록해 둡니다.

필요한 경우 제품 증폭이 3개 미만인 샘플에 대해 R-T-P-C-R을 반복합니다. 증폭된 바이러스 CDNA 샘플은 DNA 염기서열분석에 의해 추가로 검증되며, V3,0,2,F 및 S, QV, 3,R,1, 프라이머를 사용하여 반응을 수행할 것이다. 냉동실에서 큰 디 시약을 꺼내 실온에서 해동합니다.

실행할 샘플 수에 필요한 시약을 계산하고 준비합니다. 5마이크로리터의 염기서열분석 반응 혼합물을 다중 채널 피펫을 사용하여 적절한 플레이트 웰에 분취합니다. 접시를 Kim 물티슈로 덮고 따로 보관하십시오.

한편, 나머지 PCR 산물에 180 microlite의 멸균수를 첨가하여 증폭된 PCR 산물을 1 내지 15 희석액으로 준비한다. 희석된 시료 1마이크로리터를 적절한 플레이트의 바닥에 피펫팅합니다. 웰은 샘플 이송이 완료되면 항상 샘플 간 팁을 교체합니다.

스트립 캡과 와류로 플레이트를 1초 동안 밀봉합니다. 플레이트를 원심분리하려면 속도를 140 5G로 설정하십시오. 탈수 속도가 140 5G에 도달하면 탈수를 멈춥니다.

반응이 진행될 수 있도록 플레이트를 열순환기에 넣습니다. 각 웰에서 4 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨과 40 마이크로 리터의 냉각 95 % 에탄올로 DNA를 침전시키고 캡을 다시 밀봉합니다. 10초 동안 플레이트에 피질을 하고 플레이트를 두드려 기포를 제거합니다.

접시를 섭씨 영하 20도에서 30분에서 2시간 동안 놓습니다. 2000G에서 20분 동안 원심분리하여 DNA를 회수합니다. 스트립 캡을 제거하고 폐기합니다.

접시를 쓰레기통 위에 뒤집고 슈퍼 나틴을 디캔팅합니다. 남아 있는 슈퍼 나틴을 제거하십시오. 거꾸로 된 접시를 종이 타월에 묻혀서.

종이 타월 두 장을 접어 접시를 끼웁니다. 플레이트를 원심분리기에 뒤집어 놓고 140 5G로 회전합니다. 140 5G에 도달하면 스핀을 멈춥니다.

그런 다음 155 마이크로 리터의 95 % 에탄올과 디캔트로 세척하십시오. 그런 다음 원심분리를 반복합니다. 마지막 에탄올이 증발할 수 있도록 접시를 2-5분 동안 그대로 두십시오.

DNA 샘플을 변성시키기 위해 멀티 채널 피펫을 사용하여 비어있는 웰을 포함하여 플레이트의 모든 웰에 maide용 고 염료 10마이크로리터를 분배합니다. 접시를 셉티마로 밀봉하고 섭씨 90도의 열순환기에 2분 동안 넣습니다. 마지막으로 샘플 플레이트를 염기서열분석 플레이트와 시퀀서에 넣습니다.

데이터 분석을 위한 한 가지 허용 가능한 경로는 소프트웨어 리콜을 사용하여 사람의 개입 없이 자동 기본 호출을 수행하는 것입니다. Recall은 무료 사용자 지정 기반 통화 소프트웨어로, 로그인하고 찾아보기 옵션으로 업로드할 샘플 파일을 선택합니다. 원시 염기서열분석 데이터 파일을 찾아 최대 20MB까지 업로드합니다.

다음으로, 참조 시퀀스를 V 3으로 설정합니다. 데이터 처리를 클릭합니다. 페이지 오른쪽에 있는 결과 폴더를 선택하여 샘플 목록을 표시합니다.

빨간색은 실패한 것입니다. 녹색인 것들은 지나갔습니다. 특정 샘플과 보기 버튼을 클릭하면 염기서열을 검토하고, 페이지 오른쪽의 지침에 따라 염기서열을 탐색하고, 파일을 zip 폴더로 다운로드할 수 있습니다.

바이러스 영양성은 geno to pheno co-receptor 알고리즘을 사용하여 집단 기반 염기서열분석에 의해 생성된 염기서열에서 추론할 수 있습니다. 중요한 설정의 드롭다운 메뉴에서 Motivate 2% 및 5.75%FPR의 임상 데이터 분석을 기반으로 최적화를 선택합니다. 이제 분석을 위해 염기서열을 업로드하거나 붙여넣도록 선택합니다.

FASTA 파일을 사용할 수 있습니다. CCR 5 길항제에 대한 반응성의 geno Tono FPRA 예측자를 얻기 위해 다른 절차를 추가하지 마십시오. 생성된 G two P 보고서는 아미노산에서 V three loop sequence를 제공하고 바이러스를 사용하여 non R five와 관련된 돌연변이에서 관련 위치를 나타냅니다.

보고서 하단에는 거짓 긍정 비율이 제공되고 CCR 5 길항제에 대한 반응 측면에서 해석됩니다. 이 보고서는 PDF 파일로 다운로드할 수 있습니다. 샘플로부터의 3개의 염기서열 중 어느 하나가 R-five가 아닌 것으로 추론되는 경우, 환자는 예상대로 CCR 5 길항제에 반응할 가능성이 없습니다.HIV 1 V 3 루프의 RTP CR의 겔 전기영동은 모든 임상 샘플이 생성물을 생산하지 않음을 나타냅니다.

증폭된 샘플에서 생성된 염기서열은 리콜(recall)에 의해 판독된 크로마토그램으로 시각화할 수 있습니다. 혼합물이 거의 없는 깨끗한 시퀀스가 예상됩니다. 경우에 따라 시퀀스가 지저분하고 정확한 기본 할당을 수행할 수 없을 수 있습니다.

일부 환자는 다음과 같이 바이러스를 사용하여 비 CCR 5를 가진 것으로 확인될 수 있습니다. 이러한 환자는 CCR 5 길항제 치료에 반응할 가능성이 없습니다. 그러나 대부분의 환자는 G two P 분석 보고서 하단의 녹색 상자로 표시된 것처럼 바이러스를 사용하는 CCR 5로 구성된 바이러스 집단을 가지고 있는 것으로 나타났습니다.

따라서 일단 숙달되면 이 기술은 처음부터 끝까지 약 4일 만에 수행할 수 있습니다. 추출에서 분석까지 가능합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 게놈 표현 생물정보학 알고리즘과 함께 집단 기반 염기서열분석 방법을 사용하여 바이러스 영양성을 예측하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

좋습니다. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.