사용자 정의 MicroRNA의 Microarray 실험을 수행

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로 RNA 마이크로어레이 실험을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 마이크로 RNA 프로브 라이브러리가 포함된 인쇄된 마이크로어레이 슬라이드를 획득하고 적절한 품질과 수량의 RNA 샘플을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, RNA 및 A 제어 DNA 샘플은 형광 염료로 표지됩니다.

그런 다음 표지된 핵산을 혼성화를 위해 마이크로어레이 슬라이드에 추가합니다. 마지막으로, 마이크로어레이 슬라이드를 세척하고 스캔하고 슬라이드를 재생합니다. 궁극적으로, 개별 마이크로 RNA 프로브의 혼성화 강도에 대한 슬라이드 분석을 통해 microRNA의 게놈 전체 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 정상적인 생리학적 조건 또는 병리학적 조건의 차이가 전 세계적인 규모에서 미시적 요구의 발현에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 유전자 발현 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마이크로어레이 제조의 품질은 마이크로어레이 실험의 성공을 위한 가장 중요한 요소 중 하나입니다. 작은 RNA를 보존하고 밀리리터당 2밀리그램 이상의 농도로 현탁시키는 방법을 사용하여 RNA를 분리한 후, 먼저 약 25마이크로그램의 총 RNA와 0.5마이크로그램의 5 프라임 P-C-U-D-Y 5 4 7 3 프라임을 혼합하여 RNA를 20 마이크로리터 반응 부피로 라벨링합니다. 그리고 TP. 사용할 수 있는 RNA가 적으면 RNA와 반응의 양을 줄입니다.

RNA가 매우 희석되면 효모, TRNA와 같은 운반체를 추가하여 침전을 돕고 냉장고 내부의 얼음에서 2 시간에서 24 시간 동안 반응을 배양합니다. 다음으로, 0.3 어금니에 아세트산 나트륨을 첨가 한 다음 3 부피의 에탄올을 첨가하고 섭씨 영하 20도에서 밤새 RNA를 침전시킵니다. 슬라이드를 처음 사용하려면 섭씨 37도에서 30-60분 동안 3개의 XSSC, 0.1%SDS 및 0.2%BSA의 여과된 용액에서 슬라이드를 사전 하이브리드화합니다.

그런 다음 슬라이드를 물에 몇 번 담그십시오. 그런 다음 이소프로판올을 넣고 슬라이드 어댑터가 있는 원심분리기를 사용하여 섭씨 22도에서 5분 동안 100배 G에서 슬라이드를 건조합니다. 리프터 스트립을 물로 헹굽니다.

그런 다음 공기 중에서 건조하기 전에 에탄올에 슬라이드를 마이크로어레이 혼성화 챔버 베이스 내부에 놓고 슬라이드 위에 리프터 슬립을 놓아 리프터 슬립이 프로브 영역과 흰색 스트립을 덮도록 합니다. 어둠 속에서 슬라이드에 접촉하고, 침전된 라벨링된 RNA를 스핀다운하고, 70% 에탄올로 한 번 세척하고 펠릿을 자연 건조합니다. 펠릿은 붉은색을 띠어야 합니다.

RNA 샘플당 정제된 표지된 참조 DNA의 1/15 내지 100 부피를 사용하여 혼성화 용액을 준비하고, 혼성화 용액이 건조되지 않도록 하기 위해 약 60마이크로리터의 혼성화 용액으로 RNA 펠릿을 완전히 용해시킵니다. 부화하는 동안 각 가습 우물에 20마이크로리터의 물을 추가합니다. 마이크로어레이 혼성화 챔버 베이스에서.

라벨링된 RNA와 참조 DNA의 혼합물을 슬라이드에 추가합니다. 얇은 피펫 팁을 사용하여 리프터 슬립의 가장자리를 부드럽게 만지고 흡입을 통과시킵니다. 용액이 리프터 슬립과 슬라이드 사이의 공간으로 들어가도록 합니다.

하이브리드화 챔버 덮개를 베이스 위에 놓습니다. 그런 다음 금속 클립으로 챔버를 밀봉합니다. 챔버 카세트와 함께 제공되는 비닐 봉지 안에 챔버 전체를 넣습니다.

마지막으로 챔버 카세트를 젖은 종이 타월과 함께 용기 안에 넣습니다. 그런 다음 용기를 플라스틱 랩으로 덮고 섭씨 37도의 습한 세포 배양 인큐베이터에 약 24시간 동안 넣습니다. hybridization 후에 활주를 가공하기 위하여는, 약실 카세트를 1개씩 분해하고, 활주를 물에 담그고, 그것의 기중기는 22 섭씨 온도에 2개의 XSSC에서 미끄러집니다.

리프터 슬립은 자연스럽게 슬라이드에서 떨어지고 0.8 XSSC에서 슬라이드를 두 번 세척한 다음 0.4 XSSC에서 총 1-2분 동안 세 번 세척합니다. 슬라이드 어댑터가 있는 원심분리기를 사용하여 슬라이드를 건조시킵니다. 다음으로, 마이크로어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하고 blue fuse와 같은 프로그램을 사용하여 이미지 파일의 강도를 정량화합니다.

개별 스폿을 검사하여 일반적으로 기공 슬라이드 인쇄 또는 하이브리드화 후 슬라이드 취급으로 인해 발생하는 비정상적인 스폿을 제외합니다. 데이터 분석 및 프리젠테이션을 위해 gene springing 및 excel과 같은 프로그램을 사용하여 마이크로어레이를 재사용할 수 있습니다. 슬라이드를 물로 헹군 다음 섭씨 62도에서 10-20분 동안 예열 1밀리몰 NAOH와 0.1 XSSC의 염색 접시에 담가 슬라이드를 벗겨냅니다.

배양을 두 번 반복합니다. 섭씨 60도에서 부드럽게 흔들면서 최대 22분 동안 슬라이드를 물로 여러 번 세척합니다. 원심분리기를 사용하여 슬라이드를 건조시키고 섭씨 22도를 보관하십시오.

슬라이드는 사전 혼성화 없이 사용할 수 있습니다. 이 그림은 매우 정확하고 강력한 혼성화 신호를 보여주는 마이크로어레이의 스캔된 이미지를 보여줍니다. 적색 반점은 DY 5 47 표지된 RNA 샘플에서 참조 DNA 녹색 반점의 혼성화로 인해 발생하며, 노란색 반점은 DNA와 RNA가 동일한 프로브에 대한 혼성화로 인해 발생했습니다.

마이크로어레이 혼성화의 기술적 복제물 간의 Pearson 상관 계수는 약 0.99로 우수한 재현성을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마이크로나제를 정량화하는 것뿐만 아니라 mRNA와 같은 다른 유형의 핵산을 정량화하기 위해 맞춤형 마이크로레이 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.